FTO蛋白在促进树木繁育中的应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202410014733.4(22)申请日 2024.01.04(71)申请人 北京林业大学地址 100083 北京市海淀区清华东路35号(72)发明人 李晓娟张耿(74)专利代理机构 北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11690专利代理师 刘玉玲(51)Int.Cl.C12N 9/02(2006.01)C12N 15/53(2006.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/00(2018.01)(5。

2、4)发明名称一种FTO蛋白在促进树木繁育中的应用(57)摘要本发明公开了一种FTO蛋白在促进树木繁育中的应用，属于林业分子生物科学领域；所述FTO蛋白是一种动物中的蛋白，在植物中没有同源蛋白。在杨树中高表达FTO蛋白后，植物株高、节间数、不定根数目和总根长均增加；在盐胁迫下，与野生型相比，过表达植株增强了对盐胁迫耐受性。因此通过表达FTO基因获得高产和抗逆性强的杨树新品种，对提高林业生产力具有重要价值。权利要求书1页 说明书9页序列表（电子公布）附图4页CN 117511892 A2024.02.06CN 117511892 A1.FTO蛋白在促进树木繁育中的应用，其特征在于，所述的树木表达F。

3、TO蛋白。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的树木包括外源导入FTO基因。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的FTO蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列；编码所述FTO蛋白的FTO基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90%同一性的序列。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的促进树木繁育包括促进树木根长增加、不定根数目增加、株高增加、节间数增加和/或增加盐胁迫耐受性。5.一种细胞，其特征在于，所述细。

4、胞表达FTO蛋白，所述细胞来源于树木细胞。6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括外源导入FTO基因。7.根据权利要求5或6所述的细胞，其特征在于，所述的FTO蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列；编码所述FTO蛋白的FTO基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90%同一性的序列。8.一种促进树木繁育的方法，其特征在于，所述的方法包括将FTO基因导入树木中。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的促进树木繁育包括促。

5、进树木根长增加、不定根数目增加、株高增加、节间数增加和/或增加盐胁迫耐受性。10.一种权利要求89任一所述的方法制备的树木的应用，其特征在于，所述应用包括：（1）作为能源物质；（2）纸浆制造；（3）建筑装修；或，（4）环境保护。权利要求书1/1 页2CN 117511892 A2一种FTO蛋白在促进树木繁育中的应用技术领域0001本发明属于林业分子生物科学技术领域，具体涉及一种FTO蛋白在促进树木繁育中的应用。背景技术0002杨树（PopulusL.）是杨属的植物，全属有约100多种，我国约62种。杨树生长速度快，成材快，树干通常端直，一方面可以为人类带来经济效益，比如木材、造纸、火柴、卫生筷。

6、和包装业等重要加工原料；另一方面具有重要的生态价值，不仅可以防风固沙，改善荒漠生态环境，而且可以固定二氧化碳，贡献于双碳目标。0003FTO（Fat Mass and Obesity Associated）是动物RNA去甲基化酶，具有调控发育的功能，在植物中没有同源蛋白。前人研究发现，在水稻和马铃薯中转入FTO后，水稻和马铃薯产量和生物量都显著增加，显著促进水稻根分生组织细胞增殖和分蘖芽形成。然而，截止目前，FTO基因在木本植物中的相关研究未见报道。0004林木是地球上最为丰富的一种可再生资源，它不仅可以作为能源物质被利用，也在水土保持以及环境保护方面起重要的作用。在对林木进行遗传改良的过程中。

7、，使用常规的遗传育种方法存在育种改良周期长等缺陷。将常规育种技术与分子生物学手段相结合能够大大的缩短育种周期，利用基因工程技术可以从源头改善人工林的木材质量，加快木材生长速率。发明内容0005鉴于此，为克服上述缺陷，本发明经过实验探索，将动物中FTO蛋白应用到树木的培育方法中，具体的：本发明第一方面，提供FTO蛋白在促进树木繁育中的应用，所述的树木表达FTO蛋白。0006优选的，所述的树木包括外源导入FTO基因。0007优选的，所述的树木高表达FTO蛋白。0008优选的，所述的FTO蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少。

8、90%同一性的序列。0009优选的，编码所述FTO蛋白的FTO基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90%同一性的序列。0010基于不同树种的密码子优化策略，可在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列基础上进行密码子优化，使得所述核苷酸序列适合于不同树种的应用。0011优选的，所述至少90%同一性的序列包括90%100%之间的任意数值，例如至少为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。0012优选的，所述的促进树木繁育包括表现为相对于未导入FTO基因的野生型树木，导入FTO基因后的转基。

9、因树木中树木根长增加、不定根数目增加、株高增加、节间数增加和/或说明书1/9 页3CN 117511892 A3增加盐胁迫耐受性。0013优选的，所述树木为阔叶树，包括落叶类阔叶树、常绿类阔叶树，例如，杨柳科中的钻天柳属、杨属和柳属的树木，更优选的，所述树木为杨属的树木，包括青杨派（Tacamahaca）、白杨派（Leuce）、黑杨派（Aigeiros）、胡杨派（Turanga）、大叶杨派（Leucoides）的杨树，进一步优选的，所述树木为白杨派中的毛白杨、银白杨、山杨、河北杨、响叶杨、响毛杨、三倍体毛白杨、84k杨。0014本发明第二方面，提供一种细胞，所述细胞表达FTO蛋白，所述细胞来源。

10、于树木细胞。0015优选的，所述细胞高表达FTO蛋白。0016优选的，所述的细胞包括外源导入FTO基因。0017优选的，所述的FTO蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列。0018优选的，编码所述FTO蛋白的FTO基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，与SEQ ID NO.2所示序列具有至少90%同一性的序列。0019基于不同树种的密码子优化策略，可在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列基础上进行密码子优化，使得所述核苷酸序列适合于不同树种的应用。0020优选的，所述至少90。

11、%同一性的序列包括90%100%之间的任意数值，例如至少为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。0021优选的，所述树木为阔叶树，包括落叶类阔叶树、常绿类阔叶树，例如，杨柳科中的钻天柳属、杨属和柳属的树木，更优选的，所述树木为杨属的树木，包括青杨派（Tacamahaca）、白杨派（Leuce）、黑杨派（Aigeiros）、胡杨派（Turanga）、大叶杨派（Leucoides）的杨树，进一步优选的，所述树木为白杨派中的毛白杨、银白杨、山杨、河北杨、响叶杨、响毛杨、三倍体毛白杨、84k杨。0022优选的，所述细胞可以是来自任一树木的靶向细胞、例如来自。

12、树木的根、茎、树干、叶、花、愈伤组织等的细胞。0023本发明的第三方面，提供一种促进树木繁育的方法，所述的方法包括将FTO基因导入树木中。0024优选的，所述的促进树木繁育包括促进树木根长增加、不定根数目增加、株高增加、节间数增加和/或增加盐胁迫耐受性。0025优选的，所述的树木高表达FTO蛋白。0026优选的，所述的FTO蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或，与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的序列。0027优选的，编码所述FTO蛋白的FTO基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或，与SEQ ID NO.2所示序列具有。

13、至少90%同一性的序列。0028基于不同树种的密码子优化策略，可在SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列基础上进行密码子优化，使得所述核苷酸序列适合于不同树种的应用。0029优选的，所述至少90%同一性的序列包括90%100%之间的任意数值，例如至少为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%。0030优选的，所述将FTO基因导入到树木中的步骤包括：说明书2/9 页4CN 117511892 A4S1基因克隆：获得FTO基因的编码区序列，包括合成FTO序列并构建质粒，再以得到质粒为模板扩增FTO基因的编码区序列；S2载体构建：将FTO基因的编码区序列通过。

14、双酶切的方法连接到表达载体上，构建FTO超量表达载体；优选的，所述超量表达载体为35S:FTO超量表达载体S3遗传转化：利用农杆菌介导的遗传转化方法，将表达载体导入到树木中，获得超量表达的转基因植株；S4阳性苗鉴定：提取植株的基因组，鉴定出阳性转基因植株。0031优选的，所述树木适合于上述定义的树木范围。更优选的，所述树木为白杨派树木。0032本发明第四方面提供一种上述促进树木繁育的方法制备的树木，所述树木高表达FTO基因。0033优选的，相对于野生型树木，高表达FTO的转基因植株树木树木根长增加、不定根数目增加、株高增加、节间数增加和/或增加盐胁迫耐受性。0034优选的，所述树木适合于上述定。

15、义的树木范围。更优选的，所述树木为白杨派树木。0035本发明第五方面，提供一种上述树木的应用，所述应用包括：（1）作为能源物质；（2）纸浆制造；（3）建筑装修；或，（4）环境保护。0036相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：本发明首次将动物中的FTO蛋白转入木本植物中。0037FTO蛋白是一种动物中的蛋白，在植物中没有同源蛋白。本发明发现在树木中导入FTO基因，FTO蛋白高表达后，可以促进树木的生长，植物株高、节间数、不定根数目和总根长均增加；在盐胁迫下，与野生型相比，过表达植株增强了对盐胁迫耐受性。因此通过表达FTO基因获得高产和抗逆性强的杨树新品种，对提高林业生产力具有重要价值。附。

16、图说明0038为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。0039图1为pCAMBIA2300载体骨架图谱；图2为35Spro:FTO转基因杨树FTO转录水平表达量检测图3为过表达FTO促进杨树生根表型；图4为过表达FTO促进杨树生根统计图，其中A:不定根的总根长统计图，B：不定根数目统计图；图5为过表达FTO促进杨树生长表型；图6为过表达FTO促进杨树生长统计图，其中A:植株株高统计图，B：节间。

17、数目统计说明书3/9 页5CN 117511892 A5图；图7为过表达FTO增加盐胁迫耐受性表型。具体实施方式0040植物材料为银腺杨（Populus albaPopulus glandulosa）无性系84K。0041以下材料或试剂，如非特别说明，均为购买。0042以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。0043实施例1：杨树FTO基因的编码区序列的克隆（1）目的基因FTO的合成在NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中下载FTO（基因号：NM_001080432.3）基因序列和该基因的蛋白编码序列，由公司（北京六合华大基因科技有限公司）合成该基因并提。

18、供含有该基因的质粒。0044所述FTO蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MKRTPTAEEREREAKKLRLLEELEDTWLPYLTPKDDEFYQQWQLKYPKLILREASSVSEELHKEVQEAFLTLHKHGCLFRDLVRIQGKDLLTPVSRILIGNPGCTYKYLNTRLFTVPWPVKGSNIKHTEAEIAAACETFLKLNDYLQIETIQALEELAAKEKANEDAVPLCMSADFPRVGMGSSYNGQDEVDIKSRAAYNVTLLNFMDPQKMPYLKEEPYFGMGKMAVSWHHDENLVDRSAVAVYSYSCEGPEEESEDD。

19、SHLEGRDPDIWHVGFKISWDIETPGLAIPLHQGDCYFMLDDLNATHQHCVLAGSQPRFSSTHRVAECSTGTLDYILQRCQLALQNVCDDVDNDDVSLKSFEPAVLKQGEEIHNEVEFEWLRQFWFQGNRYRKCTDWWCQPMAQLEALWKKMEGVTNAVLHEVKREGLPVEQRNEILTAILASLTARQNLRREWHARCQSRIARTLPADQKPECRPYWEKDDASMPLPFDLTDIVSELRGQLLEAKP所述FTO基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示:ATGAAGCGCACCCCGACTGCCGAGGA。

20、ACGAGAGCGCGAAGCTAAGAAACTGAGGCTTCTTGAAGAGCTTGAAGACACTTGGCTCCCTTATCTGACCCCCAAAGATGATGAATTCTATCAGCAGTGGCAGCTGAAATATCCTAAACTAATTCTCCGAGAAGCCAGCAGTGTATCTGAGGAGCTCCATAAAGAGGTTCAAGAAGCCTTTCTCACACTGCACAAGCATGGCTGCTTATTTCGGGACCTGGTTAGGATCCAAGGCAAAGATCTGCTCACTCCGGTATCTCGCATCCTCATTGGTAATCCAGGCTGCACCTACAAGTACCT。

21、GAACACCAGGCTCTTTACGGTCCCCTGGCCAGTGAAAGGGTCTAATATAAAACACACCGAGGCTGAAATAGCCGCTGCTTGTGAGACCTTCCTCAAGCTCAATGACTACCTGCAGATAGAAACCATCCAGGCTTTGGAAGAACTTGCTGCCAAAGAGAAGGCTAATGAGGATGCTGTGCCATTGTGTATGTCTGCAGATTTCCCCAGGGTTGGGATGGGTTCATCCTACAACGGACAAGATGAAGTGGACATTAAGAGCAGAGCAGCATACAACGTAACTTTGCTGAATTTCATGGATCC。

22、TCAGAAAATGCCATACCTGAAAGAGGAACCTTATTTTGGCATGGGGAAAATGGCAGTGAGCTGGCATCATGATGAAAATCTGGTGGACAGGTCAGCGGTGGCAGTGTACAGTTATAGCTGTGAAGGCCCTGAAGAGGAAAGTGAGGATGACTCTCATCTCGAAGGCAGGGATCCTGATATTTGGCATGTTGGTTTTAAGATCTCATGGGACATAGAGACACCTGGTTTGGCGATACCCCTTCACCAAGGAGACTGCTATTTCATGCTTGATGATCTCAATGCCACCCACCAACACTGTGT。

23、TTTGGCCGGTTCACAACCTCGGTTTAGTTCCACCCACCGAGTGGCAGAGTGCTCAACAGGAACCTTGGATTATATTTTACAACGCTGTCAGTTGGCTCTGCAGAATGTCTGTGACGATGTGGACAATGATGATGTCTCTTTGAAATCCTTTGAGCCTGCAGTTTTGAAACAAGGAGAAGAAATTCATAATGAGGTCGAGTTTGAGTGGCTGAGGCAGTTTTGGTTTCAAGGCAATCGATACAGAAAGTGCACTGACTGGTGGTGTCAACCCATGGCTCAACTGGAAGCACTGTGGAAGAA。

24、GATGGAGGGTGTGACAAATGCTGTGCTTCATGAAGTTAAAAGAGAGGGGCTCCCCGTGGAACAAAGGAATGAAATCTTGACTGCCATCCTTGCCTCGCTCACTGCACGCCAGAACCTGAGGAGAGAATGGCATGCCAGGTGCCAGTCACGAA说明书4/9 页6CN 117511892 A6TTGCCCGAACATTACCTGCTGATCAGAAGCCAGAATGTCGGCCATACTGGGAAAAGGATGATGCTTCGATGCCTCTGCCGTTTGACCTCACAGACATCGTTTCAGAACTCAGAGGTCAGCTTCT。

25、GGAAGCAAAACCC本发明利用PCR的方法，以得到的质粒为模板扩增FTO基因的编码区序列，具体方法如下：（2）目的基因FTO的扩增1）分析FTO 基因并设计带有Kpn I和XbaI I酶切位点的引物（加粗斜体为酶切位点）。正向引物F1的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；反向引物R1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示：F1:CTGGTACCATGAAGCGCACCCCGACTGCCG（SEQ ID NO.3）R1:GATTCTAGAGGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA（SEQ ID NO.4）2）以公司合成的含FTO的质粒为模板，根据以下PCR反应体系扩增获得FTO序列。

26、；以下所用试剂及用量参照Takara公司primeSTAR Max DNA polymerase 试剂盒说明书，具体见下表：表1：PCR扩增体系00453）PCR 反应程序如下：预变性：98 2 min；(变性：98 30 s，退火：55 15 s，延伸：72 30 s)33 个循环；延伸：72 5 min；4保温。扩增出的FTO 基因序列如SEQ ID NO.2所示。00464）琼脂糖凝胶电泳检测称取 0.5g 琼脂糖，加入 50 mL 1TAE，微波炉加热后加入 5 L GoldView（购自中科瑞泰生物科技有限公司）充分摇匀，倒入制胶板中。待琼脂糖凝胶凝固后，将PCR产物和Loading。

27、 buffer（购自北京全式金生物技术有限公司）的混合物加入胶孔中进行电泳检测，回收FTO的cDNA片段。0047实施例2：FTO基因表达载体构建（1）使用内切酶 Kpn I 和 XbaI I双酶切带有酶切位点的FTO产物和表达载体pCAMBIA2300（内切酶 Kpn I 和 XbaI I 购自宝日医生物技术北京有限公司，具体操作方法和用量参照说明书）。pCAMBIA2300载体结构如图1所示：具有35S启动子，可以实现对转化基因的超量表达。分别回收酶切后产物，用 T4DNA 连接酶（购自宝日医生物技术北京有限公司，具体操作方法和用量参照说明书），将目的基因片段和表达载体连接。0048（2）。

28、将连接产物转化入大肠杆菌感受态TOP 10（购自北京艾德莱生物科技有限公司，具体操作方法和用量参照说明书）中，加入600 L LB培养液，然后放置于恒温摇床中，37、150 rpm 复苏 60 min。将复苏的大肠杆菌5,000 rpm 离心 5 min，吸取 500 L 上说明书5/9 页7CN 117511892 A7清液，弃掉。剩余100 L用枪头吸打混匀，均匀的涂布于含有 50 g/mL 卡那霉素的LB 固体培养基上，将培养基倒置于恒温培养箱中，37 生长 1216 h。待菌落长出后，挑取单克隆菌落，于含有 50 g/mL 卡那霉素的20mL LB 液体培养基中，37生长 6 h。提取。

29、质粒（试剂盒购自天根生化科技北京有限公司，具体操作步骤参照说明书），送公司测序，筛选阳性克隆，并命名该载体为pCAMBIA230035Spro:FTO。0049（3）将载体pCAMBIA230035Spro:FTO转化入农杆菌GV3101（购自北京华越洋公司，具体操作步骤参照说明书）中，得到含有载体pCAMBIA230035Spro:FTO的农杆菌。0050LB液体培养基的配制：称取5 g胰蛋白胨 、5g NaCl、2.5 g酵母提取物，加入 ddH2O 定容至总体积为 500 mL。121高压蒸汽灭菌 20 min，冷却至室温。LB固体培养基配制方法参照LB液体培养基，定容前加入 7 g 琼。

30、脂粉，121高压蒸汽灭菌 20 min，冷却至室温。0051实施例3：杨树遗传转化将FTO表达载体通过农杆菌介导的遗传转化法导入杨树叶片中，经过预培养、侵染、暗培养、诱导不定芽、诱导芽生根、扩繁、炼苗后移栽温室（该方法参考了中国林业科学研究院林业所邱德有课题组的方法）。0052（1）材料扩繁：选择生长4周左右的84K杨树无菌苗，剪取茎段置于生根培养基中，进行繁育。培养温度约为25，光照强度为 50 molm2s1，光周期为 16 h/8 h，待组培苗生长45周后用于遗传转化实验。0053（2）叶片预培养：剪取无菌组培苗第 36 叶序叶片，使用灭菌过的手术刀在叶片主脉上横向划 45 道伤口，然后。

31、再将叶片正面朝下放于未加抗生素的分化培养基上培养12 天。0054（3）农杆菌侵染液的制备:吸取含有载体pCAMBIA230035Spro:FTO的农杆菌300 L于 100mL含有抗生素 (50 mg/L 卡那霉素，50 mg/L 利福平)LB 液体培养基中，混匀后放入 28，180 rpm/min 振荡培养过夜。当菌液OD600为 0.60.8 时，进行侵染转化。0055（4）侵染与暗培养：在超净台中，将预处理的叶片浸泡在农杆菌菌液中 1015 min，为了使叶片受伤部位与菌液充分接触，期间晃动23次菌液。取出叶片，用无菌滤纸上吸去叶片上的菌液，再将叶片叶面朝上平铺于在未加抗生素的分化培养。

32、基上，25 暗培养 3天。0056（5）诱导具有抗性的不定芽：在超净台中，将暗处理后的叶片移到含有浓度为50mg/L 卡那霉素 和 200 mg/L 特美汀的分化培养基上培养(光照 16 h/黑暗 8 h)，温度 25。2 周左右不定芽从叶片伤口处长出，当不定芽生长至0.51 cm 时，将不定芽，转移至新的分化培养基中继续生长；（6）生根培养：将长度 2 厘米以上的单个不定芽放置于含有浓度为30 mg/L 卡那霉素 和 200 mg/L 特美汀的生根培养基中诱导生根，使其发育为完整植株。四周左右剪取茎段培养在含特美汀和卡那霉素的生根培养基上继代扩繁。0057（7）温室移栽：当组培苗生长一个月左。

33、右并且根系发达时，炼苗 2天后进行移苗。用清水洗去杨树根部的培养基，移栽到灭过菌的营养土中，置于温室培养。0058杨树培养基配方如下表：表2：培养基配方说明书6/9 页8CN 117511892 A80059实施例4：转基因杨树的鉴定（1）为了对转基因杨树进行鉴定：根据 35S 启动子序列设计正向引物，FTO序列设计反向引物。以杨树基因组为模板，如果载体转入杨树则通过PCR可以扩增出基因片段，若未转入则扩增不出基因片段。0060设计引物如下：35SF：CAATGATGATGTCTCTTTGAAATCC（SEQ ID NO.5），FTOR：GGGTTTTGCTTCCAGAAGCTGA（SEQ I。

34、D NO.6）。0061在超净台中，剪取杨树叶片（实施例3所得到的转基因杨树），使用DN14植物基因组DNA快速提取试剂盒（购自北京艾德莱生物科技有限公司，具体操作步骤参照说明书）提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，用引物35SF和FTOR以及2xTaq Mix（购自北京博迈德生物技术有限公司公司）进行PCR扩增。将PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定出成功转入35S:FTO的阳性植株。0062PCR反应体系以及反应程序如下：0063实施例5：转基因杨树中FTO基因的表达量检测。0064（1）84K杨叶片总RNA提取：剪取84K组培苗叶片，在液氮中研磨备用，使用EASYspin Plu。

35、s 植物RNA快速提取试剂盒（购自北京艾德莱生物科技有限公司，具体操作步骤参照说明书）,得到的RNA溶液。0065（2）cDNA合成：按照以下体系配置反转录混合液，并置于200 L RNase free PCR管中；体系如下表：表3：反转录体系说明书7/9 页9CN 117511892 A90066充分混匀，然后在 42 孵育 15 min；然后85 加热 5 s，使 TransScript RT/RI 与 gDNA Remover 失活；获得的cDNA 在20保存。反应中所用到的试剂全部购自于北京全式金生物技术有限公司。0067（3）荧光实时定量PCR方法检测FTO表达量：将反转录得到的cD。

36、NA，利用天根生化科技有限公司SuperReal PreMix Plus试剂盒进行基因表达定量测定。具体步骤如下：扩增引物为：qRTF（正向引物）：ACTTGGCTCCCTTATCTGACC（SEQ ID NO.7）；qRTR（反向引物）：TGTGCAGTGTGAGAAAGGCTT（SEQ ID NO.8）。0068Realtime PCR反应体系为：2SuperReal PreMix Plus 10L；正向引物（10M）0.8L；反向引物（10M）0.8L；cDNA模板0.5L；蒸馏水7.9L。0069荧光实时定量PCR扩增条件为：预变性：95 ，15 min；三步法扩增：95 ，10 s，。

37、5060 ，20 s，72 ，30 s，重复扩增步骤40次，每个循环结束后采集荧光信号；6595，5 s上升0.5 ，绘制熔解曲线。0070对转基因杨树转录水平表达量检测结果见图2。图2中，WT为未做侵染的84K杨树叶片外植体对照；#1，#3，#6，#7，#8，#9分别为35S:FTO转基因的84K杨的不同株系。结果发现，在野生型植株中，不能检测到FTO的表达，在异源过表达植株中，检测到FTO的表达。0071实施例6：转基因杨树表型分析剪取鉴定过的转基因组培苗与野生型杨树组培苗的前两节间及包括茎尖在内约12cm，放于生根培养基中生长，待其生长1个月后测其根长和不定根数目，如图3和图4所示，结果。

38、表明，过表达植株的根长和不定根数目明显高于野生型。0072将生长1个月的组培苗经过炼苗后移栽到温室生长，待其生长1个月后测其株高和节间数，如图5和图6所示。结果表明，过表达植株的株高和节间数明显高于野生型。0073用上述材料进行盐胁迫应答探究，剪取鉴定过的转基因组培苗与野生型杨树组培苗的前两节间及包括茎尖在内约12cm，分别放置于添加75 mM和100 mM NaCl的生根培养基中生长，培养一个月后观察其生根情况。根据图7显示的结果，在75mM盐胁迫处理下，野生型植株的生根数目减少，而过表达杨树植株仍能产生较多的根。在100 mM NaCl处理条件下，随着盐胁迫程度的加剧，野生型无法生根，而过。

39、表达植株仍能够生根。实验结果表明，与野生型植株相比，FTO过表达杨树植株对高浓度盐环境的耐受能力更强。0074本发明将FTO通过分子生物学手段转入84 K杨后，增加了生物量，增强了对盐胁迫说明书8/9 页10CN 117511892 A10耐受性，从而得到一个新型的树种。同时本发明也提供了一种杨树改良的新方法。0075以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。说明书9/9 页11CN 117511892 A11图 1说明书附图1/4 页12CN 117511892 A12图 2图 3说明书附图2/4 页13CN 117511892 A13图 4图 5说明书附图3/4 页14CN 117511892 A14图 6图 7说明书附图4/4 页15CN 117511892 A15。