人脐带间充质细胞的获得方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103045537 A (43)申请公布日 2013.04.17 CN 103045537 A *CN103045537A* (21)申请号 201210531174.1 (22)申请日 2012.12.11 C12N 5/077(2010.01) (71)申请人 新疆医科大学第一附属医院 地址 830011 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 鲤鱼山南路 137 号新疆医科大学第一 附属医院科研科 (72)发明人 温浩 江明 马艳 卢晓梅 朱启英 毕晓娟 段显琳 (74)专利代理机构 乌鲁木齐合纵专利商标事务 所 65105 代理人 汤建武 周星莹 (54) 发明名称 人脐。

2、带间充质细胞的获得方法 (57) 摘要 本发明涉及生物医药技术领域， 是一种人脐 带间充质细胞的获得方法， 一种人脐带间充质细 胞的获得方法， 按下述步骤进行 ： 第一步， 在无菌 条件下人脐带活组织， 洗净， 切碎成组织碎块 ； 第 二步， 将组织碎块放入培养皿中， 并向其中加入低 糖混合培养液， 然后将培养皿放入CO2培养箱中进 行培养， 每3天至4天培养皿换一次低糖混合培养 液。本发明利用反复转移使脐带组织中的细胞反 复移出， 再将此细胞反复进行培养， 从而达到大量 获得细胞的目的， 生产效应在 100% 的基础上， 提 高细胞的收获量， 培养第3代获得4.041010个细 胞， 培养第。

3、 6 代获得 1.561012个细胞， 为临床组 织工程和基因治疗提供充足的细胞源。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于按下述步骤进行 ： 第一步， 在无菌条件下人脐带活组织， 洗净， 切碎成组织碎块 ； 第二步， 将组织碎块放入培养皿中， 并向其中加入低糖混合培养液， 然后将培养皿放入 CO2培养箱中进行培养， 每 3 天至 4 天培养皿换一次低糖混合培养液 ； 第三步， 待培养皿中的组织碎块周边有梭形细胞。

4、爬出时后， 将组织碎块移入新的培养 皿中内， 并向新的培养皿中加入低糖混合培养液， 放入 CO2培养箱中继续进行培养 ； 第四步， 反复重复第三步， 直至最后一次转移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形 细胞长出。 2. 根据权利要求 1 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于 CO2培养箱的培 养条件为 37、 3.6% CO2、 饱和湿度。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于第一步中将 活组织洗净后切碎成 2 mm3至 3mm3的小块。 4. 根据权利要求 1 或 2 或 3 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于在第四 步之后， 。

5、将每次转移出组织碎块后的培养皿底粘附的梭形细胞用低糖混合培养液培养， 当 细胞生长汇合为 80% 至 95% 后用胰蛋白酶消化获得细胞， 收集获得后的细胞， 离心， 弃上清 液， 计数细胞， 调节细胞浓度按要求密度重新接种入新培养皿中并向其中加入低糖混合培 养液， 待新培养皿内的细胞生长汇合达 80% 至 95% 后继续按此步骤进行消化。 5. 根据权利要求 4 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于胰蛋白酶的浓度 为 0.5g/L 至 2.5g/L， 其中还添加有 0.53mmol/L 的 EDTA-Na2。 6. 根据权利要求 4 或 5 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征。

6、在于离心条件为 转速为 1000r/min 至 1500r/min、 时间为 5min 至 10min。 7. 根据权利要求 4 或 5 或 6 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于进行重 新接种时的要求密度为 5103个细胞 /cm2培养皿底面积至 10103个细胞 /cm2培养皿底 面积。 8. 根据权利要求 1 或 2 或 3 或 4 或 5 或 6 或 7 所述的人脐带间充质细胞的获得方法， 其特征在于低糖混合培养液为向低糖 DMEM 培养液中分别加入胎牛血清、 L- 谷氨酰胺、 碳酸 氢钠、 L- 磷酸抗坏血酸和青 - 链霉素溶液形成混合培养液， 混合培养液中胎牛血清的体 。

7、积浓度为 15%、 L- 谷氨酰胺的浓度为 2mM、 碳酸氢钠的浓度为 10.2mM、 L- 磷酸抗坏血酸 的浓度为 50g/mL、 青霉素的浓度为 100u/ml、 链霉素的浓度为 100ug/ml。 权 利 要 求 书 CN 103045537 A 2 1/3 页 3 人脐带间充质细胞的获得方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 是一种人脐带间充质细胞的获得方法。 背景技术 0002 间充质干细胞 （MSC） 是源自中胚层的一类干细胞， 近些年研究发现 MSC 具有良好 的可塑性和扩增能力， 能为病损组织的修复再生提供祖细胞。Arnold I. caplan 认为 ：“利 。

8、用培养法扩增的间充质干细胞对特定组织进行的大量重建或修复， 已经远远超出了它们的 正常利用和实用范围。 ” 因此， 不同组织来源的间充质干细胞成为各研究组的研究热点。脐 带来源的 MSC 因来源充足且无创性， 扩增技术成熟， 成为许多研究小组设计大量扩增方案 的聚焦点。Ccile DB 研究组在培养第 3 代获得 7109个细胞 ； Fong CY 研究组的培养 方案脐带MSC的生产效应是100%， 获得的细胞数约为4106至5106个细胞/cm2脐带 ； 有 些研究技术使脐带的生产效应能达到 100% 但收获的细胞数却只够或不够一个病人的治疗 剂量 ； 有些研究技术脐带扩增到第 3 代的细胞。

9、数量是最多达 7109， 这些扩增方案的细胞 收获量均未突破 109个细胞。 发明内容 0003 本发明提供了一种人脐带间充质细胞的获得方法， 克服了上述现有技术之不足， 其能有效解决目前获取人脐带间充质细胞的方法收获人脐带间充质细胞的量过少而造成 无法满足治疗剂量的问题。 0004 本发明的技术方案是通过以下措施来实现的 ： 一种人脐带间充质细胞的获得方 法， 按下述步骤进行 ： 第一步， 在无菌条件下人脐带活组织， 洗净， 切碎成组织碎块 ； 第二 步， 将组织碎块放入培养皿中， 并向其中加入低糖混合培养液， 然后将培养皿放入 CO2培养 箱中进行培养， 每 3 天至 4 天培养皿换一次低。

10、糖混合培养液 ； 第三步， 待培养皿中的组织碎 块周边有梭形细胞爬出时后， 将组织碎块移入新的培养皿中内， 并向新的培养皿中加入低 糖混合培养液， 放入CO2培养箱中继续进行培养 ； 第四步， 反复重复第三步， 直至最后一次转 移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形细胞长出。 0005 下面是对上述发明技术方案的进一步优化或 / 和改进 ： 上述 CO2培养箱的培养条件可为 37、 3.6% CO2、 饱和湿度。 0006 上述第一步中可将活组织洗净后切碎成 2 mm3至 3mm3的小块。 0007 上述在第四步之后， 可将每次转移出组织碎块后的培养皿底粘附的梭形细胞用低 糖混合培养液培养， 当。

11、细胞生长汇合为80%至95%后用胰蛋白酶消化获得细胞， 收集获得后 的细胞， 离心， 弃上清液， 计数细胞， 调节细胞浓度按要求密度重新接种入新培养皿中并向 其中加入低糖混合培养液， 待新培养皿内的细胞生长汇合达 80% 至 95% 后继续按此步骤进 行消化。 0008 上述胰蛋白酶的浓度可为 0.5g/L 至 2.5g/L， 其中还添加有 0.53mmol/L 的 EDTA-Na2。 说 明 书 CN 103045537 A 3 2/3 页 4 0009 上述离心条件为转速可为 1000r/min 至 1500r/min、 时间为 5min 至 10min。 0010 上述进行重新接种时的要。

12、求密度可为5103个细胞/cm2培养皿底面积至10103 个细胞 /cm2培养皿底面积。 0011 上述低糖混合培养液可为向低糖 DMEM 培养液中分别加入胎牛血清、 L- 谷氨酰胺、 碳酸氢钠、 L- 磷酸抗坏血酸和青 - 链霉素溶液形成混合培养液， 混合培养液中胎牛血清 的体积浓度为 15%、 L- 谷氨酰胺的浓度为 2mM、 碳酸氢钠的浓度为 10.2mM、 L- 磷酸抗坏 血酸的浓度为 50g/mL、 青霉素的浓度为 100u/ml、 链霉素的浓度为 100ug/ml。 0012 本发明利用反复转移使脐带组织中的细胞反复移出， 再将此细胞反复进行培养， 从而达到大量获得细胞的目的， 生。

13、产效应在100%的基础上， 提高细胞的收获量， 培养第3代 获得4.041010个细胞， 培养第6代获得1.561012个细胞， 为临床组织工程和基因治疗提 供充足的细胞源。 具体实施方式 0013 本发明不受下述实施例的限制， 可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。 0014 下面结合实施例对本发明作进一步描述 ： 实施例 1， 该人脐带间充质细胞的获得方法按下述步骤进行 ： 第一步， 在无菌条件下人 脐带活组织， 洗净， 切碎成组织碎块 ； 第二步， 将组织碎块放入培养皿中， 并向其中加入低糖 混合培养液， 然后将培养皿放入 CO2培养箱中进行培养， 每 3 天至 4 天。

14、培养皿换一次低糖混 合培养液 ； 第三步， 待培养皿中的组织碎块周边有梭形细胞爬出时后， 将组织碎块移入新的 培养皿中内， 并向新的培养皿中加入低糖混合培养液， 放入 CO2培养箱中继续进行培养 ； 第 四步， 反复重复第三步， 直至最后一次转移的培养皿中的组织碎块周边不再有梭形细胞长 出。 0015 可根据实际需要， 对上述人脐带间充质细胞的获得方法作进一步优化或 / 和改 进 ： 实施例 2， 作为上述实施例的优选， CO2培养箱的培养条件为 37、 3.6% CO2、 饱和湿度。 3.6% CO2中的百分数为体积百分数。 0016 实施例 3， 作为上述实施例的优选， 第一步中将活组织洗。

15、净后切碎成 2 mm3至 3mm3 的小块。 0017 实施例 4， 与上述实施例的不同之处在于， 在第四步之后， 将每次转移出组织碎块 后的培养皿底粘附的梭形细胞用低糖混合培养液培养， 当细胞生长汇合为 80% 至 95% 后用 胰蛋白酶消化获得细胞， 收集获得后的细胞， 离心， 弃上清液， 计数细胞， 调节细胞浓度按要 求密度重新接种入新培养皿中并向其中加入低糖混合培养液， 待新培养皿内的细胞生长汇 合达 80% 至 95% 后继续按此步骤进行消化。80% 和 95% 分别为汇合生长后细胞总面积占培 养皿底面积的百分数。 0018 实施例5， 作为上述实施例的优选， 胰蛋白酶的浓度为0.5。

16、g/L至2.5g/L， 其中还添 加有 0.53mmol/L 的 EDTA-Na2。 0019 实施例6， 作为上述实施例的优选， 离心条件为转速为1000r/min至1500r/min、 时 间为 5min 至 10min。 说 明 书 CN 103045537 A 4 3/3 页 5 0020 实施例 7， 作为上述实施例的优选， 进行重新接种时的要求密度为 5103个细胞 / cm2培养皿底面积至 10103个细胞 /cm2培养皿底面积。 0021 实施例 8， 作为上述实施例的优选， 低糖混合培养液为向低糖 DMEM 培养液中分别 加入胎牛血清、 L- 谷氨酰胺、 碳酸氢钠、 L- 磷。

17、酸抗坏血酸和青 - 链霉素溶液形成混合培 养液， 混合培养液中胎牛血清的体积浓度为 15%、 L- 谷氨酰胺的浓度为 2mM、 碳酸氢钠的浓 度为 10.2mM、 L- 磷酸抗坏血酸的浓度为 50g/mL、 青霉素的浓度为 100u/ml、 链霉素的 浓度为 100ug/ml。 0022 实施例 9， 一种人脐带间充质细胞的获得方法按下述步骤进行 ： 第一步， 无菌条件 下将人脐带活组织切碎成 2 mm3至 3mm3的组织碎块 ； 第二步， 将组织碎块加入低糖混合培 养液中， 置入 37、 3.6%CO2培养箱中培养， 每 3 天至 4 天培养皿换一次低糖混合培养液 ； 第 三步， 培养15天。

18、至20天后见组织碎块周边有细胞移出， 并生长为梭形细胞时将组织碎块移 入新培养皿中， 新培养皿中加入半量新的低糖混合培养液对组织碎块继续培养， 3 天至 5 天 后组织碎块周边又有移出细胞长成梭形 ； 第四步， 此时将组织碎块再次移入新的培养皿中， 组织块反复转移至少可达 20 次以上， 直至培养的组织块周边不再有梭形细胞长成 ； 第五 步， 转移出组织碎块的培养皿加入半量新的低糖混合培养液对细胞继续培养， 当细胞培养 至 80% 至 95% 并成漩涡状时， 用胰蛋白酶消化细胞， 将收获细胞计数后按 8103/ cm2进行 分皿接种， 为培养的第一代细胞， 按此进行反复消化、 分皿接种和培养， 每轮细胞培养至第 3 代至 6 代。3.6% CO2中的百分数为体积百分数， 80% 和 95% 分别为汇合生长后细胞总面积 占培养皿底面积的百分数。 说 明 书 CN 103045537 A 5 。