核酸复合物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102791295 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102791295 A *CN102791295A* (21)申请号 201180009006.X (22)申请日 2011.02.11 1002413.1 2010.02.12 GB 61/304,087 2010.02.12 US A61K 47/48(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12N 15/87(2006.01) C12N 15/88(2006.01) A61K 38/08(2006.01) A61K 38/10(2006.01) A61K 38/16(20。

2、06.01) (71)申请人 普罗卡塔生物系统有限公司 地址 英国诺威奇诺福克 (72)发明人 M. 麦克阿瑟 (74)专利代理机构 北京市柳沈律师事务所 11105 代理人 岑晓东 (54) 发明名称 核酸复合物 (57) 摘要 本发明涉及转录因子诱饵的复合物、 其向细 菌的递送和其制剂。 具体地， 本发明在于一种抗细 菌复合物， 该抗细菌复合物包含核酸序列和选自 以下的一种或多种递送部分 ： 季胺化合物 ； 双氨 基烷烃类和其不饱和衍生物， 其中所述氨基烷烃 的氨基组分是形成杂环的一部分的氨基基团 ； 和 抗细菌肽。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.08.1。

3、0 (86)PCT申请的申请数据 PCT/GB2011/050263 2011.02.11 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/098829 EN 2011.08.18 (51)Int.Cl. 权利要求书 4 页 说明书 34 页 序列表 12 页 附图 21 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 4 页 说明书 34 页 序列表 12 页 附图 21 页 1/4 页 2 1. 一种抗细菌复合物， 包含 ： 核酸序列和至少一种递送部分， 其中所述递送部分选自 季胺化合物 ； 双氨基烷烃类和其不饱和衍生物， 其中所述氨基烷烃的氨基组分是形成杂环 的一。

4、部分的氨基基团 ； 和抗细菌肽。 2. 根据权利要求 1 所述的抗细菌复合物， 其中所述递送部分选自喹啉或吖啶的四价衍 生物和抗细菌肽。 3. 根据权利要求 2 所述的复合物， 其中所述递送部分是双喹啉鎓。 4. 根据权利要求 3 所述的复合物， 其中所述递送部分是地喹胺或其类似物。 5.根据权利要求4所述的复合物， 其中所述地喹胺类似物的烷基链具有8至14个甲基 基团。 6. 根据权利要求 5 所述的复合物， 其中所述烷基链具有 10 或 12 个甲基基团。 7. 根据权利要求 1 所述的复合物， 其中所述季胺化合物是 10， 10 -( 癸烷 -1， 10- 二 基 ) 双 (9- 氨基 。

5、-1， 2， 3， 4- 四氢吖啶 ) 二氯化物。 8. 根据权利要求 1 所述的复合物， 其中所述季胺化合物是 10， 10 -( 十二烷 -1， 12- 二 基 ) 双 (9- 氨基 -1， 2， 3， 4- 四氢吖啶 ) 二氯化物。 9. 根据权利要求 1 所述的复合物， 其中所述季胺化合物和双氨基烷烃类和其不饱和衍 生物选自式 (I) 的化合物 ： 其中 Q 选自 ： (a) 具有下式的基团 Q1： 和 (b) 基团 Q2、 Q2-NH-、 Q2-O- 或 Q2-S-， 其中 Q2选自具有 5 至 14 个环元的单环、 双环和三 环杂芳族基团， 其中 1、 2 或 3 个是选自 N、 。

6、O 和 S 的杂原子环元， 条件是存在至少一个氮环 元， 其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基 R4a取代， 且其中所述一个氮环元可形 成 N- 氧化物或可被 C1-4烷基、 苯基 -C1-4烷基或二 - 苯基 -C1-4烷基取代以形成四价基团， 其 中在所有情况下所述苯基部分任选地被一个或两个卤素、 甲基或甲氧基基团取代 ； m 是 0 或 1 ； n 是 0 或 1 ； p 和 q 是相同的或不同的， 且各自是 1 至 12 的整数 ； A 是键或选自萘、 联苯基、 萜苯基、 菲、 芴、 芪、 基团 C6H4(CH2)rC6H4、 基团 C6H4-C C-C6H4、 吡啶 -2， 6。

7、- 二基 - 双 ( 苯 -1， 4- 二基 ) 基团、 基团 CH CH-(CH2)s-(CH CH)t； 和基团 C C-(CH2)u-(C C)v- ； 其中 r 是 0-4， s 是 0 至 4， t 是 0 或 1 ； u 是 0-4 且 v 是 0 或 1 ； 当 n 是 1 时， R0、 R1和 R2各自选自 C1-4烷基 ； 且当 n 是 0 时， 则 N、 R1和 R2一起形成具有 5 至 14 个环元的单环、 双环或三环杂芳族基团， 其中一个是氮原子 N， 且 0、 1 或 2 个也是选 权 利 要 求 书 CN 102791295 A 2 2/4 页 3 自 N、 O 和。

8、 S 的杂原子环元， 并且其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基 R4b取代 ； 且 R3选自氢、 C1-4烷基、 卤素、 具有各自任选地被一个或两个取代基 R4c取代的 3 至 7 个环元 的单环碳环基团、 基团 Q ； 基团 -NH-Q2、 基团 -O-Q2和基团 -S-Q2； 且 R4a、 R4b和 R4c是相同的或 不同的， 且各自选自任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷基 ； 任选地被一个或多个氟 原子取代的C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单-和二-C1-4烷基氨基 ； 卤素 ； 苯基-C1-2烷基， 其中所 述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取。

9、代 ； 脲基和胍基。 10. 根据权利要求 9 所述的复合物， 其中所述式 (I) 的化合物由式 (II) 表示 ： 其中 R1、 R2、 m、 p、 A、 q 和 R3如权利要求 9 中所定义。 11.根据权利要求10所述的复合物， 其中R3是Q1且n在所有情形下是0， 且其中式(II) 的化合物由式 (III) 表示 ： 12. 根据权利要求 9 所述的复合物， 其中所述式 (I) 的化合物由式 (IV) 表示 ： 其中 ： p 和 q 是相同的或不同的， 且各自是 1 至 12 的整数 ； A 是键或选自萘、 联苯基、 萜苯基、 菲、 芴、 芪、 基团 C6H4(CH2)rC6H4、 基。

10、团 C6H4-C C-C6H4、 吡啶 -2， 6- 二基 - 双 ( 苯 -1， 4- 二基 ) 基团、 基团 CH CH-(CH2)s-(CH CH)t； 和基团 C C-(CH2)u-(C C)v- ； 其中 r 是 0-4， s 是 0 至 4， t 是 0 或 1 ； u 是 0-4 且 v 是 0 或 1 ； R8、 R9和 R10是相同的或不同的， 且各自选自氢 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4 烷基 ： 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单 - 和二 C1-4烷基氨基 ； 卤素、 苯基-C1-2烷基， 其中所述苯基部分任选地被一。

11、个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取 代 ； 脲基和胍基 ； 或 R9和 R10连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中 w 是 3 至 5 ； 且 R8a、 R9a 和 R10a是相同的或不同的， 且各自选自氢 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷基 ： 任 选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单-和二-C1-4烷基氨基 ； 卤素、 苯 基 -C1-2烷基， 其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取代 ； 脲 基和胍基 ； 或 R9a和 R10a连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中 w 是 3 至 5。 13. 。

12、根据权利要求 12 所述的复合物， 其中所述式 (IV) 的化合物由式 (V) 表示 ： 权 利 要 求 书 CN 102791295 A 3 3/4 页 4 其中 ： r 是 2 至 24 的整数 ； R8、 R9和 R10是相同的或不同的， 且各自选自氢 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4 烷基 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单-和二-C1-4烷基氨基 ； 卤素、 苯基-C1-2烷基， 其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取 代 ； 脲基和胍基 ； 或 R9和 R10连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中。

13、 w 是 3 至 5 ； 且 R8a、 R9a 和 R10a是相同的或不同的， 且各自选自氢 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷基 ： 任 选地被一个或多个氟原子取代的C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单-和二-C1-4烷基氨基 ； 卤素、 苯 基 -C1-2烷基， 其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取代 ； 脲 基和胍基 ； 或 R9a和 R10a连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中 w 是 3 至 5 ； 条件是 ： (i) 当 R10和 R10a均是氢或均是甲基， 且 R9和 R9a均是氢时， 则 R8和 R8a中的至少一个不 是氢、。

14、 氨基或二甲基氨基 ； 且 (ii) 当 R9和 R10连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中 w 是 4， 且 R9a和 R10a连接在一 起以形成亚烷基链 (CH2)w， 其中 w 是 4 时， 则 R8和 R8a中的至少一个不是氨基。 14. 根据权利要求 1 至 13 中的任一项所述的复合物， 其中所述抗细菌肽是天然存在的 肽。 15. 根据权利要求 1 至 13 中的任一项所述的复合物， 其中所述抗细菌肽是天然存在的 肽的肽模拟物或合成变体。 16. 根据权利要求 1 至 15 中的任一项所述的复合物， 其中所述抗细菌肽透化细菌细胞 膜。 17. 根据权利要求 15 所述的复。

15、合物， 其中所述抗细菌肽选自包括以下的组 ： 防御素、 鱼 类抗菌肽、 爪蟾抗菌肽、 蛙皮抗菌肽、 蜜蜂抗菌肽、 天蚕抗菌肽、 小菌素和片球菌素。 18. 根据权利要求 17 所述的复合物， 其中所述抗细菌肽选自包括以下的组 ： 短杆菌肽 和多粘菌素。 19. 根据权利要求 1 至 15 中的任一项所述的复合物， 其中所述抗细菌肽具有细胞内靶 标。 20. 根据权利要求 19 所述的复合物， 其中所述复合物还包含连接子。 21. 根据权利要求 20 所述的复合物， 其中所述连接子是羧基基团 - 至 - 伯胺交联剂。 22. 根据权利要求 21 或权利要求 22 所述的复合物， 其中所述连接子是。

16、 EDC。 23.根据权利要求19至22中的任一项所述的复合物， 其中所述抗细菌肽选自包括以下 的组 ： 抗生素、 糖肽抗生素、 阳离子多肽诸如聚赖氨酸和聚精氨酸。 24. 根据权利要求 23 所述的复合物， 其中所述抗细菌肽是 Buforin 或其衍生物。 权 利 要 求 书 CN 102791295 A 4 4/4 页 5 25. 根据权利要求 1 至 24 中的任一项所述的复合物， 其中所述核酸序列包含转录因子 的天然细胞结合位点的序列。 26. 根据权利要求 25 所述的复合物， 其中所述天然细胞结合位点包含细菌 Sig 结合位 点的序列。 27.根据权利要求26所述的复合物， 其中所。

17、述核酸序列具有SEQ ID NO ： 9、 10、 30和31、 39、 40 或 41 所列的序列。 28. 根据权利要求 25 所述的复合物， 其中所述天然细胞结合位点包含细菌 Fur 结合位 点的序列。 29.根据权利要求28所述的复合物， 其中所述核酸序列具有SEQ ID NO ： 11、 12或13所 列的序列。 30. 一种抗细菌复合物， 包含 ： a) 包含转录因子的天然细胞结合位点的序列的核酸序列， b)10， 10 -( 十二烷 -1， 12- 二基 ) 双 (9- 氨基 -1， 2， 3， 4- 四氢吖啶 ) 二氯化物 ； 和任 选地 c) 抗细菌肽。 31. 根据权利要求。

18、 30 所述的复合物， 其中所述核酸序列具有 SEQ ID NO ： 30 和 31 所列 的序列。 32. 根据权利要求 1 至 31 中任一项所述的复合物用于治疗细菌感染的用途。 33. 一种药物组合物或药物， 包含根据权利要求 1 至 32 中的任一项所述的复合物和生 理上可接受的载体或赋形剂。 34. 根据权利要求 33 所述的药物组合物或药物， 用于治疗细菌感染。 权 利 要 求 书 CN 102791295 A 5 1/34 页 6 核酸复合物 0001 本发明涉及核酸序列的复合物。 具体地， 本发明涉及转录因子诱饵的复合物、 其向 细菌的递送和其制剂。 0002 细菌生长和毒性的。

19、控制形成了日益增加的问题， 尤其是在医学和兽医学应用中， 并可成为公共健康的重大挑战。 用于抵抗病原性细菌的抗生素是本领域熟知的。 然而， 此类 抗生素的广泛使用已导致对至少一种、 以及在一些情形下多种抗生素具有抗性的细菌 ( 所 谓的多药抗性菌株 ) 的出现。已发现的传统抗生素和开发中的抗生素数量的下降加剧了这 一形势。 事实上， 抗生素抗性是抗细菌研究的重大挑战， 并危及市售抗生素以及那些仍处于 开发中的抗生素的效力。 因此， 存在对可用于阻碍细菌传播和感染的新的抗细菌剂的需要。 0003 基于 DNA 的治疗具有克服现有抗细菌治疗的限制的潜能， 因为它们可以被设计为 通过以下方式治疗潜在。

20、的任何病原体 ： 阻止编码抗生素抗性机制的基因的表达， 或通过改 变关键或适应性基因或操纵子的表达抑制生长， 或类似地阻止毒性或致病性的发作。 另外， 细菌不可能发展出针对这些剂的抗性， 因为这将需要影响转录因子和其关联结合位点二者 的同时突变。这对于控制多个关键基因的剂尤其如此。可选地， 可通过突变使得基因组成 型表达而使基因逃避转录因子诱饵介导的控制。然而， 在转录因子诱饵同时作用于许多基 因的情形下， 将需要这些基因中的许多基因获得突变以使它们转换为组成型表达， 这是被 视为不可能的事件。 0004 转录因子诱饵 (TFD) 是一种此类基于 DNA 的治疗剂。诱饵寡核苷酸被设计为模拟 转。

21、录因子的结合位点并阻止后者与它们的关联基因组靶标结合， 从而改变基因表达 (Mann 和 Dzau(2000)J.Clin. 0005 TFD 具有超过其他基于 DNA 的治疗剂的显著优点。其作用机制是简单且可预测 的 - 它们通过掩蔽转录因子来控制基因表达， 通过使细胞充满足量拷贝的特异结合序列而 阻止后者与启动子结合 ( 因此， 术语” 诱饵” )。这与其中由于 mRNA 的复杂二级结构而难以 限定靶标的反义策略相反。与反义方法相比， TFD 具有作用迅速、 阻止基因表达的另外的优 点， 而反义方法涉及表达的结果。因此， TFD 在极低的浓度下有效， 因为单一 TFD- 转录因子 相互作用。

22、可阻断单一基因的转录， 而单一基因可以产生成千上万拷贝的 mRNA， 而 mRNA 构成 反义方法的靶标。 0006 其他基于 DNA 的治疗剂包括含有用于基因治疗的质粒、 用于反义和反基因应用 的寡核苷酸 (Crooke ST.(1998)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.8 ： 115-122)、 核酶、 DNA 酶、 适体和小干扰 RNA(siRNA)(Stull R.A. 等 (1995)Pharm Res.12 ： 465-483 ； Patil S.D. 和 Burgess D.J.(2003)AAPS Newsmagazine6 ： 27)。尽管大多。

23、数基于 DNA 的药物处于 临床前开发或临床试验的早期阶段， 但是近年来已出现了这一类化合物以产生针对包括以 下的广泛范围的疾病的药物治疗的极有希望的候选物 ： 癌症、 AIDS、 神经疾患诸如帕金森病 和阿尔茨海默病以及心血管疾患。 0007 然而， 包括 TFD 在内的基于 DNA 的治疗剂的递送仍是重大的挑战。当递送大的亲 水性治疗剂诸如蛋白质或核酸时， 细胞膜是遇到的主要障碍之一。解决此问题的大多数努 力集中于递送至真核细胞， 以开发用于人类癌症等的有效治疗。 在真核细胞中， 不同的细胞 说 明 书 CN 102791295 A 6 2/34 页 7 区室 ( 包括核 ) 受到生物膜的。

24、保护， 生物膜隔离不同的细胞区室并阻止溶质从细胞和细胞 器的流入和流出。尽管这些屏障对于细胞的维持是必要的， 但是当试图向细胞或细胞内的 特定细胞器递送治疗剂时， 这些屏障是实质的问题。 0008 由于细胞膜的疏水性内部产生的大的自由能障碍， 大多数阳离子在没有特异性载 体系统下不能通过细胞膜。为了被细胞选择性积累和保留， 阳离子化合物需要足够的亲脂 性和其正电荷的离域以降低当从水环境移至疏水环境时的自由能变化。 这允许该化合物被 动穿过质膜和线粒体膜并响应于膜电位而积累。 0009 蛋白质进入真核细胞的转运主要通过内吞介导。这是高度组织化的转运系统， 其 中大的极性分子通过被吞食到细胞膜内而。

25、被吸附。 吞噬作用和胞饮作用是非受体介导的形 式的内吞， 而受体介导的内吞是更加特异的主动事件， 其中细胞质膜向内折叠以形成有被 小窝。在这种情形下， 蛋白质或其他触发颗粒受困于细胞质膜中的受体 / 配体或受困于与 细胞表面的非特异性相互作用， 例如由于电荷相互作用。仅到那时颗粒才被吞食。这些向 内出芽的小泡出芽形成细胞质小泡。 0010 已开发了多种技术来体内和体外将生物活性分子易位跨过这些屏障。 电穿孔和显 微注射对于体内使用是苛刻且不实际的， 因为这些方法在可以将物质引入细胞之前必须破 坏细胞膜， 并且因此它们限于有限量的细胞。 0011 虽然使用内吞途径是有吸引力的， 但是一个重要的缺。

26、点是确保在溶酶体活性发生 之前的内体逃脱。脂质体包囊和受体介导的内吞也受到其缺乏靶向和低递送效率的限制。 迄今进行的大多数探索工作集中于向真核细胞递送 siRNA 分子。通常采用的方法是与共价 连接的靶向肽形成脂质体或复合物， 靶向肽指导治疗剂到达细胞内的合适靶标。 0012 当选择用于此类递送机制的脂质组分时有许多考虑因素。 脂质样组分通常是阳离 子并具有三种功能 ： 0013 1. 压缩核酸以使递送更易实现 ； 0014 2. 保护核酸不被核酸酶降解或不被质膜蛋白等非特异性吸附， 和 0015 3. 遮蔽磷酸主链的负电荷。 0016 第三点可通过使用具有减少的电荷或没有电荷的合成主链来克服。

27、。 0017 另外， 脂质体或复合物需要某些理想的物理性质 ： 0018 1. 良好的稳定性， 不论是在盐溶液或生物液中。这可用测量颗粒之间的吸引或排 斥的 - 电位来定量 ； 0019 2. 窄的大小分布， 对于细菌理想地在介于 50 和 100nm 之间 ； 0020 3. 较低的毒性， 尽管大多数转染剂 ( 脂质、 亲脂性阳离子 ) 显示中等水平的毒性 ； 0021 4. 能够实际生产， 考虑诸如货物成本的问题。 0022 通常已知用于真核递送的肽透化膜， 经由靶细胞上的特异性受体穿透细胞， 或简 单地是阳离子(如聚精氨酸)。 使用具有细胞穿透性质的肽具有几种优点， 这主要是由于可 以对。

28、肽序列进行各种修饰。这允许工程化定位不同细胞亚域和 / 或能够转运不同类型的货 物的载体。 0023 一类膜易位剂是细胞穿透肽 (CPP)。除了是体外进入不同细胞器的温和且有效的 工具之外， CPP 已用于几种剂的体内细胞递送， 具有有希望的结果。 0024 CPP 通常由少于 30 个氨基酸组成， 具有净正电荷， 且能够易位穿过质膜和以看似 说 明 书 CN 102791295 A 7 3/34 页 8 能量依赖的方式转运几种货物进入细胞质和核。易位经由不受各种内吞抑制剂或低温影 响的目前未知的机制发生 (Langel，编 (2002)Cell-Penetrating Peptides， P。

29、rocesses and Applications， CRC Press)。 0025 术语 CPP 包括合成的细胞穿透肽、 蛋白转导结构域和膜易位序列， 其全部具有易 位穿过细胞膜和进入细胞内部的能力。 0026 具有实现递送至尤其是细菌的潜能的其他类别的肽是具有抗细菌性质的那些肽。 这些肽包括抗微生物肽 (AMP)、 细胞穿透肽 (CPP)、 非核糖体合成的那些肽和糖肽。所有这 些类型的肽在本文被称为抗细菌蛋白 (ABP)。 0027 AMP 可来源于细菌来源， 此时它们被称为细菌素， 或来自高等真核来源， 包括人、 两栖类、 昆虫等。特别感兴趣的 AMP 是能够增加生物膜的穿透性或者具有。

30、易位穿过膜以 到达其细胞内靶标的能力的那些。AMP 基于结构相似性一般分为五个不互相排斥的亚组 (Brogden， 2005 Nat.Rev.Microbiol.3 ： 238-250) ： 0028 1. 阴离子肽是通常与锌复合的小肽， 并针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌具有活 性 ； 0029 2.通常长度少于40个氨基酸、 缺乏半胱氨酸并以两个-螺旋区之间的中央铰链 区为特征的线性阳离子 - 螺旋肽 ( 诸如 buforin) ； 0030 3. 富集特定氨基酸的阳离子肽， 诸如富含脯氨酸和富含精氨酸的蜜蜂抗菌肽 (apidaecin) ； 0031 4. 由于在半胱氨酸基团之间形成二硫键。

31、而形成 - 折叠的阴离子和阳离子肽 ； 0032 5. 为较大蛋白质的片段的阴离子和阳离子肽。 0033 AMP实现微生物杀伤的机制是不同的， 并且不局限于某些亚组。 绝大多数通过在细 菌的膜上形成孔、 导致细胞被透化来杀伤细菌。 认为存在三种截然不同的透化机制， 其可以 是肽的特定性质或是所用的肽的浓度的作用 ： 0034 1. 形成环形孔， 例如， 爪蟾抗菌肽 (magainin)、 蜂毒肽 ； 0035 2. 毯状物形成 (Carpet formation)， 例如， dermaseptin S、 杀菌肽或蜂毒肽 ； 0036 3. 桶板形成 (Barrel stave formatio。

32、n)， 例如， 丙甲菌素。 0037 已描述了几种其中最终靶标不是膜而是细胞内性质的 AMP， 使得 AMP 必须易位穿 过膜。 此易位能力是特别值得关注的， 因为这些肽、 或基于其建模的合成肽可用于递送可选 的货物诸如治疗剂。因此这些 AMP 可根据其胞内杀伤模式来分类 ： 0038 1. 结合核酸， 例如， buforin、 buforin II 和类似物以及速普肽 (tachyplesin) ； 0039 2. 胞内内容物的絮凝， 例如， 阴离子肽 ； 0040 3. 隔膜形成， 例如， 小菌素 (microcin)25 ； 0041 4. 细胞壁合成， 例如， mersacidin ；。

33、 0042 5. 抑制核酸合成， 例如， pleurocidin 和蛙皮抗菌肽 (dermaseptin) ； 0043 6. 抑制蛋白质合成， 例如， pleurocidin 和蛙皮抗菌肽 ； 0044 7. 抑制酶活性， 例如， 蜜蜂抗菌肽。 0045 非核糖体合成的肽可以是结构上多样的。它们经常是环化的或分支的， 含有非标 准氨基酸或已被修饰以产生羟基丙氨酸或羟基丝氨酸的氨基酸， 并可进行羟基化、 卤化或 糖基化 (Walsh 等 (2004)Science303 ： 1805-1810)。这些肽的绝大多数通过透化细菌的膜 说 明 书 CN 102791295 A 8 4/34 页 9 。

34、来抑制细菌生长。 0046 向细菌递送肽和核酸的挑战与对真核细胞遇到的那些相似， 但是细胞组分是不同 的。具体地， 细菌不具有内吞机制来帮助将治疗剂移到细胞内。然而， 一个明显的优点是细 菌不具有核区室， 所以将治疗剂递送到细胞质足以使其接近细菌基因组。因此， 需要开发 真核递送系统的替代系统。这包括发现通过透化膜进入细胞的途径。在实验室环境下， 向 细胞递送DNA(转染)通过用阴离子缓冲液、 最常见的是含有钙离子的缓冲液处理细胞来实 现， 阴离子缓冲液通过干扰电荷分布破坏细胞膜。可选地， 使用电穿孔， 其中在具有低电导 的缓冲液中制备细胞， 并使用高电压来在一些尽管并不是全部细胞的细菌膜上产。

35、生瞬时的 孔， 导致少量细胞的转染。 0047 显然在动物模型或临床环境下使用任一种方法向细菌递送 DNA 治疗剂都是不切 实际的。 体内转染可通过将治疗剂缀合到已知破坏膜并导致通过随后的孔或挤压进入的合 成的阳离子肽或 ABP 实现。另外， 一些 ABP 易位通过膜的能力是开发可信赖的递送策略的 另一替代方案。 0048 从使用递送肽的真核模型出发， 细菌递送肽的理想特征包括 ： 0049 1. 细菌特异性 / 偏好性， 优化用于原核生物而不是真核生物 ； 0050 2. 诱发抗性的低可能性。例如， 改变其外膜电荷密度的 MRSA 可抵抗阳离子肽 ； 0051 3. 广谱活性， 迄今为止用作。

36、至细菌的通用递送系统 ； 和 0052 4. 低或无宿主毒性。 0053 相似地， 使用脂质样转运分子需要针对细菌膜的特定结构量身定制。 例如， 革兰氏 阴性细菌具有外膜和内膜， 在将治疗剂递送至细菌内之前需要克服这两种膜。 0054 在这一背景下， 本发明提供了核酸序列诸如 TFD 的制剂和其向细菌的递送的解决 方案。 0055 具体地， 本发明在于一种抗细菌复合物， 该抗细菌复合物包含核酸序列和一种或 多种递送部分。本发明人已发现自身具有一些抗细菌活性的递送部分是理想的。具体地， 一种或多种递送部分当与核酸序列组合时应显示协同的抗细菌作用。换言之， 递送部分和 核酸序列的组合当与核酸序列或。

37、递送部分单独的作用相比时应显示增强的抗细菌作用。 0056 递送部分可选自季胺化合物和双氨基烷烃类和其不饱和衍生物， 其中如本文所用 的术语” 氨基烷烃类” 指形成杂环的一部分的氨基基团 ( 优选地三价氨基基团 )。 0057 此类化合物的示例是式 (I) 的化合物 ： 0058 0059 其中 Q 选自 ： 0060 (a) 具有下式的基团 Q1： 0061 说 明 书 CN 102791295 A 9 5/34 页 10 0062 和 0063 (b) 基团 Q2、 Q2-NH-、 Q2-O- 或 Q2-S-， 其中 Q2选自具有 5 至 14 个环元的单环、 双环 和三环杂芳族基团， 其。

38、中 1、 2 或 3 个是选自 N、 O 和 S 的杂原子环元， 条件是存在至少一个氮 环元， 其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基 R4a取代， 且其中所述一个氮环元可 形成 N- 氧化物或可被 C1-4烷基、 苯基 -C1-4烷基或二 - 苯基 -C1-4烷基取代以形成四价基团， 其中在所有情况下所述苯基部分任选地被一个或两个卤素、 甲基或甲氧基基团取代 ； 0064 m 是 0 或 1 ； 0065 n 是 0 或 1 ； 0066 p 和 q 是相同的或不同的， 且每一个均是 1 至 12 的整数 ； 0067 A 是 键 或 选 自 萘、 联 苯 基、 萜 苯 基、 菲、 芴、。

39、 芪、 基 团 C6H4(CH2)rC6H4、 基 团 C6H4-C C-C6H4、 吡啶 -2， 6- 二基 - 双 ( 苯 -1， 4- 二基 ) 基团、 基团 CH CH-(CH2)s-(CH CH)t- ； 和基团 C C-(CH2)u-(C C)v- ； 其中 r 是 0-4， s 是 0 至 4， t 是 0 或 1 ； u 是 0-4 和 v 是 0 或 1 ； 0068 当 n 是 1 时， R0、 R1和 R2各自选自 C1-4烷基 ； 且当 n 是 0 时， 则 N、 R1和 R2一起形成 具有 5 至 14 个环元的单环、 双环或三环杂芳族基团， 其中一个是氮原子 N， 。

40、且 0、 1 或 2 个也 是选自N、 O和S的杂原子环元， 并且其中所述杂芳族基团任选地被一个或两个取代基R4b取 代 ； 且 R3选自氢、 C1-4烷基、 卤素、 具有各自任选地被一个或两个取代基 R4c取代的 3 至 7 个 环元的单环碳环基团、 基团 Q ； 基团 -NH-Q2、 基团 -O-Q2和基团 -S-Q2； 且 R4a、 R4b和 R4c是相同 的或不同的， 且各自选自任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷基 ： 任选地被一个或多 个氟原子取代的C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单-和二-C1-4烷基氨基 ； 卤素 ； 苯基-C1-2烷基， 其 中所述苯基部分任选地。

41、被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取代基取代 ； 脲基和胍基。 0069 在一个优选的实施方案中， Q 是基团 Q1： 0070 0071 因此， 式 (I) 内的一个优选的化合物亚组由式 (II) 表示 ： 0072 0073 其中 R1、 R2、 m、 p、 A、 q 和 R3如关于式 (I) 所定义的。 0074 其中 R3是 Q1且 n 在所有情形下是 0 的式 (II) 内的一个优选的化合物亚组可由式 (III) 表示 ： 0075 说 明 书 CN 102791295 A 10 6/34 页 11 0076 其中 R1、 R2、 m、 p、 A 和 q 如关于式 (I) 所定义的。 。

42、0077 在式 (I)、 (II) 和 (III) 的化合物中， 当 m 是 1 时， 氮原子 N 必须是四价氮。因此， 其中 m 是 1 的式 (I)、 (II) 和 (III) 的化合物将包含一种或多种阴离子作为反荷离子， 例如 来自矿物酸、 磺酸和羧酸的阴离子。 0078 当 N、 R1和 R2一起形成具有 5 至 14 个环元的单环、 双环或三环杂芳族基团时， 该基 团通常含有氮原子 N 作为唯一的杂原子环元或含有选自 N、 O 和 S 的第二杂原子环元。 0079 当 N、 R1和 R2一起形成单环、 双环或三环杂芳族基团时， 氮原子 N 形成芳族环的一 部分。优选的杂芳族基团是单环。

43、芳族环 ； 其中两个环均是芳族环的双环杂环 ； 其中一个含 氮环是芳族环而另一个环是非芳族环的双环杂环 ； 和其中包括含氮环在内两个环是芳族环 而另一个环是非芳族环的三环。 0080 当 N、 R1和 R2一起形成具有 5 至 14 个环元的单环、 双环或三环杂环基团时， 该杂环 基团优选地选自喹啉 ； 异喹啉 ； 吖啶 ； 四氢吖啶和其环同系物 ； 吡啶 ； 苯并咪唑 ； 苯并噁唑 和苯并噻唑。所谓四氢吖啶的环同系物意指含有以下核心结构的化合物 ： 0081 0082 其中 y 是 1 或 3。所述四氢吖啶意指具有其中 y 是 2 的以上核心结构的化合物。 0083 在优选的实施方案中， 递。

44、送部分是喹啉或吖啶的四价衍生物， 特别是 1， 2， 3， 4- 四 氢 -9- 氨基 - 吖啶。1， 2， 3， 4- 四氢 -9- 氨基 - 吖啶的合适衍生物描述于 US 3519631， 其内 容通过引用并入本文。尤其感兴趣的是 US 3519631 的实施例 17 至 25 中示例的化合物和 式以及其类似物。合适的喹啉衍生物是双喹啉鎓 (bis-quinolinium) 化合物， 诸如地喹胺 (dequalinium) 及其类似物。 0084 地喹胺 ( 图 1) 是双喹啉鎓化合物， 具有温和的抗微生物性质， 并已作为抗微生 物剂在非处方漱口水、 局部软膏剂、 口腔和阴道涂剂和咽喉痛锭。

45、剂中使用 30 年。它是局 部抑菌剂并还作为钙通道抑制剂、 抗真菌剂 (Ng 等 (2007)Bioorg.Medicinal Chem.15 ： 3422-3429)、 结 核 病 抑 制 剂 (Guiterrez-Lugo 等 (2009)J.Biomol.Screen.14 ： 643-652) 和作为蛋白激酶 C 抑制剂 (PKC ； Abeywickrama 等 (2006)Bioorg.Medicinal Chem.14 ： 7796-7803) 进行了测试。 0085 地喹胺还已在体外实验中用于递送基于 DNA 的治疗剂和传统药物诸如 paxcitol 至线粒体。在这些实验中， 。

46、地喹胺通过干膜法制备为 bolasome。即， 将地喹胺溶解在有 机溶剂诸如甲醇中， 在真空中完全干燥， 然后重悬于水溶液中， 由此进行声处理以形成 bolasome， 随后将其与 DNA 混合以形成复合物。已显示这些复合物能够通过被认为涉及复 合物与线粒体外膜融合的机制递送 DNA 到线粒体 (Weissig 和 Torchilin 2001 Adv.Drug Delivery Rev.49 ： 127-149 ； Weissig 等 2001 J.Control.Release 75 ： 401-408)。虽然线 粒体的膜结构与细菌中发生的膜结构不同， 但是其是相似的。这增加了在体内环境中。

47、地喹 说 明 书 CN 102791295 A 11 7/34 页 12 胺可适于递送治疗剂至细菌的可能性。然而， 与地喹胺形成的复合物在生理缓冲液和生物 液以及稀释存在下是随时间不稳定的。 0086 因此， 在特别优选的实施方案中， 复合物包含地喹胺类似物。以这种方式， 可能设 计具有增强的稳定性 ( 对稀释和盐的存在 ) 但又具有与地喹胺相似或改进的毒性特征的 地喹胺化合物。已描述这种类似物形成更稳定的复合物 ( 化合物 7， Galanakis 等 J.Med. Chem.(1995)35 ： 3536-3546)， 如通过诸如以下的各种物理化学参数所测试的 ： 结合 DNA 以 排除荧。

48、光染料 SYBR-green 的能力、 通过动态光散射 (Dynamic Light Scattering) 测量 和用电子显微术观察的所形成的粒径和它们在高浓度盐以及稀释和长期储存下的稳定性 (Weissig 等 (2001)S.T.P.Pharma Sciences 11 ： 91-96)。 0087 地喹胺和其类似物的实例是式 (IV) 的化合物 ： 0088 0089 其中 ： 0090 p 和 q 是相同的或不同的， 且各自是是 1 至 12 的整数 ； 0091 A 是 键 或 选 自 萘、 联 苯 基、 萜 苯 基、 菲、 芴、 芪、 基 团 C6H4(CH2)rC6H4、 基 。

49、团 C6H4-C C-C6H4、 吡啶 -2， 6- 二基 - 双 ( 苯 -1， 4- 二基 ) 基团、 基团 CH CH-(CH2)s-(CH CH)t- ； 和基团 C C-(CH2)u-(C C)v- ； 其中 r 是 0-4， s 是 0 至 4， t 是 0 或 1 ； u 是 0-4 且 v 是 0 或 1 ； 0092 R8、 R9和R10是相同的或不同的， 且各自选自氢 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷基 ； 任选地被一个或多个氟原子取代的 C1-4烷氧基 ； 硝基 ； 氨基 ； 单 - 和二 -C1-4烷基 氨基 ； 卤素、 苯基 -C1-2烷基， 其中所述苯基部分任选地被一个或两个甲氧基、 甲基或卤素取 代基取代 ； 脲基和胍基 ； 或 R9和 R10连接在一起以形成亚烷基链 (CH2)w。