含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法.pdf

《含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法.pdf（57页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN104244969A43申请公布日20141224CN104244969A21申请号201380018355722申请日2013013161/632,86820120201US61/634,75320120306USA61K38/55200601A61K38/00200601A61K9/08200601A61K9/6620060171申请人奥拉姆德有限公司地址以色列耶路撒冷72发明人亚伯拉罕赫斯赫克74专利代理机构隆天国际知识产权代理有限公司72003代理人王芝艳吴小瑛54发明名称含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法57摘要本发明提供了用于口服。

2、施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生前者的方法，和包含前者的组合物。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014093086PCT国际申请的申请数据PCT/IL2013/0500912013013187PCT国际申请的公布数据WO2013/114369EN2013080851INTCL权利要求书2页说明书35页序列表4页附图15页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书35页序列表4页附图15页10申请公布号CN104244969ACN104244969A1/2页21包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制。

3、剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白、二价阳离子的螯合剂和分离的BBI。2根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE测量，所述BBI已经纯化到至少85的纯度。3根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，通过BCA二羧基二喹啉的测定法，所述BBI已经纯化到大于95的蛋白质含量。4根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述BBI含有小于01高分子量杂质。5根据权利要求1所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含不同于所述BBI的胰蛋白酶抑制物。6根据权利要求5所述的口服药物组合物，其中，所述胰蛋白酶抑制物是KTI3。7根据权利要求6所。

4、述的口服药物组合物，其中，通过SDSPAGE测量，所述KTI3已经纯化到至少85的纯度。8根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3已经纯化到通过BCA测定法所测量的大于95的蛋白质含量。9根据权利要求6所述的口服药物组合物，其中，所述KTI3含有小于01高分子量杂质。10包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子的螯合剂，并且所述液态制剂具有抑制至少40MG胰凝乳蛋白酶/ML液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。11根据权利要求10所述的口服药物组合物，其中，所述液态制剂还包含抑制至少20MG胰蛋白酶/ML液态制剂的抗胰蛋。

5、白酶活性。12根据权利要求111中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素、干扰素、干扰素、生长激素、促红细胞生成素、GLP1、GLP1类似物、粒细胞集落刺激因子GCSF、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子、抗凝血因子、心钠素、表面活性蛋白ASPA、表面活性蛋白BSPB、表面活性蛋白CSPC、表面活性蛋白DSPD、纤维蛋白溶酶原激活物、铃蟾肽、造血生长因子集落刺激因子，多种、肿瘤坏死因子TNF蛋白、脑啡肽酶、RANTES活化时受调节，通常是T细胞表达和分泌、人。

6、巨噬细胞炎性蛋白MIP1、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子VEGF、神经营养因子、神经营养蛋白3、神经营养蛋白4、神经营养蛋白5或神经营养蛋白6NT3、NT4、NT5或NT6、神经生长因子、血小板衍生的生长因子PDGF、成纤维细胞生长因子、转化生长因子TGF、胰岛素样生长因子I和胰岛素样生长因子IIIGFI和IGFII、DES13IGFI脑IGFI、胰岛素样生长因子结合蛋白1IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5、IGFBP6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白BMP2、BMP7、集。

7、落刺激因子CSF、白介素IL、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化因子家族成员和补体因子。13根据权利要12求所述的口服药物组合物，其中，所述治疗性蛋白选自胰岛素和权利要求书CN104244969A2/2页3GLP1类似物。14根据权利要求113中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述螯合剂是EDTA。15根据权利要求中114任一项所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物的聚乙二醇PEG酯。16根据权利要求15所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂还包含游离的PEG。17根据权利要求15所述的口服药物组合物，其中，所述PEG酯作为以下。

8、的混合物提供A单酰甘油、二酰甘油、三酰甘油或其混合物；和B脂肪酸的聚乙二醇PEG酯。18根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中所述混合物的部分A包含C8C18单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油。19根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中，所述混合物的部分B包含C8C18脂肪酸的混合物的PEG单酯和二酯。20根据权利要求17所述的口服药物组合物，其中，所述混合物的部分A包含C8C18单酰甘油、二酰甘油和三酰甘油；所述混合物的部分B包含C8C18脂肪酸的混合物的PEG32单酯和二酯；所述基于油的液态制剂还包含C游离PEG32；并且所述混合物的部分A对所述混合物的部分B和C的总和的重量/重量比在1。

9、090和3070之间，包括端值。21根据权利要求20所述的口服药物组合物，其中，A、B和C一起占所述基于油的液态制剂的816重量/重量，包括端值。22根据权利要求1521中任一项所述的口服药物组合物，还包括非离子型去垢剂。23根据权利要求22所述的口服药物组合物，其中，所述非离子型去垢剂是基于聚山梨醇酯的去垢剂。24根据权利要求23所述的口服药物组合物，其中，所述基于聚山梨醇酯的去垢剂是聚山梨醇酯80。25根据权利要求24所述的口服药物组合物，其中，所述聚山梨醇酯80占所述基于油的液态制剂的310重量/重量，包括端值。26根据权利要求125中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述油是鱼油。27。

10、根据权利要求126中任一项所述的口服药物组合物，其中，所述基于油的液态制剂是无水的。28根据权利要求127中任一项所述的口服药物组合物，还包含抵抗胃中降解的包衣。29根据权利要求28所述的口服药物组合物，其中，所述包衣是PH敏感胶囊。30根据权利要求28所述的口服药物组合物，其中，所述包衣是软明胶胶囊。31根据权利要求130中任一项所述的口服药物组合物，用于向受试者口服施用治疗性蛋白。32根据权利要求130中任一项所述的口服药物组合物在制备向受试者口服施用治疗性蛋白的药物中的用途。33向受试者口服施用治疗性蛋白的方法，所述方法包括以下步骤向受试者施用根据权利要求130中任一项所述的口服药物组合。

11、物，由此向受试者口服施用治疗性蛋白。权利要求书CN104244969A1/35页4含有蛋白酶抑制物的组合物、包含前者的组合物和用于产生和使用前者的方法0001本申请要求2012年2月1日提交的美国临时申请61/632,868和2012年3月6日提交的美国临时申请61/634,753的权益，所述文献通过引用方式完整并入本文。技术领域0002本申请提供了用于口服施用治疗性蛋白的方法和组合物、改善的蛋白酶抑制物制备物，用于产生所述组合物的方法，和包含所述组合物的组合物。背景技术0003基于蛋白质/肽的药物一般易在胃肠道中降解和/或不被从小肠以生物活性形式有效吸收到血流中。正在开发用于基于蛋白质的药物。

12、如胰岛素的口服递送制剂ZIV等人,1994；NISSAN等人,2000，KIDRON等人,2004，ELDOR等人,2010A，ELDOR等人,2010B。一种此类口服胰岛素产品安排了II期试验的测试并且目前正在就IND状态评审。0004源自大豆GLYCINEMAX的胰蛋白酶抑制物可容易获得并且认为它们对人类消费是安全的。所述胰蛋白酶抑制物包括由抑制胰蛋白酶的KTIKUNITZ胰蛋白酶抑制物和抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的BBIBOWMANBIRK抑制物组成的SBTI大豆胰蛋白酶抑制蛋物。这类胰蛋白酶抑制物可获自，例如美国SIGMAALDRICH,STLOUIS,MO。用于制备BBI的方法描述在。

13、，例如US7,404,973中。0005发明概述0006发明人已经发现在药物组合物中使用时，市售SBTI制备物产生高度可变的结果。据推测，KTI和BBI的活性应当是各自优化的，以改善药物组合物的活性。为此目的，从商业来源获得SBTI作为KTI和BBI的独立制备物。但是，发现这些制备物均遭受另一种活性污染。使问题复杂化的是，发现制备物，特别是在大规模制备物中，BBI活性存在明显变异性，这一点通过防止肠道酶降解蛋白质例如胰岛素的可变能力得到印证。0007因此，根据本申请描述的某些实施方案，开发了纯化SBTI的改进方法，其中将每种产物按其自身规格制备达到高水平活性，并且使高分子量MW杂质的水平最小化。

14、。根据其他实施方案，该方法避免使用PEG和第二色谱步骤并且以较高产率为特征。根据其他实施方案，该产物特别合适用于药物组合物例如口服施用治疗性蛋白的组合物中。此外，根据其他实施方案，KTI活动和BBI活性的完全分离允许更精确调节包含治疗性蛋白和BBI和/或KTI的药物组合物的抗胰蛋白酶活性和抗胰凝乳蛋白酶活性，从而获得药物组合物的更稳健和/或可重复更高的体内活性。0008进一步发现需要乳化剂以便利地制备含有肽/蛋白质的药物的大规模制备物。然而，需要根据经验检验添加特定乳化剂是否可以在不影响制剂的口服功效情况下有效的防止在基于油的制备物中的沉淀。所描述的其他实施方案因此涉及特定乳化剂或乳化剂组合与。

15、改进的SBTI一起存在于含有治疗性肽和治疗性蛋白质的基于油的药物组合物中。0009术语“蛋白质”和“肽”在本文中互换使用。除非明确地指出限制，否则这两种术说明书CN104244969A2/35页5语的任一个均不旨在对存在的氨基酸的数目加以限制。附图说明0010以下图是说明性例子并且不意在视为限制要求保护的发明。0011图1SBTI纯化的流程图。ASBTI中间生产。B产生BBI和KTI的下游纯化。0012图2DEAE琼脂糖凝胶TMSEPHAROSETM柱分离的色谱图。在DEAE柱洗脱期间收集03L级分。0013图3纯化的BBI和KTI的SDSPAGE分析。进行电泳，扫描凝胶，并且使用IMAGES。

16、CANNERTMIII和IMAGEQUANTTMTL二者均来自GENERALELECTRIC定量条带。将每毫升1毫克MG/ML的样品加载于20PHASTGELTM上。泳道1对照老旧SBTI制备物。泳道2纯化的KTI，条带量100。泳道3纯化的BBI，下部条带量892，上部条带量108。0014图4使用改进的流程的小规模柱层析运行报道。方框、圆圈和三角形分别表示电导率曲线、PH和OD280。垂直轴电导率曲线毫西门子、PH和OD280任意单位。水平轴柱体积和级分编号。0015图5来自图4中所示层析的级分的20SDSPAGE。A从左至右显示级分418和汇集的级分511。“C”指现有技术的胰蛋白酶抑制。

17、物SIGMAALDRICH目录号T9003。B从右至左显示级分615，包括洗液通流物FLOWTHROUGHWFT和标准物来自大豆GLYCINEMAX的胰蛋白酶抑制物；“ST”。0016图6仅额外纯化BBI的步骤的SDSPAGE分析。ST标准物见图5图注，2MG/ML。泳道1来自柱的BBI汇集物。230KDA过滤的渗透物。3140稀释的30KDA过滤的截留物质。414稀释的5KDA浓缩的截留物质。0017图7仅纯化BBI的1MG/ML终产物的SDSPAGE分析。ST标准物见图5图注，1MG/ML。0018图8下游纯化BBI和KTI的改进方案的流程图。0019图9使用替代工序的柱层析运行报告。00。

18、20图10相对于标准物通道3，使用替代工序泳道12纯化的BBI的两份重复样品与标准物泳道3的SDSPAGE分析。0021图11各种乳化剂制剂的检验结果。泡沫形成评分为15，其中1表示无泡沫，5表示因泡沫而见不到液体。对于混悬试验，数字15分别表示完全相分离；具有一些较大油泡的部分相分离；小油泡，乳状稠度；起初无泡，稍后相分离；和稳定乳液。0022图12施用含有多种乳化剂的口服胰岛素制剂后的血糖曲线。A制剂A左上、B左下、C右上和D右下。B制剂E左和F右。0023图13患者记录薄。A血糖记录。B调查问卷。0024图14低血糖评审薄。对记录的低血糖的每次出现给予分数，同时根据经受的神经低血糖症状或。

19、缺少神经低血糖症状给予额外的评分。症状的定义的例子如下视觉，眼不能凝视、视力受损、复视；行为，不能睡眠、易怒、压力大、神经、“喜卧懒动WANTTOSITDOWNANDDONOTHING”；其他神经学，头晕、眩晕、虚弱、疲劳、犯困、行走或说话困难、反应迟缓、运动技巧迟缓、丧失平衡；意识模糊，不能进行简单算术、感觉“寂寞”。即便也存在一说明书CN104244969A3/35页6些神经低血糖症状，但如果存在充分警示即将发生低血糖的自主症状，则不给予分数。对需要外部帮助以确认或处理这个事件，给予额外分数。0025图15用各种剂量口服胰岛素治疗的受试者中的葡萄糖反应。0026实施方案的具体描述0027在。

20、一个方面，提供从大豆产品分离的BBI，根据在多种实施方案中通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法的测量，其中所述BBI是至少85纯的。在某些实施方案中，大豆产品是大豆粉。0028在又一个方面，提供从大豆粉分离的BBI，其中通过BCA双喹啉4羧酸测定法测量，BBI的蛋白质含量大于95。0029在又一个方面，提供从大豆粉分离的BBI，其中BBI含有小于01的高分子量杂质，例如，通过SDSPAGE和成像仪定量法所测定。0030在其他实施方案中，分离的BBI中存在的抗胰蛋白酶活性对抗胰凝乳蛋白酶活性的比率在151和11之间，包括151和11。在更具体的实施方案中，该。

21、比率可以在141111之间，包括141和111。在更具体的实施方案中，该比率可以在1351121之间，包括1351和121。在更具体的实施方案中，该比率可以是1281。0031除非另外指明，否则将本文中提及的抗胰凝乳蛋白酶活性利用具有40BTEE单位/MG胰凝乳蛋白酶活性的胰凝乳蛋白酶测量，并且以每MG的测试蛋白抑制的胰凝乳蛋白酶的MG数MG抑制的胰凝乳蛋白酶/MG测试蛋白表示。BTEE指N苯甲酰基L酪氨酸乙酯见SIGMAALDRICH第B6125号产品说明。0032除非另外指明，否则将本文中提及的抗胰蛋白酶活性利用具有10,000BAEE单位/MG胰蛋白酶活性的胰蛋白酶测量，并且以每MG的测。

22、试蛋白抑制的胰蛋白酶的MG数MG抑制的胰蛋白酶/MG测试蛋白表示。BAEE指NA苯甲酰基L酪氨酸乙酯溶液见SIGMAALDRICH第B4500号产品说明。例如，在常见的测定法中，一单位对应于将胰蛋白酶活性减少一个苯甲酰基L精氨酸乙酯单位BAEEU的抑制物的量。一个BAEEU是在PH76和25将253NM处吸光度增加0001/分钟的酶量。参见，例如，KOZAWA,MLASKOWSKI,1966,JBIOLCHEM2413955；和YBIRK,1976,METHENZYMOL45700。0033本领域技术人员理解，在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前，通常对关于其蛋白质含量、杂质水平或。

23、效力的上述每种纯度要求进行评定。0034在再一个方面，提供从大豆粉分离的KTI3，其中所述KTI3是至少85纯的，如在多种实施方案中通过SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法所测量。0035在又一个方面，提供从大豆粉分离的KTI3，其中KTI3的蛋白质含量大于95，如通过BCA测定法所测量。0036在又一个方面，提从大豆粉分离的KTI3，其中KTI3含有小于01的高分子量杂质，例如，如通过SDSPAGE和成像仪定量法所评定。0037本领域技术人员理解，在KTI3与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前，通常对关于其蛋白质含量、杂质水平或效力的上述每种纯度要求进行评定。0038在某些实施方案中，。

24、含有KTI3的药物组合物还包含在其与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前满足至少一种以上纯度要求的BBI。0039在某些实施方案中，配制上述的药物组合物用于口服施用。在更具体的实施方案说明书CN104244969A4/35页7中，该药物组合物还包含抵抗胃中降解的包衣。在甚至更具体的实施方案中，该包衣是PH敏感胶囊或可选地，是软明胶胶囊。0040在其他实施方案中，上述的药物组合物还包含达100千道尔顿的治疗性蛋白作为活性成分活性成分。在其他实施方案中，活性成分活性成分是对人消化道中降解或失活敏感的非蛋白质分子。0041在另一个实施方案中，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中所述基。

25、于油的液态制剂包含达100千道尔顿KDA的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和分离的BBI。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100KDA的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI和油组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100KDA的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、油和乳化剂组成。在其他实施方案中，该液态制剂基本上由达100KDA的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂、分离的BBI、油和两种乳化剂组成。0042在另一个方面，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中所述基于油的液态制剂包含达100千道尔顿KDA的治疗性蛋白、二价阳离子螯合剂和源自大豆的BBI，其中所述液态制。

26、剂含有小于005的分子量大于30,000的源自大豆的物质。0043在另一个方面，提供一种包含基于油的液态制剂的口服药物组合物，其中基于油的液态制剂包含达100KDA的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂，并且所述液态制剂具有至少抑制50MG胰凝乳蛋白酶/ML液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂具有至少抑制35、40、45、55或60MG胰凝乳蛋白酶/ML液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在另外的实施方案中，该液态制剂具有抑制3570、4070、4570、5070或4060MG胰凝乳蛋白酶/ML液态制剂的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂还包含至少抑制25MG胰蛋白酶/M。

27、L液态制剂的抗胰蛋白酶活性。在其他实施方案中，该液态制剂还包含至少抑制30、35、40、45或50MG胰蛋白酶/ML液态制剂的抗胰蛋白酶活性。或者，该液态制剂还包含抑制2550、3050、3550、2540或2545MG胰蛋白酶/ML液态制剂的抗胰蛋白酶活性。0044在另一个方面，提供一种用于制备药物组合物的方法，包括以下步骤A提供分离的BBI、达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂的制备物；和B将所述分离的BBI、治疗性蛋白和螯合剂混合至基于油的液态制剂中。可以将分离的BBI的鉴定IDENTITY、纯度和效力的本文所述每个实施方案并入该方法。此外，可以将其他成分的和可以存在的额外成分。

28、的本文所述每个实施方案并入该方法。在其他实施方案中，提供通过这种方法制备的药物组合物。0045在另一个方面，提供用于制备药物组合物的方法，包括将分离的BBI、达100千道尔顿的治疗性蛋白和二价阳离子螯合剂混合至基于油的液态制剂中的步骤。可以将分离的BBI的鉴定、纯度和效力的本文所述每个实施方案并入该方法。此外，可以将其他成分的和可以存在的额外成分的本文所述每个实施方案并入这种方法。在其他实施方案中，提供通过这种方法制备的药物组合物。0046如本文所用的“液体”指在20的粘度为11000包含1和1000毫帕斯卡秒的组合物。例如，鱼油在环境条件下是液体。该术语包括基于油的溶液、悬液及其组合。004。

29、7如本文所用的“分离的”BBI指相对于其他组分而言富含BBI的制备物。在更具体的实施方案中，BBI指BOWMANBIRK抑制物；UNIPROT编号P010552013年1月28日获得的说明书CN104244969A5/35页8数据库。0048BBI的代表性前体序列是0049MVVLKVCLVLLFLVGGTTSANLRLSKLGLLMKSDHQHSND0050DESSKPCCDQCACTKSNPPQCRCSDMRLNSCHSACKSCIC0051ALSYPAQCFCVDITDFCYEPCKPSEDDKENSEQIDNO1。0052这110个残基当中，残基119是信号肽，2039是前肽并且成熟链。

30、BBI链由残基4011071个AA组成。0053在多个实施方案中，在所述的方法和组合物中利用的BBI的制备物是至少85、90、92、94或95纯的，如通过SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法例如根据本文所述的方案所评定。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。在可选实施方案中，可以利用SDSPAGE和银染法，任选地随后利用成像仪定量法。0054在其他实施方案中，分离的BBI具有至少08、09、10、11、12、13或14MG抑制的胰凝乳蛋白酶/MG抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中、抗胰凝乳蛋白酶活性处于0818、0918、101。

31、8、1118、1218、1318或1418MG抑制的胰凝乳蛋白酶/MG抑制物的范围内。在更具体的实施方案中，该活性是0818MG抑制的胰凝乳蛋白酶/MG抑制物。在其他实施方案中，该活性处于0815MG抑制的胰凝乳蛋白酶/MG抑制物的范围内。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。0055在多种实施方案中，BBI制备物含有5或更少的KTI，如通过SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法根据本文所述的方案所评定。在可选实施方案中，可以利用SDSPAGE和银染法。0056在其他实施方案中，分离的BBI具有至少抑制08、09、10、11、12、13或1。

32、4MG胰凝乳蛋白酶/MG抑制物的抗胰凝乳蛋白酶活性。在其他实施方案中，抗胰凝乳蛋白酶活性为抑制0818、0918、1018、1118、1218、1318或1418MG胰凝乳蛋白酶/MG抑制物。在更具体的实施方案中，该活性是抑制0818MG胰凝乳蛋白酶/MG抑制物。在其他实施方案中，该活性为抑制0815MG胰凝乳蛋白酶/MG抑制物。在药物组合物的情况下，该值涉及在BBI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前BBI的特征。0057在多种实施方案中，BBI制备物含有5或更少的KTI，如通过SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法根据本文所述的方案所评定。在可选实施方案中，可以利用SDSPAGE和银染。

33、法。0058在更具体的实施方案中，如本文所用的KTI指KTI3UNIPROT编号P01070；2013年1月3日获得数据库。KTI3的代表性前体序列是0059MKSTIFFLFLFCAFTTSYLPSAIADFVLDNEGNPLENGGTYYILSDITAF0060GGIRAAPTGNERCPLTVVQSRNELDKGIGTIISSPYRIRFIAEGHPLSLK0061FDSFAVIMLCVGIPTEWSVVEDLPEGPAVKIGENKDAMDG0062WFRLERVSDDEFNNYKLVFCPQQAEDDKCGDIGISIDHDD0063GTRRLVVSKNKPLVVQFQKLDKESL。

34、AKKNHGLSRSESEQIDNO2。0064以上序列当中，残基124是信号肽，206216是前肽，成熟KTI链由残基说明书CN104244969A6/35页925205181个AA组成。0065在其他实施方案中，BBI制备物的蛋白质含量大于95，通过BCA测定法测量例如使用MICROBCA蛋白质分析试剂盒目录号23225，THERMOSCIENTICROCKFORD，IL。在药物组合物的情况下，该值涉及它与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前的特征。在其他实施方案中，BBI制备物含有小于01的高分子量杂质换而言之，分子量大于30,000的物质。在其他实施方案中，BBI已经在不使用聚乙二醇。

35、PEG的情况下分离。0066在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中的分离的BBI是重组BBI，例如已经工程化以表达BBI的微生物如细菌产生并随后分离的BBI。在另外的实施方案中，BBI是合成性BBI。合成性BBI的例子是已经在无细胞装置如肽合成仪中产生的BBI。肽合成仪，例如自动肽合成仪，是本领域熟知的并且是商业可获得的。本文还提供包含合成BBI的药物组合物。本文还提供包含合成性BBI的药物组合物。0067在某些实施方案中，描述的BBI是所描述的方法和组合物中的唯一蛋白酶抑制物。尽管较低效力的SBTI需要额外的蛋白酶抑制物，例如抑蛋白酶肽APROTININ，以有效地在人消化道中保护某些治疗。

36、性蛋白，但是认为描述的分离的BBI能够减少在这个方面对额外蛋白酶抑制物的需求。0068额外的蛋白酶抑制物0069在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂还包含不同于分离的BBI的胰蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂还包含不同于分离的KTI3的胰蛋白酶抑制物。根据本申请公开的内容，本领域技术人员理解，可以利用多种胰蛋白酶抑制物。在胰蛋白酶抑制物是蛋白质的情况下，大小一般将达100KDA。0070如本文所用，术语“胰蛋白酶抑制物”指能够抑制胰蛋白酶对底物的作用的任何物质。可以使用本领域熟知的测定法测量某物质抑制胰蛋白酶的能力。00。

37、71本领域已知的一些胰蛋白酶抑制物对胰蛋白酶特异，而其他则抑制胰蛋白酶和其他蛋白酶如胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶抑制物可以源自动物来源或植物来源例如大豆、玉米、利马豆和其他豆类、南瓜SQUASH、向日葵、牛和其他动物的胰和肺、鸡和火鸡的卵清、基于大豆的婴儿配方食品和哺乳动物血液。胰蛋白酶抑制物也可以是微生物来源的例如，抗痛素ANTIPAIN；见，例如，HUMEZAWA,1976,METHENZYMOL45,678。胰蛋白酶抑制物也可以是精氨酸模拟物或赖氨酸模拟物或其他合成性化合物例如芳基胍、苯甲脒、3,4二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸酯、甲磺酸加贝酯或苯基甲磺酰氟。如本文所用，精氨酸模拟物或赖氨酸模拟。

38、物是能够与胰蛋白酶的P1袋结合和/或干扰胰蛋白酶活性部位功能的化合物。0072在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的额外胰蛋白酶抑制物选自利马豆胰蛋白酶抑制物、抑蛋白酶肽又称作胰腺胰蛋白酶抑制物或碱性胰腺胰蛋白酶抑制物BPTI；UNIPROT编号P009742013年1月2日访问数据库、KAZAL抑制物胰分泌性胰蛋白酶抑制物、KAZAL抑制物胰分泌性胰蛋白酶抑制物、卵类粘蛋白、1抗胰蛋白酶、皮质醇结合球蛋白、中心素SERPINA9/GCET1生发中心B细胞表达的转录物1、PI6SUN等人1995、PI8SPRECHER等人1995、BOMAPIN、进化枝A丝氨酸蛋白酶抑制蛋白例如SE。

39、RPINA3NCBI基因ID12、SERPINA6NCBI基因ID866、SERPINA12NCBI说明书CN104244969A7/35页10基因ID145264、SERPINA10NCBI基因ID51156、SERPINA7NCBI基因ID6906、SERPINA9NCBI基因ID327657、SERPINA11NCBI基因ID256394、SERPINA13NCBI基因ID388007、SERPINA2NCBI基因ID390502和SERPINA4NCBI基因ID5104、YUKOPINSERPINB12；基因ID89777、抗痛素、苯甲脒、3,4二氯异香豆素、二异丙基氟磷酸酯和甲磺酸加。

40、贝酯。在其他实施方案中，选择以上抑制物之一。0073抑蛋白酶肽的代表性前体序列是0074MKMSRLCLSVALLVLLGTLAASTPGCDTSNQAKAQRPDFC0075LEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNF0076KSAEDCMRTCGGAIGPWENLSEQIDNO3。0077这100个残基当中，残基121是信号肽，2235和94100是前肽并且成熟链BBI链由残基369358个AA组成。0078在其他实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的基于油的液态制剂包含分离的BBI和分离的KTI两者，在更具体的实施方案中包含分离的BBI和分离的KT。

41、I3两者。如本文所用的“分离的KTI”指相对于其他组分富含KTI的制备物。在多种实施方案中，在所述的方法和组合物中利用的KTI制备物是至少85纯的，如通过SDSPAGE、亮蓝染色或成像仪定量法例如根据本文所述的方案所评定。在其他实施方案中，KTI制备物的蛋白质含量大于95，如通过BCA测定法所测量。在药物组合物的情况下，这些值涉及在KTI与药物组合物的一种或多种其他组分混合之前KTI的特征。在其他实施方案中，KTI制备物含有5或更少的BBI，如通过SDSPAGE所评定。在其他实施方案中，KTI制备物含有小于01高分子量杂质换而言之，分子量大于30,000的物质。在其他实施方案中，KTI已经在不。

42、使用PEG的情况下分离。0079在仍更具体的实施方案中，所描述的方法和组合物包含所描述的BBI和KTI，在更具体的实施方案中包含BBI和KTI3，作为仅有的蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，所描述的方法和组合物包含KTI和抑蛋白酶肽，在更具体的实施方案中包含KTI3和抑蛋白酶肽，作为仅有的蛋白酶抑制物。在其他实施方案中，分离的BBI、分离的KTI和抑蛋白酶肽均存在于该基于油的液态制剂中。0080在其他实施方案中，分离的KTI3具有至少抑制08、09、10、11、12或13MG胰蛋白酶/MG抑制物的活性。在其他实施方案中，KTI3的活性为抑制0818、0918、1018、1118、1218或131。

43、8MG胰蛋白酶/MG抑制物。在更具体的实施例中，KTI3的活性是抑制0817MG胰蛋白酶/MG抑制物。在其他实施方案中，该活性是抑制0814MG胰蛋白酶/MG抑制物。0081在其他优选实施方案中，分离的KTI是重组KTI，例如由已经工程化以表达KTI的微生物如细菌产生的KTI。在其他仍优选的实施方案中，KTI是合成性KTI。合成性KTI的例子是已经在无细胞装置如肽合成仪中产生的KTI。0082其他实施方案涉及所述药物组合物中存在的抗胰凝乳蛋白酶活性对组合物的抗胰蛋白酶活性的比率。在一些实施方案中，这个参数在151和11之间，包括151和11。在更具体的实施方案中，该比率可以在141111之间，。

44、包括141和111。在更具体的实施方案中，该比率可以在1351121之间，包括1351和121。0083在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的BBI和/或KTI如果存在说明书CN104244969A108/35页11的话已经随防腐剂一起储存。在其他实施方案中，BBI和/或KTI已经在不使用防腐剂的情况下制备并储存。0084在某些实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的BBI和/或KTI如果存在的话从大豆粉获得。术语“大豆粉”指从大豆GLYCINEMAX物种获得的粉末。在其他实施方案中，可以利用来自大豆属GLYCINE的任何物种。用于获得大豆粉的方法是本领域熟知的。所述的方法被认为适。

45、用于任何类型的大豆粉，而无论它怎样产生。0085治疗性蛋白0086在一些实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的治疗性蛋白在纳入所述的药物组合物中之前分离。在这个方面，“分离”排除将治疗性蛋白作为含有大量掺杂性蛋白质的均化组织制备物或其他形式提供。分离的蛋白质或肽的优选例子是重组蛋白或肽。一个甚至更优选的实施方案是合成性蛋白质，换而言之在无细胞装置中产生的蛋白质。本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，野生型和突变的治疗性蛋白均可以利用。0087某些蛋白质和肽已知是胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的特异性抑制物，包括但不限于本文所述的作为胰蛋白酶抑制物和/或胰凝乳蛋白酶抑制物的那些。这类蛋白质不旨在。

46、用作所述组合物中的治疗性组分，并且从本文所用的“治疗性蛋白”定义排除。0088本领域技术人员根据本申请公开的内容理解，多种治疗性蛋白可以用于所描述的方法和组合物中。在某些实施方案中，治疗性蛋白的大小是达100千道尔顿KDA，一般在1100KDA之间，包括1和100KDA。在更具体的实施方案中，该大小是达90KDA。在其他实施方案中，该大小是达80KDA。在其他实施方案中，该大小是达70KDA。在其他实施方案中，该大小是达60KDA。在其他实施方案中，该大小是达50KDA。优选地，该大小在190KDA之间，包括1和90KDA。在其他实施方案中，该大小在180KDA之间，包括1和80KDA。在其他。

47、实施方案中，该大小在170KDA之间，包括1和70KDA。在其他实施方案中，该大小在160KDA之间，包括1和60KDA。在其他实施方案中，该大小在150KDA之间，包括1和50KDA。0089适用于本文中的治疗性蛋白包括经修饰即，通过非氨基酸部分与蛋白质共价连接的衍生物。例如，但不限于，该蛋白质包括已经例如通过用已知保护基团/封闭基团糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化或衍生化所修饰的蛋白质。高分子量PEG可以在采用或不采用多功能接头的情况下，通过PEG与其N末端或C末端的位点特异性连接或通过赖氨酸残基上存在的氨基，与治疗性蛋白连接。另外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。0090在。

48、某些更具体的实施方案中，在所描述的方法和组合物中利用的治疗性蛋白选自胰岛素、流感血凝素、流感神经氨酸酶、胰高血糖素、干扰素、干扰素、干扰素、生长激素、促红细胞生成素、GLP1、GLP1类似物、粒细胞集落刺激因子GCSF、肾素、生长激素释放因子、甲状旁腺激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、降钙素、促黄体激素、胰高血糖素、凝血因子例如，因子VII、因子VIIIC、因子DC、组织因子TF和凝血酶、抗凝血因子例如蛋白质C、心钠素ATRIALNATRIURETICFACTOR、表面活性蛋白ASPA、表面活性蛋白BSPB、表面活性蛋白CSPC、表面活性蛋白DSPD、纤维蛋白溶酶原激活物例如，尿激酶或人尿或组织。

49、型纤维蛋白溶酶原激活物TPA、铃蟾肽BOMBESIN、造血生长因子又称作集落刺激因子，多种、肿瘤坏死因子TNF蛋白例如，TNF、TNF、TNF2、41BBL、脑啡肽酶、RANTES活化时受调节、通常由T细胞表达和分泌、人巨噬说明书CN104244969A119/35页12细胞炎性蛋白MIP1、血清白蛋白、缪勒管抑制物质、松弛素、小鼠促性腺素释放激素、DNA酶、抑制素、活化素、血管内皮生长因子VEGF、神经营养因子例如，脑衍生神经营养因子BDNF、神经营养蛋白3、4、5或6NT3、NT4、NT5或NT6、神经生长因子、血小板衍生的生长因子PDGF、成纤维细胞生长因子例如，FGF和FGF、转化生长因子TGF例如，TGF和TGF、包括TGF1、TGF2、TGF3、TGF4和TGF5、胰岛素样生长因子I和IIIGFI和IGFII、DES13IGFI脑IGFI、胰岛素样生长因子结合蛋白包括IGFBP1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP4、IGFBP5和IGFBP6、角质形成细胞生长因子、骨诱导因子、骨形态发生蛋白BMP2、BMP7、集落刺激因子CSF例如，MCSF和GMCSF、白介素IL例如IL1至IL13和IL15、IL18和IL23、超氧化物歧化酶、衰变加速因子、趋化。