胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202410010945.5(22)申请日 2024.01.04(71)申请人 北京益华生物科技有限公司地址 100043 北京市石景山区实兴东街11号4层4200室(72)发明人 周慧杨铭斌姜宁健何子成彦文吴威袁春梅谷凯雯(74)专利代理机构 北京华清迪源知识产权代理有限公司 11577专利代理师 朱芳(51)Int.Cl.A61K 35/36(2015.01)C12N 5/071(2010.01)A23L 33/10(2016.01)A23L 33/105(2016.01)A61K 38/48。

2、(2006.01)A61K 9/08(2006.01)A61P 1/04(2006.01)A61K 35/20(2006.01)A61K 36/8945(2006.01)(54)发明名称一种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用(57)摘要本发明实施例公开了一种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用。本发明对胃黏膜上皮细胞依次进行普通培养、诱导培养、缺氧培养及低温刺激，能显著提高胃黏膜上皮细胞分泌的多种修复因子的水平，所获得的胃黏膜上皮细胞提取液具有强大的角生和更新能力，同时抑制炎症反应，改善局部血液循环，保护局部黏膜，在促进胃黏膜受损组织修复中发挥重要作用。权利要求书1页 说明书6页 附图1。

3、页CN 117503800 A2024.02.06CN 117503800 A1.一种胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将胃黏膜上皮细胞接种于6孔培养板中进行培养，细胞融合至80%90%时进行传代培养，并进行相关鉴定，当传至第5代时，向细胞中加入诱导培养基置于37，5%CO2培养箱中诱导培养72小时，然后转移至37、10%O2培养箱中缺氧培养24小时，重复所述诱导培养和缺氧培养的步骤，传至第7代，当细胞融合至90%100%后倒掉诱导培养基，用生理盐水清洗细胞三次，加纯净水进行低温刺激，收集上清，去除细胞碎片，过滤、除菌，得到胃黏膜上皮细胞提取液；其中，所述诱导培养基由基。

4、础培养基、HGF、PDGF和TGF组成，所述HGF、PDGF、TGF的终浓度分别为：815ng/ml、1218ng/ml、610ng/ml。2.根据权利要求1所述的胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述HGF、PDGF、TGF的终浓度分别为：10g/ml、15ng/ml、8ng/ml。3.根据权利要求1所述的胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述基础培养基为含10v/v%胎牛血清的DMEM/F12。4.根据权利要求1所述的胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述培养和传代培养采用的培养基为含10v/v%胎牛血清的DMEM/F12；所述培养和传代培养的条件为：37，5。

5、%CO2。5.根据权利要求1所述的胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述加纯净水进行低温刺激的步骤为：以细胞面积为基准，按照3.54.5ml/cm2加纯净水，然后于4冷藏箱中静置12小时。6.根据权利要求1所述的胃黏膜上皮细胞提取液的制备方法，其特征在于，所述去除细胞碎片的步骤为：用750g离心10分钟后，取上清用2000g离心20分钟后，再次取上清，1000g离心30分钟；所述过滤采用70目网筛；所述除菌采用孔径为0.22m的滤膜。7.一种胃黏膜上皮细胞提取液，其特征在于，其由权利要求16中任一项所述的方法制成。8.权利要求7所述的胃黏膜上皮细胞提取液在制备用于促进胃黏膜修复产品中。

6、的应用。9.一种促进胃黏膜修复的口服液，其特征在于，所述口服液包括：如权利要求7所述的胃黏膜上皮细胞提取液、牛奶提取物、山药提取物、凝乳酶、胃蛋白酶和香蕉提取物；以每1000ml所述胃黏膜上皮细胞提取液为基准，牛奶提取物、山药提取物及香蕉提取物的用量分别为60100g、4070g、3060g，凝乳酶和胃蛋白酶的终浓度为35004500U、10002000U。10.根据权利要求9所述的促进胃黏膜修复的口服液，其特征在于，所述牛奶提取物、山药提取物及香蕉提取物的用量分别为80g、60g、50g，凝乳酶和胃蛋白酶的终浓度为4000U、1500U。权利要求书1/1 页2CN 117503800 A2一。

7、种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用技术领域0001本发明实施例涉及生物医药技术领域，具体涉及一种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用。背景技术0002随着人们生活节奏越来越快，生活和工作压力越来越大，睡眠和饮食不规律，幽门螺旋杆菌感染，胃部不适人群越来越多，生活中常见因素如：经常熬夜，暴饮暴食，食用冷热辛辣刺激等食物，在这些不良习惯频繁的刺激下，胃黏膜出现不同程度的损伤，胃黏膜屏障功能减弱，微环境会发生失衡，长时间的胃黏膜损伤，病毒和细菌的侵扰，释放出一系列炎症因子，如白介素1、白介素6、肿瘤坏死因子、干扰素 等，这些炎症因子的持续分泌和一些保护因子分泌如PGE2的持续降低，导致组织持。

8、续破坏和修复的难度增加，胃黏膜正常的生理功能和修复能力下降，抗炎因子及组织修复因子分泌不足。而这些因子是细胞增殖和修复所必需的，缺乏这些因子会影响黏膜的修复，胃黏膜长期损伤，炎症的反复刺激导致防御能力越来越差，造成胃部疾病频发，主要为胃炎、胃黏膜的糜烂、溃疡和穿孔等，胃癌发病也呈上升趋势。0003因此，修复受损的胃黏膜是解决问题的根本，促进胃黏膜的修复，需要通过提供适当的微环境、抑制炎症反应、促进细胞增殖和提供足够的修复因子等措施来改善胃黏膜的修复状况。0004目前治疗胃黏膜损伤主要包括：00051.西药或中药来治疗，西药副作用大，常常会出现很多副作用，且容易出现并发症；而中药由于口感较差，较。

9、难坚持，无法达到较好的治疗效果，胃病往往会经常反复发作，一般需要长期用药，长期使用反而会对健康有害，而且也不利于胃部进行自我修复。00062.对于胃部黏膜损伤比较严重，反复出血，溃疡部位特殊的患者，有些需要采取手术治疗切除溃疡部位，以防病情复发，病人承受极大的痛苦。0007目前对症治疗居多，促进胃黏膜组织再生和修复的药物少之又少，治疗手段单一，一般使用西药或中药来治疗，此类药一般通过肝肾功能代谢，造成肝肾代谢负担，易损伤，西药成分复杂，常常会出现很多副作用，且容易出现并发症。中药材的质量参差不齐，存在草药提取效率低、有效成分含量不稳定等问题，多种草药进行配方，药物成分也比较复杂，药效评价和质量。

10、控制难度大，稳定性和药效得不到保障，容易出现药物相互作用或不良反应，并且中药由于口感较差，较难坚持，无法达到较好的治疗效果。发明内容0008为此，本发明实施例提供一种胃黏膜上皮细胞提取液及其制备方法与应用，以解决现有促进胃黏膜修复产品效果不佳，安全性不好等问题。0009为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：0010根据本发明实施例的第一方面，本发明提供一种胃黏膜上皮细胞提取液的制备方说明书1/6 页3CN 117503800 A3法，所述方法包括：0011将胃黏膜上皮细胞接种于6孔培养板中进行培养，细胞融合至80%90%时进行传代培养，并进行相关鉴定，当传至第5代时，向细胞中加入诱导。

11、培养基置于37，5%CO2培养箱中诱导培养72小时，然后转移至37、10%O2培养箱中缺氧培养24小时，重复所述诱导培养和缺氧培养的步骤，传至第7代，当细胞融合至90%100%后倒掉诱导培养基，用生理盐水清洗细胞三次，加纯净水进行低温刺激，收集上清，去除细胞碎片，过滤、除菌，得到胃黏膜上皮细胞提取液；其中，所述诱导培养基由基础培养基、HGF、PDGF和TGF组成，所述HGF、PDGF、TGF的终浓度分别为：815ng/ml、1218ng/ml、610ng/ml。0012HGF、PDGF可促进组织细胞的发生、生存和再生，抑制细胞的凋亡；TGF具有活跃细胞旁分泌功能，能刺激外泌体分泌大量的转化生长。

12、因子，从而促进细胞的增殖，具有双向调节作用。研究发现，含有上述终浓度范围的HGF、PDGF和TGF的诱导培养基能显著提高胃黏膜上皮细胞提取液中的活性因子分泌水平。本发明对胃黏膜上皮细胞依次进行普通培养、诱导培养、缺氧培养及低温刺激，所获得的胃黏膜上皮细胞提取液具有强大的角生和更新能力，同时抑制炎症反应，改善局部血液循环，保护局部黏膜，在促进胃黏膜受损组织修复中发挥重要作用。0013进一步地，所述HGF、PDGF、TGF的终浓度分别为：10g/ml、15ng/ml、8ng/ml。0014进一步地，所述基础培养基为含10v/v%胎牛血清的DMEM/F12。0015进一步地，所述培养和传代培养采用的。

13、培养基为含10v/v%胎牛血清的DMEM/F12；所述培养和传代培养的条件为：37，5%CO2。0016进一步地，所述加纯净水进行低温刺激的步骤为：以细胞面积为基准，按照3.54.5ml/cm2加纯净水，然后于4冷藏箱中静置12小时。研究发现，在上述条件下进行低温刺激，细胞在饥饿及渗透压的作用下能够释放出大量的细胞内因子，同时在4低温环境下溶酶体酶活性下降，减少对因子的降解，进而提高提取液中因子含量。0017进一步地，所述去除细胞碎片的步骤为：用750g离心10分钟后，取上清用2000g离心20分钟后，再次取上清，1000g离心30分钟；0018所述过滤采用70目网筛；0019所述除菌采用孔径。

14、为0.22m的滤膜。0020根据本发明实施例的第二方面，本发明提供一种胃黏膜上皮细胞提取液，其由如上任一项所述的方法制成。0021根据本发明实施例的第三方面，本发明提供如上所述的胃黏膜上皮细胞提取液在制备用于促进胃黏膜修复产品中的应用。0022根据本发明实施例的第四方面，本发明提供一种促进胃黏膜修复的口服液，所述口服液包括：如上所述的胃黏膜上皮细胞提取液、牛奶提取物、山药提取物、凝乳酶、胃蛋白酶和香蕉提取物；以每1000ml所述胃黏膜上皮细胞提取液为基准，牛奶提取物、山药提取物及香蕉提取物的用量分别为60100g、4070g、3060g，凝乳酶和胃蛋白酶的终浓度为35004500U、10002。

15、000U。0023牛奶提取物含乳钙、蛋白质、维生素、卵磷脂的等丰富的物质进入胃中可以提供营养，增强机体的免疫力，而且可以在胃的糜烂面或溃疡面上形成一层保护膜，在胃黏膜修复中发挥了协同作用。山药提取物中含有粘蛋白物质，可防止胃黏膜损伤，同时在胃蛋白酶的说明书2/6 页4CN 117503800 A4作用下保护胃壁，对预防胃溃疡和胃炎有好处。香蕉提取物中含有5羟色胺，能保护人体胃黏膜，降低胃酸分泌，香蕉提取物中还含有一种特殊的化学物质，能促进胃黏膜细胞的生长，能增强胃黏膜细胞的抗酸能力，从而保护和修复胃黏膜。胃蛋白酶、凝乳酶主要是具有促进分解蛋白质的作用，可以促进胃肠道腺体的分泌，并且可以改善消化。

16、道的血液循环，同时还可以提高消化道对营养成分的吸收能力以及对炎症抵抗力的作用。本发明进一步研究发现，胃黏膜上皮细胞提取液与上述原料进行组合，在黏膜保护和修复上发挥增效作用，能够有效修复和再生受损黏膜组织，达到缓解/治疗胃部不适的目的。0024进一步地，所述牛奶提取物、山药提取物及香蕉提取物的用量分别为80g、60g、50g，凝乳酶和胃蛋白酶的终浓度为4000U、1500U。0025本发明实施例具有如下优点：0026（1）安全性高：本品为纯生物联合养胃食品制剂，使用时无药物毒副作用，更加安全。0027（2）工艺稳定，获取性高：独有的黏膜修复细胞因子的高表达并促进粘膜修复的口服液制备技术，工艺非常。

17、稳定，有效的获取有针对性的活性黏膜修复因子。0028（3）有效性高：利用黏膜细胞独特的优势，细胞分泌的活性修复因子，分子量小，极易吸收的特性，作用到受损部位，修复和再生受损黏膜组织，从根本上解决胃部存在的问题。0029（4）无任何药物添加、无任何防腐剂添加。0030（5）口感清甜，解决了胃部不适感人群因药物口感差无法坚持的问题。附图说明0031为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实。

18、施附图。0032图1为本发明提供的胃黏膜上皮细胞提取液中活性因子分泌量的对比图；0033图2为本发明提供的一患者在治疗前后的胃黏膜内镜对照照片，左治疗前，右治疗后；0034图3为本发明提供的另一患者在治疗前后的胃黏膜内镜对照照片，左治疗前，右治疗后。具体实施方式0035以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。0036以下内容中，牛奶提取物（乳钙。

19、）购自乳钙生物科技，型号为013289；山药提取物购自斯诺特生物，型号为90147492；香蕉提取物购自斯诺特生物；凝乳酶购自山东萍聚生物有限公司，型号为9001983；胃蛋白酶购自南宁庞博生物。说明书3/6 页5CN 117503800 A50037胃黏膜上皮细胞的分离步骤如下：0038取15周以后流产胎猪胃，在含青霉素、链霉素的无菌DHanks液中反复冲洗，至少三遍以上，以眼科镊剥取黏膜固有层，剪成1mm3的碎块，置于0.1%型胶原酶和0.1%型胶原酶中，37消化6080min，100目滤网过滤收集细胞悬液，600g离心10min，弃上清，DHanks液离心洗涤3次，得到胃黏膜上皮细胞。0。

20、039实施例10040本实施例提供一种胃黏膜上皮细胞提取液，其制备方法如下：0041（1）原代培养：胃黏膜上皮细胞以1105/孔接种于6孔培养板中，加入含10v/v%胎牛血清的DMEM/F12，置于培养箱（37，5%CO2）1015分钟，吸出未黏附的细胞，继续培养。0042（2）传代培养：当细胞融合至80%时进行如下鉴定：阳性标志物，角蛋白8、18、19抗体鉴定呈阳性，显微镜下观察细胞形态符合胃黏膜上皮细胞形态。同时开始传代，细胞融合至80%时，去除细胞培养基，每瓶加入20ml DHanks进行洗涤，洗涤完成后去除洗涤液，每瓶加入5%的胰蛋白酶2ml3ml进行消化，消化3分钟左右，观察细胞脱落。

21、后，加入10ml DMEM/F12完全培养基（含10v/v%胎牛血清）终止消化，收集细胞悬液加入33ml DHanks，500g离心10分钟，洗涤2次后去除洗涤液，细胞按照1104/cm2接种于装有30ml DMEM/F12完全培养基（含10v/v%胎牛血清）的150cm2培养瓶中，放入培养箱（37，5%CO2）中培养。按照此培养流程细胞扩增至第5代，细胞进行诱导培养，将培养基换成诱导培养基（含10%胎牛血清的DMEM/F12、10ng/ml HGF、15ng/ml PDGF、8ng/ml TGF），在培养箱（37，5%CO2）中培养72小时，将诱导后的细胞转移至三汽培养箱采用人为制造缺氧微环。

22、境（37、5%CO2、10%O2）继续培养24小时。重复诱导培养和缺氧培养的步骤将细胞传至第7代。0043（3）低温刺激及收集上清：细胞长满后倒掉诱导培养基，用0.9%的生理盐水清洗三遍，以细胞面积为基准，按照4ml/cm2加纯净水，放置于4冷藏箱中静置1小时，收集细胞上清，用750g离心10分钟后，取上清用2000g离心20分钟后，再次取上清，1000g离心30分钟，通过梯度离心去除细胞碎片后，再用70目网筛过滤，过滤后用0.22m除菌，得到胃黏膜上皮细胞提取液。0044对比例10045本对比例提供一种胃黏膜上皮细胞提取液，其制备方法与实施例1的区别仅在于使用的诱导培养基不同，本对比例使用的。

23、诱导培养基由含10%胎牛血清的DMEM/F12、5ng/ml HGF、15ng/ml PDGF组成。0046实施例20047本实施例提供一种促进胃黏膜修复的口服液，其制备方法如下：0048按照每1000ml的实施例1的胃黏膜上皮细胞提取液添加牛奶提取物80g、山药提取物60g、香蕉提取物50g、凝乳酶4000U、胃蛋白酶1500U进行备料，将所有物料混合，搅拌均匀。0049实施例30050本实施例提供一种促进胃黏膜修复的口服液，其制备方法如下：0051按照每1000ml的实施例1的胃黏膜上皮细胞提取液添加牛奶提取物80g、山药提取物50g、香蕉提取物30g、凝乳酶3500U、胃蛋白酶2000U。

24、进行备料，将所有物料混合，搅拌均匀。说明书4/6 页6CN 117503800 A60052实施例40053本实施例提供一种促进胃黏膜修复的口服液，其制备方法如下：0054按照每1000ml的实施例1的胃黏膜上皮细胞提取物添加牛奶提取物100g、山药提取物60g、香蕉提取物50g、凝乳酶4000U、胃蛋白酶1000U进行备料，将所有物料混合。0055对比例20056本对比例提供一种促进胃黏膜修复的口服液，其制备方法与实施例2的区别仅在于将该实施例中的胃黏膜上皮细胞提取液替换成等量的对比例1的胃黏膜上皮细胞提取液。0057测试例10058采用Elisa试剂盒对实施例1、对比例1制备的胃黏膜上皮细。

25、胞提取液中活性因子分泌量进行检测，结果见下表1。同时对结果进行作图处理，结果见图1。0059表1（单位：pg/ml）00600061结果显示：本发明实施例制备的胃黏膜上皮细胞提取液中活性因子的分泌水平更高。0062测试例20063临床资料：选取门诊确诊为糜烂性胃炎患者60例。纳入标准：符合 中国慢性胃炎共识意见 中慢性糜烂性胃炎临床诊断标准；2）符合 慢性胃炎中医诊疗专家共识意见（2017）中脾胃虚弱型慢性糜烂性胃炎诊断标准（症状：上腹部不适、饱胀、疼痛、食欲不振、嗳气、反酸等）。0064将所有患者随机分为试验14组，15例/组，试验14组分别使用实施例1的胃黏膜上皮细胞提取液、实施例2的口服。

26、液、对比例1的胃黏膜上皮细胞提取液，以及对比例2的口服液进行治疗。饭后口服，150200ml/日，时间为1个月。在治疗前后观察症状和体征，内镜检查胃黏膜糜烂程度，检测胃液检测炎性因子的变化，以及血常规和肝肾功能。0065疗效标准：参照 中医消化病诊疗指南0066痊愈：临床症状及胃黏膜糜烂情况基本消失；0067显效：临床症状明显改善，胃黏膜糜烂缩小面积50%；0068有效：临床症状有所好转，胃黏膜糜烂缩小面积50%；0069无效：临床症状及胃黏膜糜烂情况无明显改善；0070总有效率(痊愈+显效+有效)/总例数*100%。0071治疗结果见表2，各组治疗均取得了较好的临床疗效，其中，实施例2的口服。

27、液在促进胃黏膜修复方面疗效更显著。治疗14组患者均未出现严重不良反应。0072表2说明书5/6 页7CN 117503800 A700730074典型案例：00751、患者杨某某，女，36岁，慢性胃炎病史2年，间断剑突下不适，腹胀伴隐痛，餐后明显，纳差，口服胃肠动力药无缓解；查体：腹软，剑突下按压不适，无压痛、反跳痛，Murphy氏征阴性，肠鸣音正常。口服实施例2的口服液，1个月后，剑突下不适感明显缓解，食欲恢复正常；查体：腹软，剑突下按压不适消失，无压痛、反跳痛，肠鸣音正常。0076在治疗前后，胃液炎性因子的变化见表3，胃黏膜内镜照片见图2。0077表3007800792、患者李某某，45岁。

28、，慢性胃炎病史3年，间断上腹痛，餐后反酸伴嗳气，口服抑酸剂稍缓解；查体：腹软，剑突下轻压痛，无反跳痛，Murphy氏征阴性，肠鸣音正常。口服实施例2的口服液，1个月后，临床症状缓解；查体：腹软，无压痛、反跳痛，肠鸣音正常。0080在治疗前后，胃液炎性因子的变化见表4，胃黏膜糜烂程度的变化见图3。0081表400820083虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书6/6 页8CN 117503800 A8图 1图 2图 3说明书附图1/1 页9CN 117503800 A9。