治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒及制备方法、应用.pdf

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1、10申请公布号CN104288783A43申请公布日20150121CN104288783A21申请号201410505563622申请日20140926A61K48/00200601A61K47/34200601A61K9/14200601C08G73/04200601A61P7/0020060171申请人上海交通大学地址200240上海市闵行区东川路800号72发明人袁伟恩毛文伟原明璐车俊怡74专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司31236代理人胡晶54发明名称治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒及制备方法、应用57摘要本发明涉及治疗骨髓再生障碍药物的技术领域，特别涉及一种治疗骨髓再生障。

2、碍的聚阳离子纳米颗粒及制备方法、应用。本发明的治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为011001，所述基因物质包括硫酸酯酶2型基因。与现有技术相比，本发明的纳米颗粒可治疗骨髓再生障碍，可实现SULF2的输送，并且，不存在体内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。51INTCL权利要求书2页说明书10页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书10页附图4页10申请公布号CN104288。

3、783ACN104288783A1/2页21一种治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为011001，所述基因物质包括硫酸酯酶2型基因。2如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子核酸材料由低分子量的聚乙烯亚胺PEI与含二甲醛的链接剂以亚胺键构成，所述聚阳离子核酸材料的结构式为其中，X为含二甲醛的链接剂衍生的基团。3如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量低于2000。4如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚乙烯亚胺选自直链聚乙烯亚胺或支链聚乙烯亚胺。5如权利要求。

4、2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述链接剂选自戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5咪唑二甲醛、2,4吡啶二甲醛、2,5吡啶二甲醛、2,6吡啶二甲醛、2,5哒嗪二甲醛或2,6哒嗪二甲醛的其中一种。6如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述基因物质为DNA，所述DNA为构建的质粒DNA，所述质粒DNA包括功能基因序列、启动子序列和抗性基因，所述质粒DNA的功能基因序列包括7如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为5501。权利要求书CN104288783A2/2页38如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量。

5、比10301。9权利要求1所述的治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤聚阳离子核酸材料的水溶液和基因物质的水溶液混合，在室温静置2060分钟即可制成所述纳米颗粒。10权利要求1所述的聚阳离子纳米颗粒在制备治疗骨髓再生障碍的药物中的应用。权利要求书CN104288783A1/10页4治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒及制备方法、应用技术领域0001本发明涉及治疗骨髓再生障碍药物的技术领域，特别涉及一种治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒及制备方法、应用。背景技术0002硫酸酯酶是指能够水解多种生物物质中的硫酸酯键的酶的总称。至今，已有13种人源的硫酸酯酶被克隆。硫酸。

6、酯酶的生物活性作用出现在许多基本的细胞代谢活动中，包括降解硫酸化的分子，这些分子包括生物大分子例如，蛋白多糖和生物小分子例如，雌激素的硫酸化合物。大部分人源的硫酸酯酶存在于细胞内的脂质体上，它们在脂质体上发挥生物活性作用。但是有一小部分硫酸酯酶被发现存在于细胞外，这些地方包括GOLGI网络、内质网以及细胞间质。硫酸酯酶1型基因和硫酸酯酶2型基因就存在于细胞组织，并且作用于硫酸乙酰肝素糖蛋白HEPARANSULFATEPROTEOGLYCANS，HSPG的硫酸酯键。硫酸乙酰肝素糖蛋白是普遍存在于基底膜BASEMENTMEMBRANE,BM中的一种蛋白。HSPG与细胞外的信号分子结合是通过硫酸乙酰。

7、肝素HEPARINSULFATE,HS链的多样变化来进行的。硫酸乙酰肝素的成分是基底膜蛋白多糖，基底膜糖蛋白与成纤维细胞生长因子BROBLASTGROWTHFACTOR,FGF等细胞因子及其细胞膜受体结合，能够调节细胞内的信号分子，不仅参与血管再生，还影响细胞的增殖与分化。进一步的研究发现，硫酸乙酰肝素上6O氨基葡萄糖的硫酸化对于部分细胞增殖分化的生长因子信号传导是必须的。0003我们知道，经5氟尿嘧啶注射的小鼠，骨髓细胞数目迅速下降,并在第7天达到最低点,随后开始逐渐恢复,在第14天基本恢复到注射前的水平。我们研究发现，SULF2即硫酸酯酶2型基因能够显著地减少第7天小鼠外周血白细胞数、骨髓。

8、细胞数和血小板数，而在第11天，实验组小鼠的骨髓细胞数恢复程度好于对照组。一种解释是SULF2质粒的表达能够暂时地抑制骨髓干细胞和祖细胞进入增殖状态，保存其将来的再生能力。因此，SULF2质粒在骨髓再生中的功能值得进一步的研究。0004将核酸物质输送到靶细胞的胞浆或细胞核内，需要克服一系列的体内输送屏障，因此，核酸载体是否高效，是其能否用于临床治疗的关键所在。核酸物质输送的载体一般为以下两类1病毒载体病毒载体如慢病毒载体、腺病毒载体作为基因的输送载体，虽然有较高的体外转染活性，然而，其免疫原性与易导致突变的缺点为临床试验带来了巨大的安全问题，使得其应用受限。2非病毒载体非病毒载体的优势主要在于。

9、，在保证预期的转染活性的条件下，可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应，其一般为以下两种载体设计A阳离子脂质体；B聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰，使之适用于基因物质的靶向输送。阳离子脂质体具有较高的体内外转染活性，然而，由于表面的正电荷影响其体内的正常分布，同时，由于选用阳离子脂质，免疫原性与炎症反应在动物试验中也成为不可避免的缺点之一GAO,KHUANG,LNONVIRALMETHODSFORSIRNADELIVERYMOLECULARPHARMACEUTICS6,6516582008。目前，没有适合输送SULF2的载体。说明书C。

10、N104288783A2/10页5发明内容0005本发明目的在于提供一种治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒，以解决现有的SULF2没有适合输送的载体的技术问题。0006本发明的另一目的在于提供上述的治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒的制备方法，以解决现有的SULF2没有适合输送的载体的技术问题。0007本发明的再一目的在于提供上述的聚阳离子纳米颗粒在制备治疗骨髓再生障碍的药物中的应用。0008本发明目的通过以下的技术方案实现0009一种治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒，所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为011001，所述基因物质包括硫酸酯酶2。

11、型基因。0010优选地，所述聚阳离子核酸材料由低分子量的聚乙烯亚胺PEI与含二甲醛的链接剂以亚胺键构成，所述聚阳离子核酸材料的结构式为00110012其中，X为含二甲醛的链接剂衍生的基团。0013优选地，所述聚乙烯亚胺的分子量低于2000。0014优选地，所述聚乙烯亚胺选自直链聚乙烯亚胺或支链聚乙烯亚胺。0015优选地，所述链接剂选自戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、邻苯二甲醛、2,5咪唑二甲醛、2,4吡啶二甲醛、2,5吡啶二甲醛、2,6吡啶二甲醛、2,5哒嗪二甲醛或2,6哒嗪二甲醛的其中一种。0016优选地，所述基因物质为DNA，所述DNA为构建的质粒DNA，所述质粒DNA包括功能基因序列、启。

12、动子序列和抗性基因，所述质粒DNA的功能基因序列包括0017说明书CN104288783A3/10页60018优选地，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为5501。0019优选地，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比10301。0020上述的治疗骨髓再生障碍的聚阳离子纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤0021聚阳离子核酸材料的水溶液和基因物质的水溶液混合，在室温静置2060分钟即可制成所述纳米颗粒。0022上述的聚阳离子纳米颗粒在制备治疗骨髓再生障碍的药物中的应用。0023与现有技术相比，本发明有以下有益效果0024本发明的纳米颗粒可治疗骨髓再生障碍，可实现SULF2的输送，并且，不存在体。

13、内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。附图说明0025图1为OPEI的合成路线图；0026图2为PEI800DA的红外谱图；0027图3为OPEI的红外谱图；0028图4为本发明的纳米颗粒的粒径、ZETA电位示意图；0029图5为本发明的纳米颗粒的透射电镜示意图；0030图6为本发明的纳米颗粒的凝胶电泳示意图；0031图7为聚阳离子核酸材料的细胞毒性示意图。具体实施方式0032以下结合实施例对本发明进行详细说明。0033实施例1聚阳离子核酸材料OPEI的合成说明书CN10428878。

14、3A4/10页70034聚阳离子核酸材料OPEI的合成路线如图1所示。整个反应在无水无氧高纯氮气保护的环境中进行，直链的PEI800DA和邻苯二甲醛在摩尔比为125的条件下反应，反应溶剂为无水乙醇在无水乙醇中加入无水硫酸镁后静置48H，然后蒸馏得到新鲜的无水乙醇备用。PEI800DA的红外图谱如图2所示。用无水乙醇分别溶解PEI800DA1摩尔和邻苯二甲醛25摩尔，分别配成20ML和50ML的溶液。反应在室温条件下搅拌进行，用恒压滴液漏斗逐滴地把邻苯二甲醛溶液加入到PEI800DA溶液中。24H后停止反应，首先用减压旋转蒸发仪在减压和低温的条件下把其中的大部分溶剂除去，然后产品用少量超纯水溶解。

15、，置于截留分子量为10000DA的透析袋中透析48小时。透析结束后溶液用022M的微孔滤膜过滤，转移到预先准备好的西林瓶中。最后将产品在20冰箱预冻8H后用冷冻干燥机冻干，24H后停止冻干，得到最终产物OPEI。对产品进行红外检测，红外图谱如图3所示。产品的结构如下图00350036其中，邻苯二甲醛可由戊二醛、对苯二甲醛、间苯二甲醛、2,5咪唑二甲醛、2,4吡啶二甲醛、2,5吡啶二甲醛、2,6吡啶二甲醛、2,5哒嗪二甲醛或2,6哒嗪二甲醛的任意一种代替。0037实施例2OPEI包裹SULF2质粒的纳米颗粒的制备0038将实施例1中制备的OPEI配成水溶液，浓度为2G/L，用灭菌水稀释成20NG。

16、/L、40NG/L、100NG/L、200NG/L、1000NG/L和2000NG/L溶液。另外将SULF2质粒配成水溶液，浓度为20NG/L。将OPEI水溶液等体积加入至SULF2质粒水溶液，涡旋5MIN，并静置20MIN，即得一系列纳米颗粒的溶液。0039实施例3纳米颗粒的粒径与电位的表征0040将实施例2制备的一系列颗粒溶液放入BIC90PLUS粒度电位分析仪的测试槽中，该一系列颗粒溶液的颗粒中OPEI与SULF2的质量比1、2、5、10、20、50、100，设置测试温度为25，介质为水，粘度为089CP，折射率为1330，光散射角度为90。，检测波长为659NM，每个样品测试3次，每次。

17、运行时间为2MIN，记录粒径平均值。检测结果如图4所示。说明书CN104288783A5/10页80041将实施例2制备的一系列颗粒溶液放入BIC90PLUS粒度电位分析仪的测试槽中，该一系列颗粒溶液的颗粒中OPEI与SULF2的质量比1、2、5、10、20、50、100，设置测试温度为25，介质为水，粘度为089CP，折射率为1330，介电常数为7854，PH值为70，ZETA电位分析模型为SMOLUCHOWSKI方程，每个样品测试3次，每次自动运行10次，记录ZETA电位平均值，结果如图4所示。0042在基因输送系统中，形成小且紧实的颗粒非常关键，因为会影响细胞的摄取及基因转染效率。颗粒的。

18、粒径和ZETA电位可以展现载体包裹DNA的能力。从图5中可以发现，当复合物颗粒中OPEI与SULF2的质量比为1的条件下，粒径为370NM左右，PDI小于03，均匀且分布狭窄，说明在此质量比下，OPEI并没有包裹SULF2质粒形成纳米颗粒。随着质量比的增加，颗粒的粒径逐步变小，颗粒100120NM之间，而PDI在0103之间，表明颗粒分布较均匀。同时，ZETA电位从负值逐步变成正值，ZETA电位稳定在10MV20MV之间，分散体系较为稳定。当OPEI与SULF2的质量比继续上升时，纳米颗粒的粒径没有变小，而是略有增大，粒径为100NM150NM左右。以上数据说明纳米颗粒具有较小的粒径和较小的Z。

19、ETA电位，有利于细胞内吞复合物，发挥转染作用。0043实施例4纳米颗粒的透射电镜测试0044按照实施例2的制备方法来配制OPEI/SULF2质量比为1L的复合物纳米颗粒溶液，样品量为100L。先吸取10L复合物纳米颗粒溶液缓慢滴于400目的铜网上，室温下自然晾干，最后使用透射电子显微镜来观察样品的形态，记录透射电镜图。0045经过投射电镜观察，结果见图5所示,质量比为11的OPEISULF2复合物。复合物形成形态较为规则的纳米颗粒，粒径尺寸在60150NM之间，当OPEI接触到DNA分子里，通过静电作用力络合形成纳米颗粒，呈现出类球形状，形态规则、均匀。0046实施例5纳米颗粒的凝胶电泳测试。

20、0047称取10G琼脂糖，加入100ML1TAE缓冲液，在微波炉中加热溶解，待温度降至65，加入溴化乙啶EB，配制成10琼脂糖溶液含05G/ML溴化乙啶，倒入制胶槽中，插入样品梳，室温放置051小时等胶凝固。然后，拔出样品梳，电泳槽中加入TAE缓冲液没过凝胶，等待上样。按照实施例2的制备方法来配制OPEI与SULF2不同质量比的纳米颗粒水溶液，OPEI与SULF2的质量比依次为0、05、1、2、5、10、20、50。使用PEI25KDA和SULF2质粒配置成21的质量比浓度，作为阳性对照。MARKER电泳参照物选用DSTM50001005000BP，上样2L；6上样缓冲液溴酚兰甘油指示剂，含0。

21、25溴酚兰，40甘油1L与纳米颗粒水溶液5L均匀混合，上样6L。在110MV电压下电泳45分钟，最后，置于紫外凝胶成像系统观察并记录电泳图。0048聚阳离子核酸材料OPEI是使用PEI800DA和邻苯二甲醛缩合而成的聚合物，表面带有正电荷，可以通过静电作用凝聚，压缩带负电的DNA分子形成颗粒。OPEI将DNA包裹住时，复合物表面带有正电荷，无法在电场中移动，因此可以在图像上观察到包裹完全的复合物不发生迁移。我们使用琼脂糖凝胶电泳的方法来考察在不同质量比条件下的聚阳离子核酸材料OPEI对PDNA的包裹能力如图6所示。PDNA选用的是硫酸酯酶型基因SULF2，分子量为5256BP。使用基因MARK。

22、ER1005000BP作为分子量参照。0049从电泳图可以看出，硫酸酯酶型基因在质量比为05时，复合物在电场的泳动已经被完全阻滞住了。从图片可以观察到，随着质量比的增加，复合物的泳动都被阻滞了。说明书CN104288783A6/10页9该试验表明OPEI具有较好的凝聚质粒DNA形成颗粒的能力，有效的保护了质粒DNA。0050实施例6纳米颗粒的体外转染活性和细胞毒性实验0051细胞复苏0052首先，准备3740温水。从80冰箱中取出冻存细胞，快速放入温水中，直至细胞混悬液完全溶解。这里需要注意，要保证冻存管的管口不能伸到温水液面以下，否则会大大提高染菌的概率。取15ML离心管，吸取细胞混悬液置离。

23、心管，并以PBS冲洗一并加入离心管。离心1500RPM5MIN，弃去上清液以除去冻存液中的DMSO，加入3ML完培，并吹打均匀。将细胞混悬液加入到培养瓶，置于培养箱培养。数小时后，原本悬浮于培养液中的细胞就会贴壁生长到培养瓶的瓶壁上。0053细胞传代0054首先，在倒置显微镜下观察培养瓶中细胞贴壁生长的状态，当观察到约8085的底面面积都充满贴壁细胞的时候，就可以进行细胞传代操作了。0055在完成上述准备工作之后，将培养瓶从CO2培养箱里取出，弃去变黄的培养液，并用PBS冲洗并弃去，这个步骤是为了避免血清中某些组分对胰酶作用产生抑制的影响，使细胞更容易被消化下来，需要加入3ML的PBS吹打清洗。

24、几次。然后，加入1ML胰酶，反复吹打使其润湿整个瓶壁，置培养箱培养6MIN至细胞完全脱落，消化完毕后在显微镜下观察细胞，如果观察到细胞基本全部脱落下来，就说明已经消化完全了。应严格控制胰酶的消化时间，时间过长会导致细胞的活力下降，不利于细胞的增殖。加入6MLPBS缓冲液，不断吹打瓶壁，将细胞吹打均匀，这是因为胰酶对细胞的正常生理功能有一定损害，但是PBS加入后可以有效的使胰酶丧失活性。将培养瓶中所有液体移入无菌的离心管,离心1200RPM5MIN，弃去上清液，加入2ML完全培养基，反复吹打均匀后，平均分配，移入2个新的培养瓶。再分别加入约3ML新鲜培养液，放入CO2培养箱中继续培养，培养细胞时。

25、，要注意培养瓶的瓶口不宜得的太紧，需要留一定空间使培养箱中的CO2进入。0056细胞的转板0057吸去发黄的培养液，用PBS充分冲洗细胞表面，并弃去。加入1ML胰酶，浸润细胞，放入培养箱，消化6MIN。待细胞脱落后，加入6MLPBS，置15ML离心管，离心1200RPM5MIN。吸去上清液，加入2ML完培，吹打均匀，吹打过程需要轻柔。取50ML离心管，加入26ML完培，再加入2ML吹打均匀的细胞液。细胞计数器和盖玻片酒精消毒，盖玻片盖在细胞计数板上。将细胞悬液吸出10L，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，不可有气泡。低倍镜下观察，计算计数板中四个角上的四大格细胞总数，压线细胞只计左侧。

26、和上方的。按下式计算细胞数/ML四大格细胞总数/410000,使细胞浓度在510104个/ML。细胞计数时，镜下若见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10以上，说明细胞的分散度不好,需重新制备细胞悬液。当细胞浓度符合要求后，48孔板中每孔加入500L细胞液，96孔板每孔加入100L。加样时，每加入一行，用吸管吹打，再加样，有利于细胞均匀。将转板放置培养箱，过夜。0058细胞的冻存0059首先，吸去发黄的培养液，用PBS冲洗并弃去。加入1ML胰酶，置培养箱消化6MIN，至细胞完全脱落。加入6MLPBS缓冲液吹打均匀，取15ML离心管，将脱落的细胞加入5MLPBS，然后转移到。

27、离心管。1500RPM离心5MIN，弃去上清液。加入700LDMEM,200L血说明书CN104288783A7/10页10清，100LDMSO，总体积1ML，吹打均匀。冻存管先在4冰箱中放置15MIN，202H，80过夜，最后转移至液氮罐。0060SULF2质粒的转染0061选择CT26TW细胞系考察OPEI的转染效果。首先，按照上述的转板方法进行转板。按照上述的方法制备OPEISULF2复合物纳米颗粒。取出48孔板,弃去培养基,用PBS冲洗并弃去，除去培养基应迅速加入PBS。每孔中质粒量固定为500NG，每孔质粒终浓度为2UG/ML，每个浓度比需做3个复孔，每孔终总体积为250L。需要配置。

28、成10NG/L的复合物溶液，每孔加50L，即每个浓度配置150L以上。每孔加入250LDMEM，再加入50L复合物溶液，轻轻震摇培养板，置培养箱4H。取出细胞板，吸去培养液，PBS冲洗，加入完全培养基500L，培养48H，进行下一步检测。48H后，将培养基弃除，每孔用200L的PBS冲洗并弃去，加入200L05MM4MUSSULF2酶的荧光发光底物，用水作为稀释剂。置培养箱中培养4小时。4小时后取出，加入50L终止液1MTRISHCLPH104。预热多功能酶标仪，分别在激发光为355NM和吸收光为460NM下读取荧光值。0062OPEISULF2复合物的体外转染活性检测结果00634MUS作为。

29、SULF2质粒的发光底物，能够反应SULF2质粒的转染活性。发现OPEI浓度上升，转染的活性呈现上升的趋势。与PEI25KDA作比较，结果表明OPEI在CT26TW细胞中有较好的转染效率。同时，结果显示在质量比为20时，转染效率达到了最大值。由此，我们可以选择质量比在1030之间进行下一步体内转染活性实验。0064细胞毒性检测0065选用MTT法考察OPEI的细胞毒性。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒FORMAZAN并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免。

30、疫检测仪在570NM波长处测定其光吸收值630NM处光吸收值作为参比波长，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。故将每组中吸光度与正常生长组进行比较，可间接反映活细胞的数量。0066按照上述的转板方法，置细胞培养箱里培养过夜，使细胞贴壁。将高分子溶解于无血清无酚红的DMEM高糖培养基中，浓度分别为0、1、5、10、20、50G/ML，每孔中加入复合物的体积为100L，每个浓度平行3个复孔。将PEI25KDA作为阳性对照组。将96孔板中每孔的DMEM高糖培养基弃去，用PBS冲洗弃去。将不同浓度的复合物溶液依次加入到细胞板中，放入细胞培养箱。4H后，取出96孔。

31、板，弃去培养基，用PBS冲洗弃去。然后，每孔中加入100L的无血清无酚红的DMEM培养基，25L的MTT溶液5MG/ML，置于375CO2细胞培养箱中。6H后，取出96孔细胞板，弃去培养基。每孔加入100LDMSO，于37放置10MIN。待蓝紫色的结晶物甲赞FORMAZAN完全溶解后，使用多功能酶标仪在570NM和630NM处，测定样品的吸光度。每个样品平行测试5次，取平均值作图PEI800DA作为对照组。细胞存活率百分比是以待测样的吸光度值相比正常细胞的吸光度值即聚合物溶液的浓度为0来表示。0067细胞毒性检测结果0068从图7中可以看出，在CT26TW细胞中，OPEI在一系列工作浓度范围内。

32、的细胞存活率都在60以上。随着OPEI/SULF2质量比的增大，细胞存活率随之降低，当OPEI/SULF2说明书CN104288783A108/10页11质量比到达100时，细胞存活率降低至60左右。对比而言，对照组PEI25KDA的细胞毒性很大，在OPEI/SULF2质量比为10时，细胞存活率已经降到45以下。从细胞毒性的角度出发，OPEI比PEI25KDA更适用于体外输送。OPEI在一系列工作浓度范围内对CT26TW细胞的毒性均很低，细胞存活率在6090。0069实施例7本发明的纳米颗粒治疗骨髓再生障碍的效果试验0070一次性尾静脉给小鼠注射5氟尿嘧啶，剂量为200MG/KG。经5氟尿嘧啶。

33、注射的小鼠，骨髓细胞数目迅速下降,并在第7天达到最低点,随后开始逐渐恢复,在第14天基本恢复到注射前的水平。小鼠骨髓再生障碍模型是否建立的判断依据是血小板数、骨髓细胞数和外周血白细胞数目。根据文献的报道，外周血细胞数目和骨髓细胞数目的动态变化表现为DAY0开始到DAY3急剧减少，直到DAY7至最低点。到DAY14基本恢复到正常水平。0071表1小鼠骨髓抑制和再生模型的外周血白细胞数、血小板数和骨髓细胞数的变化00720073动物试验分组设计0074选用24只BALB/C雄性小鼠。将其分为四组，具体分组情况如下表。通过肌肉给药的方式给小鼠注射药物。0075表2动物试验分组设计0076组别试剂对照。

34、组不注射击5FU空白质粒组5FU50GSULF2质粒PE125KDA阳性对照组5FU12PE125KDA包裹50GSULF2质粒的复合物OPEI18KDA材料组5FU110OPEI18KDA包裹50GSULF2质粒的复合物0077小鼠外周血细胞和单腿骨髓细胞收集0078外周血白细胞和血小板计数经眼眶取血10L，加到含有抗凝剂的EP管中，轻轻拍打，使抗凝剂溶入血液中。利用全自动血球计数仪读取外周血白细胞和血小板数目。说明书CN104288783A119/10页120079骨髓细胞计数在第10天，断颈处死小鼠，用眼科剪剪开小鼠两腿皮肤，尽可能剥离干净皮下的肌肉，切断和大腿骨、小腿骨相连的韧带，分离。

35、出完整的大腿骨。用眼科剪剪去大腿骨两端的软骨，暴露出骨髓腔。用1ML注射器针头插入骨髓腔，每根腿骨用10MLPBS将骨髓细胞冲刷进15ML离心管中，再加入90MLPBS稀释，1200RPM离心10MIN，沉淀骨髓细胞，弃去上清。离心得到的细胞用1MLPBS吹打均匀，加入预冷的08W/VNH4CL溶液90ML混匀，置冰上10MIN裂解红细胞。随后，取10L加到血细胞计数板上计数细胞总数。0080组织器官的切片观察0081苏木精伊红染色法HEMATOXYLINEOSINSTAINING，HESTAINING，简称HE染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与。

36、胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学科研中最基本、使用最广泛的技术方法。器官的石蜡切片制作取出小鼠的心肝脾肺肾脑，按常规方法。进行器官的石蜡切片制作。0082取材从小鼠体内取出器官后，用PBS冲洗干净，浸于预冷的4多聚甲醛溶液中，4固定过夜。0083脱水和透明用PBS冲洗3遍，超纯水冲洗3遍，浸于15EDTANA2脱钙液中，直至骨骼彻底软化。蒸馏水冲洗三遍后，经70、80、95和100乙醇梯度脱水，二甲苯透明2次每次5MIN，浸蜡2次。脱水应彻底，否则材料不能透明，影响石蜡的浸入，致使难以切片。在低浓度或纯酒精中，每。

37、级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。0084浸蜡和包埋将透明的组织放入蜡杯。浸蜡时间视材料大小而定，一般总的浸蜡时间为24小时。组织浸入石蜡后，包埋前，将组织移入包埋用石蜡杯内。从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。准备好包埋框，将包埋用的镊子在酒精灯上加温防止镊子粘蜡后，左手持蜡杯，右手把加温的镊子放在蜡口直立状倒蜡时让石蜡沿镊子注入包埋框内。迅速取组织块放入包埋框石蜡内，切面朝下放正，置入框底并轻轻压平，以保证有气泡。待石蜡表面凝固前将标签贴于其上，需注意勿使标签与标本混淆，当。

38、蜡块冷至蜡面有透明蜡膜时，浸入冷水中迅速使其冷却，否则蜡内将形成结晶。蜡块自然冷却后，除去铜框，立即修切，准备制成切片。0085切片、烘片、脱蜡自然冷却后，20放置1H，石蜡切片机切片切片厚5M，55烤片过夜。切片在二甲苯中浸泡5MIN，二甲苯和纯乙醇11混合液中浸泡5MIN，经100、95、85和70乙醇梯度脱蜡，各级的脱蜡时间不宜过长，应控制在2MIN左右。0086染色切片浸泡于蒸馏水中3MIN，转入苏木精染液中染色10MIN。用蒸馏水冲洗，去除多余染液，1盐酸乙醇分色1MIN。流水冲洗30MIN，蒸馏水冲洗3遍，浸入伊红染液中染色1MIN。0087脱水和透明经70、85、95和100乙醇。

39、梯度脱水，各级的脱水时间应控制在2MIN以内，二甲苯透明2次每次5MIN。0088封藏将切片从二甲苯中取出，用纸或布擦去材料周围的二甲苯。在材料中央滴一小滴树胶，然后，用镊子加盖盖玻片。切片封好后，放在切片托盘上待干燥，即可用于观察。0089器官的组织形态学观察利用倒置荧光显微镜NIKONECLIPSETS100，观察基因说明书CN104288783A1210/10页13输送材料OPEI对组织器官的损伤作用。0090实验结果0091小鼠外周血细胞和单腿骨髓细胞0092在尾静脉注射5氟尿嘧啶后的第10天，处死小鼠，按照上述的方法收集外周血细胞和单腿的骨髓细胞，结果如下表。0093表3各组小鼠第1。

40、0天血细胞数及单腿骨髓细胞数00940095经过EXCEL数据统计，结果发现各组小鼠的血小板均存在统计学差异P005，空白质粒组明显低于其他组别，原因是空白质粒缺少有效的基因输送载体，导致功能基因没有发挥作用。阳性对照组和材料组的血小板高于空白质粒组，原因是PEI25KDA和OPEI都能有效的将SULF2基因输送至细胞内并且发挥作用。再仔细观察阳性对照组和材料组，血小板的值同样存在显著性差异P005，从结果中可以看出，与OPEI相比，PEI25KDA对于血小板的细胞毒性较大。0096各组小鼠的白细胞数目同样存在显著性差异P005。对照组的白细胞数目明显高于注射了5FU的各个组别P001。从结果。

41、中可以看出，在第8天时，SULF2基因并没有明显改善小鼠的白细胞个数。0097SULF2基因在恢复小鼠的红细胞、血红细胞方面效果较为显著。阳性对照组、材料组和空白质粒组存在显著性差异P005，OPEI材料组的红细胞数目还高于对照组。结果显示，阳性对照组恢复红细胞的表现最好，PEI25KDA可能是由于较大的细胞毒性，导致恢复的结果不如阳性对照组。0098在单腿骨髓细胞数方面，阳性对照组、OPEI材料组与空白质粒组之间存在统计学差异P001。OPEI材料组与阳性对照组也存在统计学差异P005。可见，SULF2质粒确实存在改善5FU对骨髓细胞的损伤，有利于骨髓细胞的恢复与增殖。0099以上公开的仅为本申请的几个具体实施例，但本申请并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化，都应落在本申请的保护范围内。说明书CN104288783A131/4页14图1图2说明书附图CN104288783A142/4页15图3图4说明书附图CN104288783A153/4页16图5图6说明书附图CN104288783A164/4页17图7说明书附图CN104288783A17。