固氮类芽孢杆菌149及其应用.pdf

《固氮类芽孢杆菌149及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《固氮类芽孢杆菌149及其应用.pdf（14页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、10申请公布号CN102352333A43申请公布日20120215CN102352333ACN102352333A21申请号201110323840822申请日20111021CGMCCNO496620110621C12N1/20200601C12N9/00200601C12N15/52200601A01N63/02200601A01P3/00200601A01P21/00200601C05F11/08200601C12R1/0120060171申请人中国农业大学地址100193北京市海淀区圆明园西路2号72发明人陈三凤王莉瑛陈曦74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王。

2、朋飞王加岭54发明名称固氮类芽孢杆菌149及其应用57摘要本发明提供了一株具有固氮能力的类芽孢杆菌PAENIBACILLUSSP菌株149，其保藏编号为CGMCCNO4966。该菌具有固氮酶结构基因NIFH，乙炔还原法测定其固氮酶活为96949NMOLC2H4/MGPROTEINH1。本发明提供的固氮类芽孢杆菌菌株149对多种植物病原菌有明显的抑制作用，将本发明的菌株149制成固氮微生物菌剂或生物有机肥可对植物种子的萌发生长产生明显的促进作用，可在农业生产中推广使用，有效降低尿素使用量。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页序列表。

3、3页附图2页CN102352340A1/1页21固氮类芽孢杆菌PAENIBACILLUSSP菌株149，其保藏号为CGMCCNO4966。2含有权利要求1所述固氮类芽孢杆菌149的菌剂。3权利要求1所述的固氮类芽孢杆菌149产生具有固氮活性的固氮酶，编码固氮酶的基因为NIFH，编码该基因的核苷酸序列如SEQIDNO1。4权利要求1所述的固氮类芽孢杆菌149或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在抑制植物病原菌上的应用。5如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物病原菌为尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUM、禾谷丝核菌RHIZOCTONIACEREALIS、核盘菌SCLEROTINIAS。

4、CLEROTIORUM和/或灰葡萄孢BOTRYTISCINEREA。6权利要求1所述的固氮类芽孢杆菌149或其发酵产物或权利要求2所述的菌剂在促进植物生长上的应用。7权利要求1所述的固氮类芽孢杆菌149在制备生态固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。8权利要求1所述的固氮类芽孢杆菌149为有效成分的制剂在农业上的应用。权利要求书CN102352333ACN102352340A1/7页3固氮类芽孢杆菌149及其应用技术领域0001本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种具有固氮能力的固氮类芽孢杆菌149及其应用。背景技术0002禾本科作物如小麦、玉米和水稻等是全世界约65亿人口主要的食物。随着化肥。

5、工业的兴起，提高农作物的产量主要依赖于增加化学氮肥的施用量。我国是世界上最大的化肥生产国和消费国，每年化肥施用量高达4800万吨，其中氮肥2800万吨，磷肥1200万吨P2O5，而且耕地面积下降的情况下，化肥的年总需求不降反升。然而，只有少于30施用的化肥能被利用，VANKESSELETAL，2009，过量施用氮肥所产生的氮氧化物每公斤对增温的影响大约是二氧化碳的298倍，而每年我国生产氮肥耗能达1亿吨标准煤，生产和使用过程中共排放了5亿吨二氧化碳当量，扣除氮肥施用作物增产所固定的07亿吨二氧化碳，温室气体净排放量达43亿吨二氧化碳，约占全国总排放量的8。化肥的过量施用，导致土壤可吸收态微量元。

6、素含量下降，同时造成土壤中氟和重金属污染，导致土壤酸化严重，重金属、硝态氮在土壤中累积，土壤板结，肥力下降。大部分氮肥通过渗漏、挥发及硝化与反硝化等途径损失，一部分化肥随雨水进入江河湖泊，造成水体的富营养化，我国有80以上的湖泊受到污染IV类劣V类。按照世界卫生组织标准，我国地下水硝酸盐总体超标率为2991。菜地硝酸盐浓度在100PPM以上，设施蔬菜超过200PPM，严重威胁到食品安全与国民健康。0003而生物固氮不仅可以有效的减少化肥的使用量，提高化肥的利用率，而且还可以改善土壤物理性状，提高土壤肥力，增加有机质，从而提高农作物对营养的吸收，改善根际微生态系统，从而降低农业生产成本，实现农业。

7、的可持续发展。0004根据固氮微生物与宿主植物之间的结合关系，可以将固氮作用分为共生固氮、联合固氮和自生固氮尤崇杓主编，生物固氮，科学出版社，1987。共生固氮微生物是与其它共生紧密生活在一起，形成特殊的共生结构进行固氮的一类微生物。它们一般生活在根瘤内，以宿主植物提供的光合产物为能源进行固氮，从而为宿主植物生长提供氮素营养。共生固氮效率高，固氮量大，是迄今研究的最为清楚的固氮体系；但其宿主范围及其狭窄，仅限于豆科植物豆科植物根瘤菌和某些非豆科树木弗氏固氮放线菌，严重的限制了它的广泛应用。联合固氮微生物是指定植于植物的根际或根表，有些可以进入根的皮层组织但不形成根瘤，进行固氮的微生物。由于联合。

8、固氮菌与植物根系之间只是一种松散的联合，而没有分化出有形的结构，而裸露在植物根表，是的联合固氮易受环境因素的影响，加之由联合固氮微生物固定的氮素不易分泌到体外，是造成了联合固氮微生物固氮效率低下的原因。自生固氮微生物是通常在自然环境或培养基中独立生活时，就可以将分子态氮固定为氨的一类微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物联合就能固氮，具有条件宽、适应广的特点，而且还能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生长发育，现有的一些氮肥菌剂中便含有自生固氮菌。同时，自生固氮菌能够改善植物根际的微生态群落，起到促进植物生长，说明书CN102352333ACN102352340A2/7页4提高植物抗逆性的作用。

9、。0005类芽孢菌具有存活期长和抗逆性强等特点，广泛分布在不同的土壤和植物根际中，有的也可以侵入植物组织内部。该属中的许多菌株以其固氮能力、对致病菌的抗性和对植物的促生作用使得他们受到了研究者的广泛的关注。我国幅员辽阔，环境多样，土质情况差异很大，使得我国的自生固氮资源十分丰富，开发应用潜力巨大。但是，由于国内外特别是国内对自生固氮菌的研究起步较晚，大大限制了类芽孢杆菌菌种作为有潜力的微生物菌剂在农业上的应用。发明内容0006本发明的目的在于提供一种具有固氮能力的类芽孢杆菌及其应用。0007本发明提供的149于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心简称CGMCC，。

10、地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNO4966，分类命名类芽孢杆菌PAENIBACILLUSSP。0008固氮类芽孢杆菌149在LD固体培养基上生长良好，菌落为圆形，边缘不规则，颜色乳白，直径为23MM。0009本发明提供了含有固氮类芽孢杆菌149的菌剂。0010本发明发现该菌含有固氮酶，其结构基因为NIFH，编码该基因的核苷酸序列如SEQIDNO1。乙炔还原法测定其固氮酶活性为96949NMOLC2H4/MGPROTEINH1。0011本发明提供固氮类芽孢杆菌149或其发酵产物或含有固氮类芽孢杆菌149的菌剂在抑制病原菌上的应用。

11、。0012所述的病原菌为尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUM、禾谷丝核菌RHIZOCTONIACEREALIS、核盘菌SCLEROTINIASCLEROTIORUM和/或灰葡萄孢BOTRYTISCINEREA。0013本发明提供固氮类芽孢杆菌149或其发酵产物或含有固氮类芽孢杆菌149的菌剂在促进植物生长上的应用。0014本发明提供了固氮类芽孢杆菌149在制备生态固氮微生物菌剂或生物有机肥中的应用。0015本发明提供了以固氮类芽孢杆菌149为有效成分的制剂在农业上的应用。0016本发明提供的固氮类芽孢杆菌菌株149对多种植物病原菌具有明显的抑制作用，同时对植物生长具有促进作用，该菌株分。

12、泌植物激素吲哚乙酸的产量为1159MMOL/ML，将本发明的菌株149制成固氮微生物菌剂或生物有机肥可对植物种子的萌发生长产生明显的促进作用，能有效降低尿素的使用量，可在农业生产中推广使用。附图说明0017图1为PAENIBACILLUSSP149在无氮平板上的菌落形态；0018图2为菌株PAENIBACILLUSSP149相关的电泳图，其中MLADDER；1PCR扩增得到的固氮酶结构基因NIFH条带；2PCR扩增得到的16SRDNA条带；0019图3为PAENIBACILLUSSP149对植物病原菌的抑制作用图，其中A图为PAENIBACILLUSSP149对灰葡萄孢BOTRYTISCINE。

13、REA的抑制作用图；B图为说明书CN102352333ACN102352340A3/7页5PAENIBACILLUSSP149核盘菌SCLEROTINIASCLEROTIORUM的抑制作用图；C图为PAENIBACILLUSSP149对尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUM的抑制作用图；D图为PAENIBACILLUSSP149对禾谷丝核菌RHIZOCTONIACEREALIS的抑制作用图；0020图4为PAENIBACILLUSSP149对小麦种子的促生作用图，分别为菌液在稀释10倍、20倍、50倍、100倍情况下对小麦种子的促生作用。具体实施方式0021以下实施例用于说明本发明，但不。

14、用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。0022若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。0023本实施例中所用的土样，来自各地不同植物根基土壤。0024实施例1固氮类芽孢杆菌149菌株的培养和鉴定00251菌株的培养0026培养基的制作液体培养基1L20G蔗糖；1206GK2HPO4；34GKH2PO4；02GMGSO47H2O；001GNACL；001GFECL3；0002GNAMOO42H2O；H2O1L。120灭菌25分钟。固体培养基的制作是。

15、在每升液体培养基中加入14G琼脂。将固氮类芽孢杆菌接种到固体或液体培养基中，30培养箱培养3天。00272细菌总DNA的提取提取方法参照文献【AUSUBELETALCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGYNEWYORKWILEY1987】的方法。00283菌株的鉴定及固氮酶结构基因NIFH及16SRDNA的扩增0029从本发明菌株PAENIBACILLUSSP149的纯培养物提取基因组DNA，并以此为模板，以表1中NIFHP1和NIFHP2为上下游引物，PCR扩增固氮酶结构基因NIFH，得到了大小约为320BP的条带。将此条带进行回收纯化后，送交公司进行测序。基因N。

16、IFH的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。将测序结果在GENBANK数据库的在线的BLAST比对，结果和PAENIBACILLUSNZ29的同源性达到94。0030以原核生物的模式菌株大肠杆菌的16SRDNA序列设计引物，见表1，以提取的菌株PAENIBACILLUSSP149的纯培养物基因组DNA为模板，PCR扩增16SRDNA序列。结果得到了为15KB左右的条带，然后将此条带进行回收纯化，并送交测序。16SRDNA序列如SEQIDNO2所示，测序结果进行在线的BLAST比对，结果显示此菌株属于类芽孢杆菌属。该菌株149已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

17、简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏号为CGMCCNO4966，分类命名为类芽孢杆菌PAENIBACILLUSSP。0031表1用于克隆NIFH及16SRRNA基因的引物0032说明书CN102352333ACN102352340A4/7页60033扩增体系003400350036扩增条件0037NIFH基因的扩增0038003916SRDNA的扩增0040说明书CN102352333ACN102352340A5/7页70041固氮酶结构基因NIFH及16SRDNA的扩增结果见图2。0042实施例2固氮酶活的测定00431、将149。

18、菌株接种于5ML测酶活的培养基中，30静置培养过夜，按1的接种量转接到50ML三角瓶中，30再次过夜培养，然后收集菌体，并用适量测酶活的培养基悬浮具体，并调整OD600到1。将15ML菌液接种培养2H，取100L气体用气象色谱法测定乙烯含量。0044测酶活培养基为263GNA2HPO412H2O；34GKH2PO4；10G生物素；26MGCACL22H2O；30MGMGSO4；033MGMNSO4H2O；36MG柠檬酸铁；76MGNA2MOO42H2O；10G对氨基苯甲酸；4G葡萄糖。葡萄糖115灭菌30MIN后单独加入，其他试剂可配好后121灭菌30MIN。00452、蛋白含量的测定方法BR。

19、ADFORD，197600461溶液的配置0047BRADFORD储存液100ML95乙醇，200ML88磷酸，350MG考马斯亮蓝G250；0048BRADFORD工作液425ML双蒸水，15ML95乙醇，30ML88磷酸，30MLBRADFORD储存液；0049滤纸过滤，保存于棕色瓶中，室温放置。可保存数周，但使用前需过滤。00502标准曲线的制作0051取5MLBRADFORD工作液于试管中，分别加入40L的01MG/ML、02MG/ML、04MG/ML、06MG/ML、08MG/ML、10MG/ML的BSA溶液，混匀，放置35MIN，显兰色。测定OD595值。以加入40L水的5MLBR。

20、ADFORD工作液作为对照。以OD595值为纵坐标，BSA溶液浓度为横坐标绘制标准曲线。得到标准曲线方程Y03973X，R2是0996。00523检测0053离心收集菌体，加200L05M的NAOH煮沸5MIN，再加200L05M的HCL混合均匀后离心吸取上清液40L，加入到5MLBRADFORD工作液中，混匀，放置35MIN，显兰色。测定OD595值为00883。将OD595值带入标准曲线方程中，计算蛋白浓度为02222MG。00543、1NMOL乙烯的标定00551准备120ML血清瓶两个，标为1、2瓶；00562将血清瓶灌满水，并用插有针头的胶塞塞好，防止气泡产生，取下胶塞，倒出100M。

21、L水用容量瓶量取，换上新胶塞，这样瓶中的空气体积即为100ML；00573向1瓶中注射224ML标准状况下为224ML，非标准状况下，根据PVNRT来计算注入量乙烯，再从1瓶中取出1ML气体注入2瓶中，从2瓶中取出100L气体说明书CN102352333ACN102352340A6/7页8打入气相色谱仪仪器型号HP6890，所显示的峰面积即为1NMOL乙烯的量，据此可计算出记录纸上每单位峰面积代表多少NMOL乙烯。00584固氮酶活NMOLC2H4/MGPROTEINHR的计算公式为00590060乙炔还原法ARA表明该菌可以利用N2作为氮源，且具有较高的生物固氮活性，在纯培养条件下，其固氮酶。

22、活性为96949NMOLC2H4/MGPROTEINH1。0061实施例3固氮类芽孢杆菌149菌株的抑菌活性实验0062PDA培养基马铃薯200G，葡萄糖20G，琼脂粉16G，加蒸馏水定容至1L。在距离PDA平板中央2CM处的两点分别接种植物病原菌和本发明提供的类芽孢杆菌149，然后将平板置于30培养箱培养37天，观察该类芽孢杆菌对植物病原菌的抑制作用，结果见图3。本实施例所用的植物病原菌分别为尖孢镰刀菌FUSARIUMOXYSPORUM、禾谷丝核菌RHIZOCTONIACEREALIS、核盘菌SCLEROTINIASCLEROTIORUM、灰葡萄孢BOTRYTISCINEREA。0063实施。

23、例4固氮类芽孢杆菌149菌株对小麦种子的促生作用实验00641植物激素吲哚乙酸IAA含量的测定0065将类芽孢杆菌149菌株单菌落接种于5MLLD液体培养基蛋白胨10G，酵母粉5G，NACL25G，去离子水定容至1L，用1MOL/LHCL或NAOH调节PH值至68中，置于30摇床上振荡培养过夜。然后按5的接种量接种于200ML新鲜配制的LD或LB液体培养基中，置于30摇床中振荡培养48H后，测定它们的IAA产量。结果显示，本发明类芽孢杆菌149菌株可以分泌IAA，其产量为1159MMOL/ML，对植物具有促生作用。00662类芽孢杆菌149菌株对小麦种子的促生作用实验0067将培养好的该菌株菌。

24、液进行梯度稀释10，20，50，100，然后将颗粒饱满的小麦种子用1次氯酸钠消毒15MIN，再用灭菌的去离子水洗涤5次。接下来分别用灭菌的去离子水和梯度稀释10，20，50，100的菌液浸小麦种2MIN。将小麦种子用灭菌的去离子水经同样的处理作为对照组。将处理后的小麦种子整齐的摆放于铺有湿润滤纸的无菌平皿中，每皿100粒。然后将平皿置于25恒温培养箱中，黑暗发芽。逐日记录处理组和对照组种子发芽数。当培养67天后，测定种子芽、根的长度、单株鲜重、单株干重、种子发芽指数、种子发芽率及幼苗活力指数，结果见表2。0068发芽指数GERMINATIONINDEX，GI、发芽率GERMINATIONPER。

25、CENTAGE，GP和种子活力指数计算公式如下0069发芽率发芽总粒数/试验总粒数1000070发芽指数T时间内发芽数/相应发芽天数T0071活力指数种子发芽指数单株幼苗平均干重。0072表2菌株PAENIBACILLUSSP149对小麦种子的促生效果0073说明书CN102352333ACN102352340A7/7页90074如表2所示，与对照组相比，将本发明菌液梯度稀释10，20和50时，对小麦种子的促生作用明显高于对照组；而稀释100时，由于菌液浓度过低，促生效果不明显。当菌液被稀释20时，用它处理的小麦种子的发芽指数比对照组提高了8377，发芽率比对照组提高了200，种子活力指数提高。

26、了7385。当菌液稀释50时，发芽指数提高了6793，发芽率提高了372，种子活力指数提高了4999。可见，本发明菌株149可以作为一种具有抑制植物病原菌和促进植物生长作用的生物固氮肥料在生产中得到应用。将本发明菌株进行培养后作为微生物肥料，可应用在玉米、小麦等禾本科作物的田间种植业中，能有效的降低尿素的使用量。说明书CN102352333ACN102352340A1/3页100016序列表CN102352333ACN102352340A2/3页110017序列表CN102352333ACN102352340A3/3页12序列表CN102352333ACN102352340A1/2页13图1图2图3A图3B说明书附图CN102352333ACN102352340A2/2页14图3C图3D图4说明书附图CN102352333A。