一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103525772 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525772 A (21)申请号 201310489742.0 (22)申请日 2013.10.18 CGMCC NO.8159 2013.09.05 C12N 7/00(2006.01) C07K 16/10(2006.01) C07K 16/02(2006.01) A61K 39/125(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 1/16(2006.01) C12R 1/93(2006.01)(71)申请人 江苏省农业科学。

2、院 地址 210014 江苏省南京市孝陵卫钟灵街 50 号 (72)发明人 邓碧华 卢宇 吕芳 张金秋 侯继波 赵晓娟 赵艳红 (74)专利代理机构 南京汇盛专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32238 代理人 袁静 (54) 发明名称 一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用 (57) 摘要 本发明提供一株鸭病毒性肝炎病毒及其应 用， 属于生物技术领域。所述鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株， 其微生物保藏号是 ： CGMCCNO.8159。 本发明还提供鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株的 应用、 鸭病毒性肝炎病毒疫苗及抗鸭病毒性肝炎 蛋黄抗体。本发明鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株。

3、， 对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免 疫原性， 能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒 1 型 R85952 株、 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 A66 株及自身毒株攻 毒。 本发明提供鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 该疫苗免 疫种鸭后， 雏鸭可从母源获得保护， 能够抵抗鸭病 毒性肝炎病毒感染。本发明的再一目的是提供抗 鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 能够预防和治疗鸭病毒 性肝炎。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 。

4、CN 103525772 A CN 103525772 A 1/1 页 2 1. 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株， 其微生物保藏号是 ： CGMCC NO.8159。 2. 权利要求 1 所述鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 在制备预防和治 疗鸭病毒性肝炎疾病的药物中的应用。 3. 根据权利要求 2 所述应用， 其特征在于所述预防鸭病毒性肝炎疾病的药物为鸭病毒 性肝炎病毒疫苗或抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 所述治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物为抗鸭病 毒性肝炎蛋黄抗体。 4. 鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 其特征在于含有灭活的鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-。

5、JS 株 CGMCC NO.8159 病毒液。 5. 根据权利要求 4 所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 其特征在于所述鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 病毒液的制备方法为 ： 将鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 接种鸭胚， 收集 24-100 小时内死亡的鸭胚， 取所述死亡鸭胚的尿囊液和去 除胆囊的胚体 ； 将所述去除胆囊的胚体均质后与所述尿囊液混合， 离心取上清液， 即得所述 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 病毒液。 6. 根据权利要求 5 所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 其特征在于所。

6、述鸭病毒性肝炎病毒疫 苗为油乳剂。 7. 根据权利要求 6 所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 其特征在于所述鸭病毒性肝炎病毒 疫苗采用如下方法制备 ： 将吐温 -80 与灭活的鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 病毒液按照体积比 4 ： 90-4 ： 100 混合均匀， 得到水相 ； 将司本 -80 与白油按照体积 比为 6 ： 90-6:100 混合均匀， 得到油相 ； 将所述油相和水相按照体积比为 2:1-4:1 混合、 乳 化后得到鸭病毒性肝炎病毒疫苗。 8. 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 其特征在于采用如下方法制备 ： 将权利要求 4 所述鸭病 毒性肝炎病毒疫。

7、苗接种健康开产蛋鸡， 收集高免鸡蛋 ； 取高免鸡蛋的蛋黄， 加入酸性水溶 液， 搅拌均匀， 静置后离心取上清液， 过滤取滤液， 得到所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。 9. 根据权利要求 8 所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 其特征在于当蛋黄的中和效价大于 等于 211时， 收集高免鸡蛋。 权 利 要 求 书 CN 103525772 A 2 1/7 页 3 一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用。 背景技术 0002 鸭病毒性肝炎病毒 1 型属于小 RNA 病毒科， 呈球形或类球形， 直径在 20-40nm， 无 囊膜， 无血凝。

8、性， 可在鸭、 鸡、 鹅胚尿囊腔增殖。鸭病毒性肝炎病毒 1 型可引起雏鸭的肝脏呈 出血性炎症。鸭病毒性肝炎是急性烈性传染病。1945 年， 在美国首次发现本病， 并命名为 1 型鸭病毒性肝炎， 1965 年在英国发现了鸭病毒性肝炎 2 型， 1969 年在美国发现了鸭病毒性 肝炎3型。 目前， 1型呈世界性分布， 并曾报道在印度、 埃及和美国发现1型鸭肝炎病毒的变 异株。2 型和 3 型鸭病毒性肝炎分别局限于英国和美国， 未发现变异毒株。20 世纪 80 年代 初期起， 该病在我国再次流行。 0003 中国由黄均健 (1963) 首次报道了鸭病毒性肝炎的发生。随后， 研究人员分离到了 鸭病毒性。

9、肝炎病毒 1 型 R85952 株， 该毒株被列为参考毒株。2000 年， 张小飞等筛选分离到 了可在鸡胚繁殖的鸭病毒性肝炎病毒 1 型 A66 株， 并于 2013 年获得国家二类新兽药证书。 何冉娅等 (2010) 对 2007 - 2009 年华南地区鸭病毒性肝炎病毒 1 型进行流行病学调查及 变异分析， 结果表明华南地区毒株已发生变异。由于鸭病毒性肝炎病毒 1 型自身的变异， 旧 的毒株对新流行毒株不能提供足够的交叉保护能力。 发明内容 0004 本发明的目的是提供鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株， 对目前流行的鸭病毒性肝 炎病毒有很好的免疫原性， 能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒 1 型 。

10、R85952 株、 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 A66 株及自身毒株攻毒。 0005 本发明的另一目的是提供鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 该疫苗免疫种鸭后， 雏鸭可从 母源获得保护， 能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒感染。 0006 本发明的再一目的是提供抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 能够预防和治疗鸭病毒性肝 炎。 0007 本发明的目的采用如下技术方案实现。 0008 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株， 其微生物保藏号是 ： CGMCC NO.8159。 0009 所述鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 在制备预防和治疗鸭病毒 性肝炎疾病的药物中的应用。 0010 。

11、所述预防鸭病毒性肝炎疾病的药物为鸭病毒性肝炎病毒疫苗或抗鸭病毒性肝炎 蛋黄抗体， 所述治疗鸭病毒性肝炎疾病的药物为抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。 0011 鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 其特征在于含有灭活的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株 CGMCC NO.8159 病毒液。 0012 所述鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液的制备方法为 ： 将鸭 病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 接种鸭胚， 收集 24-100 小时内死亡的鸭胚， 说 明 书 CN 103525772 A 3 2/7 页 4 取所述死亡鸭胚的尿囊液和去除胆囊的胚体 ； 。

12、将所述去除胆囊的胚体均质后与所述尿囊液 混合， 离心取上清液， 即得所述鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 CGMCC NO.8159 病毒液。 0013 所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗为油乳剂。 0014 所述鸭病毒性肝炎病毒疫苗采用如下方法制备 ： 将吐温 -80 与灭活的鸭病毒性肝 炎病毒1型DHV-JS株CGMCC NO.8159病毒液按照体积比4 ： 90-4 ： 100混合均匀， 得到水相 ； 将司本 -80 与白油按照体积比为 6 ： 90-6:100 混合均匀， 得到油相 ； 将所述油相和水相按照 体积比为 2:1-4:1 混合、 乳化后得到鸭病毒性肝炎病毒疫苗。 0015 。

13、抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 采用如下方法制备 ： 将权利要求 4 所述鸭病毒性肝炎 病毒疫苗接种健康开产蛋鸡， 收集高免鸡蛋 ； 取高免鸡蛋的蛋黄， 加入酸性水溶液， 搅拌均 匀， 静置后离心取上清液， 过滤取滤液， 得到所述抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。 0016 当蛋黄的中和效价大于等于 211时， 收集高免鸡蛋。 0017 有益效果 本发明提供的鸭病毒性肝炎病毒1型DHV-JS株， 对目前流行的鸭病毒性肝炎病毒有很 好的免疫原性， 能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒 1 型 R85952 株、 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 A66 株 及自身毒株攻毒。 0018 本发明提供的鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 该疫苗免疫。

14、种鸭后， 雏鸭可从母源获得保 护， 能够抵抗鸭病毒性肝炎病毒感染。由于鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株， 对目前流行 的鸭病毒性肝炎病毒有很好的免疫原性， 所以本发明鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后也能够 保护接种动物， 避免感染鸭病毒性肝炎病毒 1 型 R85952 株、 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 A66 株 及自身毒株。 0019 本发明提供的抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 能够预防和治疗鸭病毒性肝炎。 附图说明 0020 图 1 PCR 扩增产物的电泳图。其中泳道 1 为 DL2000 maker, 泳道 2 和 3 为鸭病毒 性肝炎病毒 1 型 W 株 （阳性株） ， 泳道 4 为本发明。

15、待鉴定毒株， 泳道 5 为阴性对照。 0021 图 2 是 VP1 基因同源性分析结果， 与 NCBI 网站 GENEBANK 中公布的鸭病毒性肝炎 病毒序列同源性比较。 0022 图 3 是 VP1 基因进化分析结果， 与 NCBI 网站 GENEBANK 中公布的鸭病毒性肝炎病 毒序列进化分析。 0023 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株的微生物保藏号是 ： CGMCC NO.8159。 0024 鸭病毒性肝炎病毒 DHV-JS 株的保藏信息如下 ： 分类命名 ： 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 拉丁文学名 ： duck hepatitis A virus type 1 保藏单位 ： 。

16、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所 保藏日期 ： 2013 年 09 月 05 日 保藏编号 ： CGMCC NO.8159。 具体实施方式 说 明 书 CN 103525772 A 4 3/7 页 5 0025 实施例 1 鸭病毒性肝炎病毒的获得和特性测定 1. 病毒分离 将疑似感染鸭病毒性肝炎雏鸭的肝组织， 研磨匀浆得到病料样品。加入 1/5 倍病料样 品体积的生理盐水、 终浓度均为 200 单位的青霉素和链霉素， 反复冻融 3 次， 7000 r/min 离 心 20 min 吸取上清液。。

17、将上清液用微孔滤膜过滤， 取过滤液经尿囊腔接种 10-12 日龄鸭胚 10 枚， 弃 24 小时内死亡胚 ； 收集 2496 小时死亡胚， 采集其肝组织研磨成匀浆后与尿囊液 混匀成悬液， 反复冻融 3 次， 取上清液， 经无菌检查确定无菌后， 作为病毒样本以备进一步 鉴定。 0026 2. 病毒鉴定 提取本实施例标题 1 中所获病毒样本中的 RNA， 具体步骤如下 ： 取病毒样本 200L， 加入 600L 的 TRIzol 试剂 ； 依次加入 200L 氯仿， 剧烈振荡 15s， 室温放置 5min ； 4， 12000r/min 离心 10min ； 取上清加入 800L 的异丙醇， -2。

18、0放置 30min ； 4， 12000r/min 离心 10min ； 取上清加入 2 倍体积的无水乙醇， 弃上清， 加入 75% 的乙醇 1000L 洗涤 ； 4， 7500r/min 离心 5min ； 弃上清， 干燥 10min ； 加入 15L 的 DEPC 水溶解沉淀， 得到病毒 RNA。 以病毒 RNA 为模板进行反转录， 获得 cDNA。 0027 以 cDNA 为模板， 设计上游引物、 下游引物和中间引物， PCR 扩增病毒的 VP1 基因， 对病毒进行鉴定。 0028 上游引物 DHV-F（SEQ ID NO:1） 为 ： 5-ATCAGGGTGATTCCAACCAG-3 。

19、； 下游引物 DHV-R（SEQ ID NO:2） 为 ： 5- TTGGTCTGATTCAATTTCCA -3 ； 中间引物 DHV-M（SEQ ID NO:3） 为 ： 5-TTCCTGGCACATCAGAGGCAA-3。 0029 PCR 扩增的反应体系 （50ul） ： 模板 5L， 10Buffer 5L， Mg2+ 3L， dNTPs 2L， DHV-F 1L， DHV-R 1L， DHV-M 1L， Taq DNA 聚合酶 0.5L， 以 DEPC 水补足体积 至 50L。 0030 PCR 反应程序 ： 94预变性 5min ； 进入循环 ： 94变性 60s， 65退火 45。

20、s， 72延 伸 45s， 35 个循环 ； 72延伸 10min。 0031 将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果显示片段大小约为700bp （图 1） 。将 PCR 扩增片段进行测序， 具体序列如 SEQ ID NO:4 所示。 0032 将基因序列进行分析， 见图 2 和图 3。其中代号 J_(0706-31)yinwu1_A60554_ B12_130700625 是本发明待鉴定毒株， 代号 W_(0706-31)yinwu1_A60554_A12_130700625 是阳性株鸭病毒性肝炎病毒 1 型 W 株 （购自南京天邦生物技术有限公司） ， 其它均为 NCBI 上。

21、 的公布的鸭病毒性肝炎病毒序列。可以看出， 本发明待鉴定毒株与鸭病毒性肝炎病毒 1 型 经典标准毒株 R85952 株等的同源性为 69.3%70.9%， 与鸭病毒性肝炎病毒 1 型 AP-03337、 AP-04009、 AP-04203 株同源性为 92.6%93.3%， 有较高的同源性， 证明本发明待鉴定毒株为 鸭病毒性肝炎病毒 1 型。将该病毒命名为鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 （缩写为 DHV-JS 株） ， 并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC） 保藏, 其微生物保藏号 是 ： CGMCC NO.8159。 0033 3. 病毒培养 将本实施例。

22、标题 2 中鉴定为鸭病毒性肝炎病毒 1 型的病毒样本， 用生理盐水作 100 倍 稀释， 接种 1113 日龄鸭胚， 每胚 0.2mL， 37培养， 弃去 24 小时死亡的鸭胚。培养 96 小时 说 明 书 CN 103525772 A 5 4/7 页 6 后， 收取尿囊液和胚体。将胚体去除胆囊， 均质后加入尿囊液中， 经 5000r/min 离心 10min， 收集上清液作为毒种， -20保存。 0034 4. 病毒特性 检测本实施例标题 3 中毒种的特性。 0035 4.1 病毒含量 将毒种以生理盐水作 10 倍倍比稀释， 分别接种 1113 日龄鸭胚绒毛尿囊腔， 每只鸭胚 接种 0.2m。

23、L， 并作空白对照。每个稀释度接种 5 只鸭胚， 以石腊封口， 置于 37温箱进行恒 温培养。培养 24 小时照胚一次， 弃去 24 小时内死亡的胚， 以 Reed-Mueeh 法计算 DHV-JS 株 对鸭胚的半数致死量 （ELD50） ， ELD50不低于 10-6.0/0.2mL。 0036 4.2 毒力 毒种以生理盐水作 10 倍倍比稀释， 每只颈部皮下注射 0.2mL 接种 3 日龄左右雏鸭， 观察 10 日， 观察雏鸭的死亡情况。以 Reed-Mueeh 法计算 DHV-JS 株对雏鸭的半数致死量 （LD50） ， LD50不低于 10-6.0/0.2mL。 0037 实施例 2 。

24、鸭病毒性肝炎病毒疫苗及其应用 1 病毒培养 将毒种 （实施例 1） 以生理盐水作 100 倍稀释， 接种 1113 日龄鸭胚， 每胚 0.2mL， 37培 养， 弃去 24 小时内死亡的鸭胚。培养时间为 96 小时， 收取死亡鸭胚的尿囊液和胚体。将胚 体去除胆囊、 均质后与尿囊液混合， 5000r/min 离心 10min， 收集上清液作为 DHV-JS 株病毒 液， -20保存。 0038 2 病毒含量 将 DHV-JS 株病毒液以生理盐水作 10 倍倍比稀释， 分别接种 1113 日龄鸭胚绒毛尿囊 腔， 每只鸭胚接种 0.2mL， 并作空白对照。每个稀释度接种 5 只鸭胚， 以石腊封口， 。

25、置于 37 温箱进行恒温培养。每隔 24 小时照胚一次， 弃去 24 小时内死亡的胚。以 Reed-Mueeh 法计 算 DHV-JS 株病毒液对鸭胚的半数致死量 （ELD50） ， ELD50应不低于 10-6.0/0.2mL。 0039 3 病毒液的灭活 在 DHV-JS 株病毒液中加入甲醛， 使甲醛的终浓度达到 0.1%（体积浓度） ， 于 37作用 24 小时， 其间每隔 1 小时搅拌或振摇一次， 获得灭活病毒液。灭活结束后置 2-8， 可保存 1 个月。 0040 4 灭活检验 将灭活病毒液用生理盐水按照稀释度为1 ： 10稀释后， 接种12日龄易感鸭胚5枚， 接种 量为每孔 0.2。

26、ml。37下培养， 观察 120 小时。盲传 3 代， 如果鸭胚无死亡则表明灭活完全。 0041 5 制备鸭病毒性肝炎病毒疫苗 制备水相 ： 将吐温 -80 与灭活病毒液按体积比 4 ： 96 混合均匀， 即得到水相。 0042 油相 ： 将司本 -80 与注射用白油按照体积比为 6 ： 94 混合均匀， 即得到油相。 0043 乳化 ： 按照体积比为 3 ： 1 将油相和水相进行混合并乳化， 得到鸭病毒性肝炎病毒 疫苗。 0044 6 鸭病毒性肝炎病毒疫苗安全检验 每批鸭病毒性肝炎病毒疫苗用 3 日龄雏鸭和开产种鸭各 5 只， 每头颈部皮下注射 4 羽 份 （2ml） 鸭病毒性肝炎疫苗， 另。

27、设置不接种疫苗的同类鸭作对照组。 说 明 书 CN 103525772 A 6 5/7 页 7 0045 接种后观察 14 天， 所有试验鸭无临床征状， 健康情况良好。因此该鸭病毒性肝炎 病毒疫苗是安全的。 0046 鸭病毒性肝炎病毒疫苗用于接种种鸭， 通过母源抗体预防雏鸭发生由鸭病毒性肝 炎病毒引起的鸭病毒性肝炎。 0047 7. 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫剂量确定及其保护性测定 将开产种鸭分为 4 组， 每组 10 只。1 组颈部皮下注射 0.3ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗 ； 2 组颈部皮下注射 0.5ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗 ； 3 组颈部皮下注射 1.0ml 鸭病毒性肝炎病 毒疫苗 ；。

28、 4 组颈部皮下注射 1.0ml 生理盐水。试验采用单次免疫， 免疫后 21 天至 28 天， 收 集所产鸭蛋， 每组随机挑选 20 枚进行孵化雏鸭。雏鸭出雏后 7 天， 每组选取 10 只雏鸭， 采 血并颈部皮下注射 DHV-JS 株， 攻毒剂量为 100LD50， 攻毒后连续观察 10 天， 记录死亡情况。 采集的血液分离血清， 等量混合后鸭胚中和法测定抗体效价 （参照 2000版中国兽药典 ， 下 同） 。 0048 表 1 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫原性试验 分组 免疫种鸭剂量7 日龄雏鸭抗体水平攻毒保护数攻毒保护率 1 组 0.3ml23.174/1040% 2 组 0.5ml25.0。

29、10/10100% 3 组 1.0ml25.6310/10100% 4 组 1.0ml 生理盐水-0/100% 从表1可以看出， 每只种鸭免疫0.3ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 雏鸭攻毒保护率为40% ； 每只种鸭免疫0.5ml鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 雏鸭攻毒保护率为100% ； 每只种鸭免疫1.0ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 雏鸭攻毒保护率为100%。 孵化的雏鸭攻毒结果显示， 每只种鸭接种 鸭病毒性肝炎病毒疫苗 0.5ml 以上， 可以保护雏鸭。该试验表明鸭病毒性肝炎病毒疫苗具 有很好的免疫原性。 0049 8. 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后种鸭抗体水平及抗体持续期测定 取开产种鸭 20 只，。

30、 每只颈部皮下注射 1.0ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗。试验采用单次免 疫， 免疫后分别于 7、 14、 21、 28、 60、 90 天采血， 分离血清， 将同一时间采血分离的血清等体 积混合， 采用鸭胚中和试验 （检测方法参照 2000 版中国兽药典 ， 下同） 测定种鸭血液中的 鸭病毒性肝炎抗体水平及抗体持续时间。 0050 表 2 鸭病毒性肝炎病毒疫苗免疫后种鸭抗体水平及抗体持续期结果 免疫后时间7 天14 天21 天 28 天60 天 90 天 中和效价22.3326.1728.528.6328.024.5 从表 2 可以看出， 每只种鸭免疫 1.0ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗后， 7 。

31、天开始产生抗体， 2128 天为抗体产生高峰， 2860 天， 抗体效价仍有较高， 6090 天抗体效价开始下降。 0051 9. 交叉被动保护力的测定 同法按照本实施例的疫苗制备方法， 制备含有 R85952 株 （购自美国标准生物品收藏中 心 ATCC） 和 A66 株 （南京天邦生物技术有限公司惠赠， 张小飞， 黄显明， 尹秀凤， 等鸭肝炎 病毒 A66 弱毒株的水平传播感染 J 江苏农业学报， 2011， 27( 4) : 813-817 ） 的疫苗。 含有 R85952 株的疫苗记作对照疫苗 1， 制备过程中使用的 R85952 株病毒液的 ELD50含量为 10-6.0/0.2mL。

32、。含有 A66 株的疫苗自作对照疫苗 2， 制备过程中使用的 A66 株病毒液的 ELD50 含量为 10-6.0/0.2mL。取开产 7 日龄雏鸭 30 只， 随机分成 3 组。将对照疫苗 1、 2 和实施例 2 中制备的鸭病毒性肝炎病毒疫苗 （DHV-JS 株） 分别接种一组雏鸭 （首免） ， 每只颈部皮下注射 说 明 书 CN 103525772 A 7 6/7 页 8 0.5ml ； 14 天后每只雏鸭再次接种 1.0ml 相应的疫苗。首免后 21 天， 对各组雏鸭采血， 收集 针对各毒株的血清， 采用鸭胚中和试验测定血清抗体效价， 用生理盐水将针对各毒株的血 清稀释至鸭胚中和效价为 。

33、1:256， 分别得到 R85952 株、 A66 株和 DHV-JS 株的高免血清。 0052 将 3 日龄雏鸭 45 只分成 3 个组， 每组 15 只。其中， 第一组雏鸭， 颈部皮下注射 R85952 株高免血清， 0.5ml/ 只 ； 第二组雏鸭， 颈部皮下注射 A66 株高免血清， 0.5ml/ 只 ； 第 三组雏鸭， 颈部皮下注射DHV-JS株高免血清， 0.5ml/只。 高免血清接种后24h， 对每组雏鸭 ： 随机取 5 只雏鸭， 颈部皮下注射 R85952 株病毒液 ； 另取 5 只雏鸭， 颈部皮下注射 A66 株病毒 液 ； 余下的 5 只雏鸭， 颈部皮下注射 DHV-JS 。

34、株病毒液。各毒株的攻毒剂量均为 100LD50。观 察 10 天， 记录各组的死亡数。 0053 试验结果如表 3 所示。R85952 株高免血清对自身毒株的保护率为 100%， 对 A66 株和 DHV-JS 株的保护率分别为 80% 和 20% ； A66 株高免血清对 R85952 株、 A66 株和 DHV-JS 株的保护率分别为 80%、 100% 和 0 ； DHV-JS 株高免血清对 R85952 株、 A66 株和 DHV-JS 株的 保护率分别为 100%、 80% 和 100%。上述结果说明， 本发明筛选到的 DHV-JS 株不仅可以保护 自身毒株的攻毒， 而且对其它毒株也。

35、有很好的交叉保护。R85952 株和 A66 株的高免血清对 DHV-JS 株攻毒的保护数仅为 1/5 和 0/5， 基本没有交叉保护力。 0054 表 3 交叉被动保护试验结果 （百分率） 实施例 3 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体的制备及其应用 采用实施例 2 制备的鸭病毒性肝炎病毒疫苗 （DHV-JS 株） 制备抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗 体。 0055 1. 蛋鸡免疫 采用健康开产蛋鸡， 先后胸部肌肉多点注射鸭病毒性肝炎病毒疫苗， 0.5ml/ 只， 此为首 免。首免后 10 天， 每只蛋鸡免疫 1.0ml 鸭病毒性肝炎病毒疫苗。首免后 20 天， 每只蛋鸡注 射鸭病毒性肝炎病毒疫苗 2.0ml。三。

36、次免疫后， 定期检查蛋黄对鸭胚中和试验效价 （检测方 法参照 2000 版中国兽药典 ） ， 当中和效价达到 211， 开始收集高免鸡蛋。 0056 2. 制备抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 消毒收集的高免鸡蛋， 采取手工或机械方式分离蛋清和蛋黄。在 2 30环境中， 在 蛋黄中加入其体积 7 倍的酸性水溶液 （用盐酸调节水至 pH 为 45） ， 搅拌均匀， 4静置 8 小 时， 8000rpm 离心 30 分钟后取上清液。上清液经过 0.22m 孔径的滤芯过滤， 取滤液， 调整 其鸭胚中和效价为 1:256， 得到抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体。 0057 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 用于预防和紧急治疗鸭病。

37、毒性肝炎。抗鸭病毒性肝炎 蛋黄抗体的接种途径是颈部皮下注射。3. 预防雏鸭病毒性肝炎感染能力测定 3. 取 3 日龄左右非免疫健康雏鸭 50 只， 随机分为 5 组， 每组 10 只。第 1 组为空白对照 说 明 书 CN 103525772 A 8 7/7 页 9 组， 每只颈部皮下注射 1.0ml 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 不攻毒， 单独隔离饲养。第 2 组 （试 验组） 每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 0.3ml、 第 3 组 （试验组） 每只颈部皮下注 射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 0.5ml， 第 4 组 （试验组） 每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋 黄抗体 1.0ml。第 5 。

38、组 （攻毒对照组） 每只颈部皮下注射生理盐水 0.5ml。接种 24 小时后， 第 25 组颈部皮下注射 DHV-JS 株病毒液， 攻毒剂量为每只 100LD50， 连续观察 10 日。 0058 表 4 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体预防试验结果 分组 免疫剂量攻毒剂量雏鸭数量攻毒保护率 1 组 1.0ml010 只100%（10/10） 2 组 0.3ml100LD5010 只60%（6/10） 3 组 0.5ml100LD5010 只100%（10/10） 4 组 1.0ml100LD5010 只100%（10/10） 5 组 0100LD5010 只0%（0/10） 从表4可以看出， 每只雏鸭。

39、接种0.3ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 24小时后攻毒,雏鸭 保护率仅有60% ； 每只雏鸭接种0.5ml抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 24小时后攻毒,雏鸭保护 率达到 100% ； 雏鸭接种 1.0ml 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 24 小时后攻毒 , 雏鸭保护率达到 100%。预防试验结果显示， 雏鸭注射 0.5ml 及以上蛋黄抗体， 可以完全保护雏鸭。 0059 4. 治疗雏鸭病毒性肝炎感染能力测定 取3日龄左右非免疫健康雏鸭50只， 随机分为5组， 每组10只。 第1组为空白对照组， 每只注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 1.0ml， 不攻毒， 单独隔离饲养。第 2 5 组颈部皮下注 射鸭病毒性肝。

40、炎病毒 DHV-JS 株病毒液， 每只 100LD50。12 小时后， 第 2 组 （试验组） 每只颈部 皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 0.3ml， 第 3 组 （试验组） 每只颈部皮下注射抗鸭病毒性 肝炎蛋黄抗体 0.5ml， 第 4 组 （试验组） 每只颈部皮下注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体 1.0ml。 第5组 （攻毒对照组） 每只颈部皮下注射生理盐水0.5ml。 注射抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体后， 连续观察 10 日。 0060 表 5 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体紧急治疗试验结果 分组 攻毒剂量抗体给药剂量雏鸭数量攻毒保护率 1 组 01.0ml10 只100% 2 组 100LD500.3ml。

41、10 只30% 3 组 100LD500.5ml10 只80% 4 组 100LD501.0ml10 只100% 5 组 100LD50010 只0% 从表 5 可以看出， 采用 DHV-JS 株对雏鸭攻毒后 12 小时， 每只注射 0.3ml 抗鸭病毒性 肝炎蛋黄抗体， 雏鸭保护率仅有 30% ； 雏鸭接种 DHV-JS 株攻毒后 12 小时 , 每只注射 0.5ml 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 雏鸭保护率达到 80% ； 雏鸭接种 DHV-JS 株攻毒后 12 小时 , 注射 1.0ml 抗鸭病毒性肝炎蛋黄抗体， 雏鸭保护率达到 100%。紧急治疗试验结果显示， 雏鸭注射 1.0ml 及以上。

42、蛋黄抗体， 可以完全保护雏鸭。 说 明 书 CN 103525772 A 9 1/2 页 10 SEQUENCE LISTING 江苏省农业科学院 一株鸭病毒性肝炎病毒及其应用 201310172 4 PatentIn version 3.3 1 20 DNA artificial 上游引物 1 atcagggtga ttccaaccag 20 2 20 DNA artificial 下游引物 2 ttggtctgat tcaatttcca 20 3 21 序 列 表 CN 103525772 A 10 2/2 页 11 DNA artificial 中间引物 3 ttcctggcac atc。

43、agaggca a 21 4 700 DNA 鸭病毒性肝炎病毒 1 型 DHV-JS 株 4 cgggtgaata acagtgtgtt ttctcatttt gagactgcaa atgtgccaat acaaggggag 60 tcgcacacct tggtgaaaca tctctttggc cgtcaatggc tggttcgtac tgttcaacat 120 actggtgagg tacaagagtt ggatttgcca gtgcctgatc agggtcatgc atctctgttg 180 cgcttctttg cctatttctc tggagaagtg attctgacca 。

44、ttgtcaacaa tggaacaaca 240 ccctgtatgg ttgcacactc ttatacaatg gacaatctca cttctgaata tgctgtcact 300 gccatggggg gtattcttat cccagcaaac tctgccaaga atattaatat tccattttat 360 tctgtcacac ctttacgccc cacacgaccc atgccagcat ctcagggggg tggcttgact 420 tttggcaggt tgtatatctg gacacaatca ggaagcgttt ctgtttttat gggcctcca。

45、c 480 aagccagctt tgtttttccc actgcctgca ccaacttaca caacacacac gctgttgaat 540 aagattgaaa ccatgaatct gcatgatcaa tcagatcagc cagactgcca tctgtgtgag 600 atttgcagga aaatgaagaa atggtttcgc aaccatcgcc catttcgctt ctgtttgaga 660 cttaaaacac ttgcctttga gctccatttg gaaattgtcc 700 序 列 表 CN 103525772 A 11 1/2 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103525772 A 12 2/2 页 13 图 3 说 明 书 附 图 CN 103525772 A 13 。