截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白.pdf

《截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白.pdf（55页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104211782A43申请公布日20141217CN104211782A21申请号201310217863X22申请日20130604C07K14/025200601C07K1/16200601C12N15/37200601C12N15/63200601C12N1/15200601C12N1/19200601C12N1/21200601C12N5/10200601C12N7/04200601C12P21/02200601A61K39/12200601A61K48/00200601A61P31/20200601A61P35/00200601C12R1/1920060171申请。

2、人厦门大学地址361005福建省厦门市思明区思明南路422号申请人厦门万泰沧海生物技术有限公司72发明人李少伟李智海李韵冰王大宁魏旻希张军夏宁邵74专利代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所11038代理人罗菊华54发明名称截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白57摘要本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45。

3、）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。51INTCL权利要求书2页说明书21页序列表25页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书21页序列表25页附图6页10申请公布号CN104211782ACN104211782A1/2页21一种截短的HPV45L1蛋白或其变体，其与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了2740个氨基酸，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个氨基酸；优选地，与野生型HPV45L1蛋白相比，该截短的HPV45L1蛋白N端截短了27个、30个、35个或40个氨基。

4、酸；优选地，该截短的HPV45L1蛋白具有SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5或SEQIDNO6所示的氨基酸序列，更优选地具有SEQIDNO3所示的氨基酸序列。2一种分离的核酸，其编码权利要求1的截短的HPV45L1蛋白或其变体。3包含权利要求2的分离的核酸的载体。4包含权利要求2的分离的核酸和/或权利要求3的载体的宿主细胞。5一种HPV45病毒样颗粒，其含有权利要求1的截短蛋白或其变体，或者由权利要求1的截短蛋白或其变体组成。6一种组合物，其包含权利要求1的截短的HPV45L1蛋白或其变体，或权利要求2的分离的核酸，或权利要求3的载体，或权利要求4的宿主细胞，或权利要求5的H。

5、PV45病毒样颗粒。7一种药物组合物或疫苗，其包含权利要求5的HPV45病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂，优选地，所述HPV45病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在；优选地，所述药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒HPV6L1蛋白病毒样颗粒，HPV11L1蛋白病毒样颗粒，HPV16L1蛋白病毒样颗粒，HPV18L1蛋白病毒样颗粒，HPV31L1蛋白病毒样颗粒，HPV33L1蛋白病毒样颗粒，HPV52L1蛋白病毒样颗粒和HPV58L1蛋白病毒样颗粒。8获得截短的HPV45L1蛋白的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统表达权利要求1的截短的HPV45L1蛋白，。

6、然后将含有该蛋白的裂解上清进行纯化处理，优选地，所述方法包括步骤A在大肠杆菌中表达所述截短蛋白，B将表达所述截短蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100MM600MM的溶液中破碎，分离得到上清液，C用水或低盐溶液将B）获得的上清液的盐浓度降至100MM或以下，最低至0，并收集沉淀，D将C）获得的沉淀在150MM2500MM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50的截短的HPV45L1蛋白。9制备权利要求5的HPV45病毒样颗粒的方法，其包括步骤A将根据权利要求8的方法获得的截短的HPV45L1蛋白通过色谱层析进行纯化，B将步骤A中得到的截短蛋白去除还原剂。10一种制备疫苗的。

7、方法，其包括将权利要求5的HPV45病毒样颗粒或通过权利要求9的方法获得的HPV45病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6，11，16，18，31，33，52和58的HPV型别的病毒样颗粒。11一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包括将预防有效量的权利要求5的HPV45病毒样颗粒，或通过权利要求9的方法获得的HPV45病毒样颗粒，或权利要权利要求书CN104211782A2/2页3求7的药物组合物或疫苗，或通过权利要求10的方法获得的疫苗施用给受试者，优选地，所述HPV感染是HPV45感染；优选地，所述由HPV感染所导致的疾病是宫颈癌。

8、。12权利要求1的截短的HPV45L1蛋白或其变体，或权利要求5的HPV45病毒样颗粒，或通过权利要求8的方法获得的截短的HPV45L1蛋白，或通过权利要求9的方法获得的HPV45病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病，优选地，所述HPV感染是HPV45感染；优选地，所述由HPV感染所导致的疾病是宫颈癌。权利要求书CN104211782A1/21页4截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白技术领域0001本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及一种截短的人乳头瘤病毒45型L1蛋白，其编码序列和制备方法，以及包含其的病毒样颗。

9、粒，所述蛋白和病毒样颗粒可用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。本发明还涉及上述蛋白和病毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV（特别是HPV45）感染及由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。背景技术0002人乳头瘤病毒HUMANPAPILLOMAVIRUS，HPV属于乳头瘤病毒科PAPILLOMAVIRIDAE乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。该病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为728KB，具有8个开放阅读框。该病毒基因组按功能的不同可以分为三个区域早期区E，约45KB，编码E。

10、1、E2、E4E7共6个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；晚期区L，约25KB，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；长调控区LCR，位于L区末端与E区起始端之间，长约800900BP，不编码任何蛋白，含DNA复制和表达调控元件。HPV病毒颗粒直径为4555NM，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。0003目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为3组低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；高度致癌风险组，包括HPV16、1。

11、8、58、45。0004HPV分子流行病学调查证实，高危型HPV感染是宫颈癌发生的重要启动因子。在所有宫颈癌标本中，HPVDNA检出率高达80以上。宫颈癌是一种常见的女性恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，是严重威胁女性健康的杀手。据统计，每年世界范围内约有490,000例的新发病例，约有270,000人死于该疾病（BOYLE，P，ANDJFERLAYANNONCOL2005，164818）。在所有宫颈癌病例中，发生于发展中国家的占了约83，在这些国家中，宫颈癌甚至能够占到女性恶性肿瘤的15。而在发达国家，这个数字仅占到15。在撒哈拉以南地区，中南亚，拉丁美洲，东亚均为宫颈癌的高发区。我国也属于宫。

12、颈癌高发区。在陕西略阳县，已婚妇女中宫颈癌的发病率高达1026/100000。0005有关世界范围内宫颈癌标本中HPV型别分布的荟萃分析发现，宫颈癌中最常见的HPV型别依次是16、18、58、33、45、31、52、35、59、39、51、59、68、6、73、66、70、82（按照降序排列）。在宫颈癌患者中HPV45的感染率为44，在HPV16544、HPV18165、HPV5851、HPV3347之后，位于第5位YPBAO，NLI，JSSMITHANDYLQIAOINTERNATIONALJOURNALOFSTDAIDS，2008，19106111。这说明HPV45在世界范围内的妇女宫颈癌。

13、患者中的感染率较高，是普遍易感染的HPV型别之一。0006目前已上市的HPV疫苗为MERCK的及GSK的上述两种疫苗分别含有HPV6/11/16/18及HPV16/18VLP，但均不包含在中国及亚洲妇女中普遍说明书CN104211782A2/21页5易感的HPV45型别VLP。0007因此，针对中国以及亚洲等发展中国家妇女安全有效的HPV疫苗，特别是针对HPV16，18及45等高危型别的疫苗，是有效预防宫颈癌，改善广大妇女（特别是我国及亚洲妇女）健康状况的有效途径。0008HPVL1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为5560KDA，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPVL1蛋白无需L2。

14、蛋白辅助即可形成在形态结构上与天然病毒颗粒相似的病毒样颗粒（VIRUSLIKEPARTICLE，VLP）。该病毒样颗粒为二十面体立体对称结构，由72个L1蛋白的五聚体组成。其保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体KIRNBAUER，R，FBOOY，ETAL1992PROCNATLACADSCIUSA8924121804。并且，病毒样颗粒不带有病毒核酸，无潜在致癌危险，具有良好的安全性。因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。0009HPVVLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的VLP表达系统可以分为真核表达系统及原核表达。

15、系统。0010常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。在真核表达系统中所表达的HPVL1蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。目前已上市的HPV疫苗采用了酿酒酵母表达系统，其表达量低，生产成本高，因此该产品价位偏高，影响其广泛应用。0011在原核表达系统中利用大肠杆菌表达系统表达HPVL1蛋白已有报道。例如已报道利用大肠杆菌表达HPV16L1蛋白（BANKS，L，GMATLASHEWSKI，ETAL1987J。

16、GENVIROL68PT1230819）。但是大肠杆菌表达的HPVL1蛋白大多失去其天然构象，不能产生针对HPV的保护抗体。或者尽管上述蛋白通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPVVLP（KELSALL，SRANDJKKULSKI1995JVIROLMETHODS5317590），但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，因此，难以在大规模生产上应用。虽然HPVL1蛋白也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是其表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋。

17、白的纯化（LI，M，TPCRIPE，ETAL1997JVIROL714298895），但融合蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。0012因此，本领域仍然需要能够低成本获得且能够诱导针对HPV的保护性抗体的HPVL1蛋白及由其组成的病毒样颗粒，从而使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。发明内容0013本发明至少部分基于发明人的出人意料的发现利用大肠杆菌表达系统能大量表达可以诱导针对HPV45的中和抗体的截短的HPV45L1蛋白，该截短的HPV45L1蛋白具有高产率，且经纯化后纯度可达到96或更高，并且纯化后的所述蛋白经进一步处理可得到可诱导针对HPV45的保护性抗体的病毒样。

18、颗粒。0014因此，在一个方面，本发明涉及一种截短的HPV45L1蛋白或其变体，其与野生型说明书CN104211782A3/21页6HPV45L1蛋白相比，N端截短了2740个氨基酸，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个氨基酸。0015在一个优选的实施方案中，与野生型HPV45L1蛋白相比，该截短的HPV45L1蛋白的N端截短了27个、30个、35个或40个氨基酸。0016在另一个优选的实施方案中，该截短的HPV45L1蛋白（以下也简称为截短蛋白）具有SEQIDNO3，SEQIDNO4，SEQIDNO5或SEQIDNO6所示的氨基酸序列。在另。

19、一个优选的实施方案中，该截短蛋白具有如SEQIDNO3所示的氨基酸序列。0017在另一个方面，本发明涉及编码本发明的截短蛋白或其变体的多核苷酸以及含有该多核苷酸的载体。0018可用于插入目的多核苷酸的载体是本领域公知的，包括但不限于克隆载体和表达载体。在一个实施方案中，载体是例如质粒，粘粒，噬菌体，柯斯质粒等等。0019在另一个方面，本发明还涉及包含上述多核苷酸或载体的宿主细胞。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞（如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等）。本发明的宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。0020在另一个方。

20、面，本发明涉及一种HPV45病毒样颗粒，其中该病毒样颗粒含有本发明的截短蛋白或其变体，或者由本发明的截短蛋白或其变体组成或形成。0021在一个优选的实施方案中，本发明的HPV45病毒样颗粒包含与野生型HPV45L1蛋白相比，N端截短了2740个氨基酸，例如27个、30个、35个或40个氨基酸的截短的HPV45L1蛋白，或由所述蛋白组成或形成。在一个特别优选的实施方案中，本发明的HPV45病毒样颗粒包含具有SEQIDNO3，4，5或6所示序列的截短的HPV45L1蛋白，或由所述蛋白组成或形成。0022在另一个方面，本发明还涉及包含上述截短蛋白或其变体，或上述多核苷酸或载体或宿主细胞或HPV45病。

21、毒样颗粒的组合物。在一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的截短蛋白或其变体。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含本发明的HPV45病毒样颗粒。0023在另一个方面，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，其包含本发明的HPV45病毒样颗粒，任选地还包含药学可接受的载体和/或赋形剂。本发明的药物组合物或疫苗可以用于预防HPV（特别是HPV45）感染或由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。0024在一个优选的实施方案中，所述HPV45病毒样颗粒以预防HPV感染或宫颈癌有效量存在。在另一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗还包含至少一种选自下列的病毒样颗粒HPV6L1。

22、蛋白病毒样颗粒，HPV11L1蛋白病毒样颗粒，HPV16L1蛋白病毒样颗粒，HPV18L1蛋白病毒样颗粒，HPV31L1蛋白病毒样颗粒，HPV33L1蛋白病毒样颗粒，HPV52L1蛋白病毒样颗粒，HPV58L1蛋白病毒样颗粒；优选地，这些病毒样颗粒各自独立地以预防宫颈癌或者相应HPV亚型感染有效量存在。0025本发明的药物组合物或疫苗可通过本领域公知的方法进行施用，例如但不限于通过口服或者注射进行施用。在本发明中，特别优选的施用方式是注射。0026在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物或疫苗以单位剂量形式进行施说明书CN104211782A4/21页7用。例如但不意欲限定本发明，每单位剂量。

23、中包含的HPV45病毒样颗粒的量为5G80G，优选20G40G。0027在另一个方面，本发明涉及一种获得本发明的截短蛋白的方法，其包括利用大肠杆菌表达系统表达本发明的截短蛋白，然后将含有该截短蛋白的裂解上清进行纯化处理。0028在一个优选实施方案中，获得本发明的截短蛋白的方法包括0029A在大肠杆菌中表达所述截短蛋白，0030B将表达所述截短蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100MM600MM的溶液中破碎，分离得到上清液，0031C用水或低盐溶液将B）获得的上清液的盐浓度降至100MM或以下，最低至0，并收集沉淀，0032D将C）获得的沉淀在150MM2500MM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离。

24、得到溶液，该溶液中含纯度至少50的截短的HPV45L1蛋白。0033更一般性地，本发明还涉及一种获得HPVL1蛋白例如本发明的截短蛋白的方法，其包括0034A在大肠杆菌中表达编码HPVL1蛋白的HPVL1基因，0035B将表达HPVL1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100MM600MM的溶液中破碎，分离得到上清液，0036C用水或低盐溶液将B）获得的上清液的盐浓度降至100MM或以下，最低至0，收集沉淀，0037D将C）获得的沉淀在150MM2500MM盐溶液中重新溶解，同时加入还原剂，分离得到溶液，该溶液中含纯度至少50的HPVL1蛋白。0038本发明还涉及一种获得本发明的HPV45病毒样颗粒的方。

25、法，其在获得本发明的截短蛋白的基础上，包括步骤0039E将纯度至少50的上述截短的HPV45L1蛋白进一步通过色谱层析纯化，0040F将步骤E中得到的截短蛋白去除还原剂。0041本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV45病毒样颗粒与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种选自HPV6，11，16，18，31，33，52和58的HPV型别的病毒样颗粒。如上所论述的，所获得的疫苗可以用于预防HPV（特别是HPV45）感染或由HPV（特别是HPV45）感染所导致的疾病例如宫颈癌等。0042在另一个方面，本发明涉及一种预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病的方法，其包。

26、括将预防有效量的根据本发明的HPV45病毒样颗粒或药物组合物或疫苗施用给受试者。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是HPV45感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。在另一个优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。0043在另一个方面，还涉及根据本发明的截短蛋白或HPV45病毒样颗粒在制备药物组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病。在一个优选的实施方案中，所述HPV感染是HPV45感染。在另一个优选的实施方案中，所述由HPV感染所导致的疾病包括但不限于，宫颈癌。0044本发明中相关术语的说明及。

27、解释说明书CN104211782A5/21页80045在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。0046根据本发明，表述“N端截短了X个氨基酸的蛋白质”是指，用起始密码子（用于起始蛋白质翻译）编码的甲硫氨酸残基置换蛋白质N末端的第1X位氨基酸残基所获得的蛋白质。例如N端截短了27个氨基酸的HPV45L1蛋白是指，用起始密码子编码的甲硫氨酸残基置换野生型HPV45L1蛋白N末端的第127。

28、位氨基酸残基所获得的蛋白质。0047根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本发明的截短的HPV45L1蛋白（如SEQIDNO3，4，5或6所示的蛋白）的氨基酸序列具有一个或多个（例如110个或15个或13个）氨基酸不同或者具有至少60，80，85，90，95，96，97，98，或99的同一性，并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以是如下特性中的一个或者多个能够诱导针对HPV45的中和抗体；能够在大肠杆菌中可溶性地表达；利用本发明所涉及的表达纯化方法能够获得高产率的纯化蛋白。术语“同一性”是对核苷酸序列或氨基酸序列的相似性的量度。通常将序列排列起来，以获得最。

29、大限度的匹配。“同一性”本身具有本领域公知的意义并且可用公开的算法（例如BLAST）来计算。0048根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌菌株与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌（菌株）来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于ER2566，BL21DE3，B834DE3，BLRDE3。0049根据本发明，术语“载体（VECTOR）”是指，可将多核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于质粒；噬菌体；柯斯。

30、质粒等等。0050根据本发明，术语“截短的HPV45L1蛋白”是指在野生型HPV45L1蛋白的N端和/或C端去掉一个或者多个氨基酸后的蛋白质，其中野生型HPV45L1蛋白的例子包括但不限于NCBI数据库中P367411，ABP999031，ABP998871，ABP998551或ABP998391等全长L1蛋白。0051术语“截短的HPV45L1蛋白基因片段”是指这样的基因片段，其与野生型HPV45L1蛋白基因（CDNA）相比，在5端或3端去掉编码一个或多个氨基酸的核苷酸，其中野生型HPV45L1蛋白基因的全长序列例如但不限于NCBI数据库中如下序列QV31748，QV26351，QV0656。

31、0，QV00550，QV34178，QV27565，QV31035，QV25000，QV35960或QV30004等。0052根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的（参见例如REMINGTONSPHARMACEUTICALSCIENCESEDITEDBYGENNAROAR,19THEDPENNSYLVANIAMACKPUBLISHINGCOMPANY,1995），并且包括但不限于PH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，PH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子。

32、或者非离子型表面活性剂，例如TWEEN80；佐剂包括但不限于铝佐剂（例如氢氧化铝），弗氏佐剂（例如完全弗氏佐剂）；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。说明书CN104211782A6/21页90053根据本发明，术语“有效量”是指能够有效实现预期目的的量。例如，预防疾病（例如HPV感染）有效量是指，能够有效预防，阻止，或延迟疾病（例如HPV感染）的发生的量。测定这样的有效量在本领域技术人员的能力范围之内。0054根据本发明，术语“色谱层析”包括但不限于离子交换色谱（例如阳离子交换色谱）、疏水相互作用色谱、吸附层析法（例如羟基磷灰石色谱）、凝胶过滤（凝胶排阻）层析、亲和层析法。0055根据本发明，。

33、本发明的截短的HPV45L1蛋白优选通过如下步骤获得将表达截短的HPV45L1蛋白的大肠杆菌在盐浓度为100600MM，优选200500MM的缓冲液中进行破碎，离心破碎溶液，得到上清液；用水或低盐浓度（通常低于破碎用的盐浓度）的溶液降低所得上清液的盐浓度至盐浓度100MM0MM，从而截短的HPV45L1蛋白在上清液中沉淀；将沉淀在含还原剂及盐浓度为1502500MM，优选200MM以上的溶液中重新溶解，从而分离得到含截短的HPV45L1蛋白的溶液，其中所述蛋白的纯度为至少50，优选至少70，更优选至少80。0056可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的，包括但不限于，TRIS缓冲液，磷酸盐。

34、缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。0057根据本发明，宿主细胞的破碎可通过本领域技术人员熟知的各种方法来实现，包括但不限于匀浆器破碎、均质机破碎、超声波处理、研磨、高压挤压、溶菌酶处理等等。0058可用于本发明的方法中的盐包括但不限于酸式盐，碱式盐，中性盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、盐酸盐、硫酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐，特别是NACL、KCL、NH4CL、NH42SO4中的一种或几种。特别优选的盐是NACL。可用于本发明的方法中的还原剂包括但不限于DTT，2巯基乙醇，其用量包括但不限于10MM100MM。0059根据本发明的HPV45病毒样颗粒可通过如下步骤获得将上述纯。

35、度至少50的截短的HPV45L1蛋白通过例如色谱层析进行进一步分离，得到经纯化的截短蛋白溶液；去除该溶液中的还原剂，得到所述HPV45病毒样颗粒。去除还原剂的方式是本领域已知的，包括但不限于，透析，超滤或者层析等。0060发明的有益效果0061目前用于制备HPV病毒样颗粒的表达系统可以分为真核表达系统和原核表达系统。0062在真核表达系统中表达的HPVL1蛋白天然构象破坏少，能自发形成VLP，往往只需进行简单的纯化过程即可获得具有正确构象的VLP。但目前真核表达系统例如杆状病毒表达系统和酵母表达系统存在表达量低，培养成本高等缺陷，给大规模工业化生产带来了极大困难。0063在原核表达系统中，大肠。

36、杆菌表达系统具有培养成本低，表达量大的优点。然而，在大肠杆菌中表达的HPVL1蛋白往往失去正确的天然构象，以包含体形式表达于沉淀中。目前对表达于包含体中的蛋白进行复性依然是一个世界性难题。复性困难和效率低下使得从包含体中获得有正确构象的VLP难以在大规模生产中实施，只能局限于小规模的实验室研究中。虽然HPVL1也可以以正确构象可溶性地表达于大肠杆菌中，但是其表达量低下。并且，从包含种类繁多的可溶性蛋白的大肠杆菌裂解上清中纯化出HPVL1蛋白也相当困难，往往需要借助融合表达及亲和层析等手段，而这些手段又往往需要昂贵的酶，因此，仍说明书CN104211782A7/21页10然无法实现工业化生产。0。

37、064本发明提供的N端截短的HPV45L1蛋白和其制备方法有效地解决了上述问题。首先，本发明使用大肠杆菌表达系统来表达N端截短的HPV45L1蛋白，确保了其高表达量。其次，本发明采用温和的手段选择性沉淀大肠杆菌裂解上清中的截短蛋白，然后采用含盐缓冲液重新溶解截短蛋白，从而在保持截短蛋白的正确构象的前提下使蛋白纯度有了显著提高，并且获得的截短蛋白溶液可以直接通过色谱层析例如离子交换层析及疏水交换层析进行进一步纯化，获得高纯度的目的蛋白（例如纯度达到96）。进一步，所获得的高纯度截短蛋白可以组装为病毒样颗粒，并且该病毒样颗粒可以在体内诱导高滴度的针对HPV45的中和抗体，具有良好的免疫原性，是一种。

38、良好的疫苗形式，可用于预防HPV45对人体的感染。由此可见，本发明具有以下优点本发明的截短蛋白在保留全长HPV45L1蛋白的抗原性及颗粒组装能力的同时，可在大肠杆菌表达系统中实现大量表达；本发明所采用的制备方法无需使用昂贵的酶，成本低廉；截短蛋白在纯化过程中构象没有经过剧烈的变性复性过程，损失小，产率高；截短蛋白所形成的病毒样颗粒能够诱导高滴度的针对HPV的保护性抗体，可用于生产疫苗。因此，本发明的截短蛋白和其制备方法可应用于大规模工业化生产，并且使大规模工业化生产宫颈癌疫苗成为可能。0065下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于。

39、说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。附图说明0066图1显示了在实施例2的不同步骤中获得的HPV45N27CL1蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道1破菌上清（即，破碎菌体后离心获得的上清）；泳道2无盐沉淀产物（即，透析后离心获得的沉淀）；泳道3重溶后上清（即，将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的上清）；泳道4重溶后沉淀（即，将无盐沉淀产物重新溶解后离心获得的沉淀）。结果显示，HPV45N27CL1蛋白在通过沉淀，重溶的步骤之后，纯度从之前的约10提高到了约70（参见泳道1和3）。0067。

40、图2显示了实施例3中经CHTSEPHAROSE4FASTFLOW柱纯化获得的HPV45N27CL1的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M蛋白分子量标记；泳道1CHTSEPHAROSE4FASTFLOW柱1000MMOL/LNACL洗脱级分（10L）；泳道2用CHTSEPHAROSE4FASTFLOW柱进行纯化前的样品。结果显示，经过CHTSEPHAROSE4FASTFLOW柱纯化后，HPV45N27CL1蛋白纯度达到95以上（参见泳道1）。0068图3显示了实施例4中所得的HPV45N27CL1病毒样颗粒的透射电镜观察（放大100,000倍，BAR01M）结果。视野中可见大量半径为25NM左。

41、右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。0069图4显示了实施例5中所述的实施例4所得的HPV45N27CL1病毒样颗粒的低温电镜观察的结果及其重建的三维结构。图4A，HPV45N27CL1病毒样颗粒的低温电镜观察结果；图4B，HPV45N27CL1病毒样颗粒的重建的三维结构。重建的三维结构显示，HPV45N27CL1VLP是由72个壳粒（形态亚单位，五聚体）形成的T7的二十面体结构说明书CN104211782A108/21页11（H1,K2）。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，HPV45N27CL1VLP结构中所有的组成亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围。

42、直径为约60NM。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统（例如，痘病毒表达系统）来源的HPVVLP的三维结构（BAKERTS,NEWCOMBWW,OLSONNHETALBIOPHYSJ1991,60614451456；HAGENSEEME,OLSONNH,BAKERTS,ETALJVIROL1994,68745034505；BUCKCB,CHENGN,THOMPSONCDETALJVIROL2008,821151907）类似。0070图5显示了实施例4中所得的HPV45N27CL1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N27CL1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为2868N。

43、M，颗粒组装百分比为927。0071图6显示了实施例6中用HPV45N27CL1病毒样颗粒接种小鼠后不同阶段血清的中和抗体滴度。红色箭头指示处为免疫时间点，在初次免疫1周后，中和抗体滴度即有明显上升；在经过两次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到接近106的较高水平。0072图7显示了实施例6中用HPV45N27CL1病毒样颗粒接种兔子后不同阶段血清的中和抗体滴度。红色箭头指示处为免疫时间点，在初次免疫两周后，中和抗体滴度即有明显上升；在经过两次加强免疫后，中和抗体的滴度即能达到106的较高水平。0073图8显示了实施例7中各HPV45L1截短蛋白在大肠杆菌中的表达情况的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

44、的结果。泳道M，蛋白分子量标记；泳道1，HPV45L1全长破菌上清，上样体积为10L；泳道2，HPV45N24CL1破菌上清，上样体积为10L；泳道3，HPV45N27CL1破菌上清，上样体积为10L；泳道4，HPV45N30CL1破菌上清，上样体积为10L；泳道5，HPV45N35CL1破菌上清，上样体积为10L；泳道6，HPV45N40CL1破菌上清，上样体积为10L；泳道7，HPV45N45CL1破菌上清，上样体积为10L。0074图9显示了实施例7得到的、经纯化的N端截短了30个,35个或40个氨基酸的HPV45L1蛋白HPV45N30CL1，HPV45N35CL1，HPV45N40C。

45、L1（其氨基酸序列分别是SEQIDNO4，SEQIDNO5，SEQIDNO6）的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M，蛋白分子量标记；泳道1，HPV45N30CL1蛋白，上样体积为10L；泳道2，HPV45N35CL1蛋白，上样体积为10L；泳道3，HPV45N40CL1蛋白，上样体积为10L。结果显示，实施例6得到的蛋白HPV45N30CL1，HPV45N35CL1，HPV45N40CL1的蛋白纯度均达到了95以上。0075图10显示了实施例7中所述的HPV45N30CL1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，01UM）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25NM左右的病毒样颗粒，颗。

46、粒大小与理论大小相符，且均匀一致。0076图11显示了实施例7中所述的HPV45N35CL1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，01UM）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25NM左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。0077图12显示了实施例7中所述的HPV45N40CL1病毒样颗粒的透射电镜观察（100,000倍，01UM）结果。结果显示，视野中可见大量半径为25NM左右的病毒样颗粒，颗粒大小与理论大小相符，且均匀一致。0078图13显示了实施例7中所述的HPV45N30CL1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N30CL1病毒样颗粒的水化分子动力。

47、学半径为3202NM左右，颗粒组装百分比为957。说明书CN104211782A119/21页120079图14显示了实施例7中所述的HPV45N35CL1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N35CL1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为2917M左右，颗粒组装百分比为954。0080图15显示了实施例7中所述的HPV45N40CL1病毒样颗粒的动态光散射观测结果。结果显示，HPV45N40CL1病毒样颗粒的水化分子动力学半径为2998NM左右，颗粒组装百分比为930。0081本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。0082表1序列的说明0083SEQIDNO说明1野生型HPV。

48、45L1蛋白（P367411）的氨基酸序列2N端缺失24个氨基酸的HPV45L1蛋白序列3N端缺失27个氨基酸的HPV45L1蛋白序列4N端缺失30个氨基酸的HPV45L1蛋白序列5N端缺失35个氨基酸的HPV45L1蛋白序列6N端缺失40个氨基酸的HPV45L1蛋白序列7N端缺失45个氨基酸的HPV45L1蛋白序列8编码SEQIDNO1的DNA序列9编码SEQIDNO2的DNA序列10编码SEQIDNO3的DNA序列11编码SEQIDNO4的DNA序列12编码SEQIDNO5的DNA序列13编码SEQIDNO6的DNA序列14编码SEQIDNO7的DNA序列15引物16引物0084序列1SE。

49、QIDNO10085MAHNIIYGHGIIIFLKNVNVFPIFLQMALWRPSDSTVYLPPPSVARVVSTDDYVSRTSIFYHAGSSRLLTVGNPYFRVVPNGAGNKQAVPKVSAYQYRVFRVALPDPNKFGLPDSTIYNPETQRLVWACVGMEIGRGQPLGIGLS说明书CN104211782A1210/21页13GHPFYNKLDDTESAHAATAVITQDVRDNVSVDYKQTQLCILGCVPAIGEHWAKGTLCKPAQLQPGDCPPLELKNTIIEDGDMVDTGYGAMDFSTLQDTKCEVPLDICQSICKYPDYLQMSADPYGDSMFFCLRREQLFARHFWNRAGVMGDTVPTDLYIKGTSANMRETPGSCVYSPSPSGSIITSDSQLFNKPYWLHKAQGHNNGICWHNQLFVTVVDTTRSTNLTLCASTQNPVPSTYDPTKFKQYSRHVEEYDLQFIFQLCTITLTAEVMSYIHSMNSSILENWNFGVPPPPTTSLVDTYRFVQSVAVTCQKDTTPPEKQDPYDKLKFWTVDLKEKFSSDLDQYPLGRKFLVQAGLRRR。