水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202410006080.5(22)申请日 2024.01.03(71)申请人 中国肉类食品综合研究中心地址 100068 北京市丰台区洋桥70号 申请人 天津科技大学(72)发明人 李石磊梁俊李莹莹杨峰刘屹森梁小娟唐铎祁宇陈嘉璇董圣艳(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002专利代理师 李正(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)C12N 5/077(2010.01)(54)发明名称水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用(57)摘要本发明涉及食品生产加工及细胞。

2、培养技术领域，尤其涉及一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用。本发明所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到。本发明以多肽在水凝胶体系中形成纳米纤维网络结构，作为细胞培养的支架，细胞可以在该支架中大量增殖。同时，随着多肽在水凝胶中浓度的调整，细胞可分化为接近屠宰肉的组织细胞形态，获得的细胞培育肉口感和营养相较更好，具有很高的商业价值。权利要求书1页 说明书15页序列表（电子公布）附图9页CN 117511851 A2024.02.06CN 117511851 A1.水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用，其特征在于，使用水凝胶支架培。

3、养动物细胞；所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列选自如SEQ ID NO.219所示序列中的至少一种。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.1wt%1wt%。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.2wt%0.4wt%、或者0.5wt%0.7wt%。5.根据权利要求14任意一项所述应用，其特征在于，所述增稠剂选自胶原、明胶、matrigel、海藻酸钠或纳米纤维素中的至少一种。。

4、6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述增稠剂为胶原；所述增稠剂在所述水凝胶支架中的质量百分比为0wt%60wt%。7.根据权利要求14任意一项所述应用，其特征在于，所述动物细胞选自鸡和/或鸽子。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述动物细胞为成肌细胞。9.制备细胞培育肉的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、配制水凝胶支架，所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到；所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.1wt%1wt%；S2、使用步骤S1配制的水凝胶支架培养动物细胞。10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，步。

5、骤S2所述培养的温度为3741，接种量为0.51.5105个/mL；所述水凝胶支架中还添加有46ng/mL的bFGF和812ng/mL的IGF1。权利要求书1/1 页2CN 117511851 A2水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用技术领域0001本发明涉及食品生产加工及细胞培养技术领域，尤其涉及一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用。背景技术0002在人口和收入增加的推动下，肉类总消费量将一直处于持续上升的态势，传统畜牧业将无法满足未来人类对肉类的需求，传统畜牧业带来的环境污染问题也不容小觑。细胞培育肉又被称作生物培育肉、细胞培养肉、清洁肉等，是利用动物细胞体外培养的方式控制其快速增殖、定向。

6、分化并收集加工而成的一种新型肉类食品。众多研究表明与传统肉类生产方式相比，细胞培育肉的生产过程将占据更少的土地面积、消耗几乎可与忽略不计的淡水资源、在温室气体排放方面也具有较为明显的优势，同时细胞培育肉还可以避免动物饲喂和屠宰环节的病原性污染和药物残留风险，目前正朝着工业化的目标快速迭代发展。0003一块合格的培育肉不仅需要前期收获大量的细胞，也需要在收获细胞后诱导细胞分化最后形成组织，使产品尽可能地接近我们目前食用的屠宰肉。传统的细胞培养方案无法满足培育肉对细胞数量的需求。0004按照美国FDA（Food and Drug Administration，简称为FDA）的定义，细胞培育肉的生产。

7、过程主要包括四个步骤：细胞库构建、细胞增殖、细胞分化、细胞收获。细胞培育肉的工业化发展仍然存在着一些重要的技术障碍限制了其生产规模的放大和商用进展：（1）细胞培养和分化技术研究；（2）非动物源性培养基的开发和优化；（3）高效生物反应器的研制；（4）适合细胞体外3D生长支架的研发。目前，在细胞培育肉用细胞支架方面的研究进展主要有以下两类，一类是通过促进细胞黏附生长的新型支架开发实现种子细胞的体外3D培养和分化。Shulamit Levenberg团队利用大豆蛋白开发了一种组织化大豆蛋白支架用于牛骨骼肌肉组织的3D培养，组织的最高孔隙率可达56%但直径小于50 m的小空隙仅占其中15%。另一类是通。

8、过微载体的利用和开发实现细胞的体外立体培养，Mark J.Post 团队开发了一种基于传统商业微载体Cytodex 1和Synthemax II的牛成肌细胞体外大规模扩增技术工艺，相较于平面培养而言微载体的使用使牛成肌细胞的培养密度得以大幅提升。然而，上述支架材料虽然都能够实现不同类种子细胞的增殖或者分化，但存在着几个突出的问题无法彻底解决：1）支架材料的孔隙率和细胞占比低、2）支架材料的食安风险、3）支架材料的生产成本高和规模难以放大、4）支架材料的动物源性原材料来源。上述这些因素极大限制了材料的工业化应用价值开发。0005有鉴于此，特提出本发明。发明内容0006为解决上述技术问题，本发明提。

9、供一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用，细胞在水凝胶支架中能大量增殖，培养获得的食用肉品质稳定，在培育肉的商业生产中具有较高的商业价值。说明书1/15 页3CN 117511851 A30007具体的，本发明的技术方案如下：第一方面，本发明提供了一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用，使用水凝胶支架培养动物细胞；所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到。SEQ ID NO.1：FFFFFGSIIPGGVVGPGGVG。0008本发明以多肽在水凝胶体系中形成纳米纤维网络结构，作为细胞培养的支架，细胞可以在该支架中大量增殖。同时，。

10、随着多肽在水凝胶中浓度的调整，细胞可分化为接近屠宰肉的组织细胞形态，获得的细胞培育肉营养成分均衡，具有很高的工程化应用价值。0009优选地，所述多肽的氨基酸序列选自以下所示序列（SEQ ID NO.219）中的至少一种：SEQ ID NO.2：RGDFFFFFGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.3：FRGDFFFFGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.4：FFRGDFFFGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.5：FFFRGDFFGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.6：FFFFRGDFGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.。

11、7：FFFFFRGDGSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.8：FFFFFGRGDSIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.9：FFFFFGSRGDIIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.10：FFFFFGSIRGDIPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.11：FFFFFGSIIRGDPGGVVGPGGVG，SEQ ID NO.12：FFFFFGSIIPGGVRGDVGPGGVG，SEQ ID NO.13：FFFFFGSIIPGGVVRGDGPGGVG，SEQ ID NO.14：FFFFFGSIIPGGVVGRGDPGGVG，SEQ ID NO.15：FFFF。

12、FGSIIPGGVVGPRGDGGVG，SEQ ID NO.16：FFFFFGSIIPGGVVGPGRGDGVG，SEQ ID NO.17：FFFFFGSIIPGGVVGPGGRGDVG，SEQ ID NO.18：FFFFFGSIIPGGVVGPGGVRGDG，SEQ ID NO.19：FFFFFGSIIPGGVVGPGGVGRGD。0010在本发明提供的优选方案及实施例中，所述多肽的氨基酸序列为：SEQ ID NO.19：FFFFFGSIIPGGVVGPGGVGRGD。0011本发明对所述多肽的来源不作特别限定，本领域常规来源如利用固相肽合成技术合成得到均可。0012优选地，所述多肽在所述水。

13、凝胶支架中的质量百分比为0.1wt%1wt%。0013可选地，所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.1wt%、0.2wt%、0.3wt%、0.4wt%、0.5wt%、0.6wt%、0.7wt%、0.9wt%、1.0wt%，或者上述任意两数值构成的区间范围内的值。0014优选地，所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.2wt%0.4wt%、或者0.5wt%0.7wt%。当所述多肽在水凝胶支架中的质量百分比为0.2wt%0.4wt%时，更有助于细胞的增殖。而当所述多肽在水凝胶支架中的质量百分比为0.5wt%0.7wt%时，更有助于细胞的分化。说明书2/15 页4CN 117511851 。

14、A40015本发明研究发现，当多肽在水凝胶支架中的浓度较低时，细胞可以在支架中大量增殖，而提高多肽在水凝胶支架中的浓度，细胞则可以开始分化。本发明提供的水凝胶支架可以作为成肌细胞良好的体外大规模培养支架，通过调整水凝胶的浓度将有不同的应用，在未来培育肉的商业生产中也会有较好的用途。0016进一步地，本发明所述水凝胶支架包括增稠剂。0017本发明对所述增稠剂的具体种类和来源不作特别限定，本领域适于细胞培养添加的无毒、具有较好生物相容性的增稠剂均可。0018优选地，所述增稠剂选自胶原、明胶、matrigel、海藻酸钠或纳米纤维素中的至少一种。0019优选地，所述增稠剂为胶原；所述增稠剂在所述水凝胶。

15、支架中的质量百分比为0wt%60wt%。0020优选地，所述动物细胞选自鸡和/或鸽子。0021优选地，所述动物细胞为成肌细胞。0022第二方面，本发明提供了一种制备细胞培育肉的方法，包括如下步骤：S1、配制水凝胶支架，所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到；所述多肽在所述水凝胶支架中的质量百分比为0.1wt%1wt%；S2、使用步骤S1配制的水凝胶支架培养动物细胞。0023优选地，步骤S2所述培养的温度为3741，接种量为0.51.5105个/mL；优选地，在步骤S2所述培养过程中，所述水凝胶支架中还添加有46ng/mL的bF。

16、GF（碱性成纤维细胞生长因子）和812ng/mL的IGF1（胰岛素样生长因子1）。更优选地，bFGF的添加浓度为5ng/mL，IGF1的添加浓度为10ng/mL。0024本发明提供的制备细胞培育肉的方法利用水凝胶支架培养获得细胞培育肉。其中，成肌细胞既可以在水凝胶支架体系中快速增殖，又能根据多肽浓度的变化实现生肌分化。通过脂质组学分析，利用本发明制备的鸡源细胞培育肉中共含有297种脂质，其中Cer类脂质3种、MG类脂质4种、DG类脂质52种、TG类脂质102种、LPC类脂质32种、LPE类脂质2种、LSM类脂质1种、PC类脂质59种、PE类脂质20种、PS类脂质2种、SM类脂质20种；成肌细胞。

17、在向细胞培育肉分化过程中共有69类脂质物质发生了显著含量变化，其中含量升高的脂质物质有26种，主要是PE和TAG类脂质，含量降低的脂质物质有43种，主要是PC和DG类脂质。0025本发明提供的方法以水凝胶支架作为细胞培养载体，成本较低，且在培养细胞获得食品肉的过程中无需分离水凝胶支架，操作简单，适于工程化生产。0026有益效果：0027本发明提供了一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用，所述水凝胶支架包括多肽、增稠剂和水；所述多肽由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列插入RGD序列修饰得到。本发明以多肽在水凝胶体系中形成纳米纤维网络结构，作为细胞培养的支架，细胞可以在该支架中大量增殖。同时，。

18、随着多肽在水凝胶中浓度的调整，细胞可分化为接近屠宰肉的组织细胞形态，获得的细胞培育肉营养成分均衡，具有很高的商业价值。说明书3/15 页5CN 117511851 A5附图说明0028为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。0029图1为本发明实施例中不同浓度水凝胶支架的照片（A、含有0.1 wt%多肽的水凝胶的宏观照片，B、含有0.3 wt%多肽的水凝胶的宏观照片，C、含有0.6 wt%多肽的水凝胶的宏观照片，D、含有0.1 wt%多肽的水凝胶的微观FESEM照片，E、含有0.3 wt%多肽的水凝胶的微观FESEM照片，F、含有0。

19、.6 wt%多肽的水凝胶的微观FESEM照片）。0030图2为本发明实施例中不同浓度水凝胶支架的流变特性结果（右侧从上到下依次表示0.1 wt%、0.3 wt%和0.6 wt%多肽浓度基于时间扫描流变能力模式下的水凝胶支架模量；左侧从上到下依次表示0.1 wt%、0.3 wt%和0.6 wt%多肽浓度基于动态频率流变能力模式下的水凝胶支架模量）。0031图3为本发明实施例中不同浓度水凝胶支架的红外光谱谱图。0032图4为本发明实施例中原代鸡成肌细胞成肌分化前后的形态学观察结果（A、D分别表示用DAPI染色的处于增殖和分化状态的鸡成肌细胞的细胞核的形态学；B、E分别表示用FITC Phalloi。

20、din染色的处于增殖和分化状态的鸡成肌细胞的F肌动蛋白的形态；C，F分别表示鸡成肌细胞的细胞核和F肌动蛋白的形态的合并图像。比例尺均为100m）。0033图5为本发明实施例中细胞在不同浓度的水凝胶上的生长情况（a1、a2、a3和a4为0.1wt%水凝胶支架，b1、b2、b3和b4为0.3wt%水凝胶支架，c1、c2、c3和c4为0.6wt%水凝胶支架。a1、b1和c1的培养时间为24 h，a2、b2和c2的培养时间为48 h，a3、b3和c3的培养时间为96 h，a4、b4和c4的培养时间为120 h。图中的标尺长度为100 m）。0034图6为本发明实施例中不同浓度水凝胶中鸡成肌细胞的增殖和。

21、营养物质消耗曲线（A、鸡成肌细胞的增殖曲线；B、鸡成肌细胞增殖结果的方差分析；C、鸡成肌细胞培养过程培养基中葡萄糖的浓度变化；D、鸡成肌细胞培养过程培养基中谷氨酰胺Gln的浓度变化；E、鸡成肌细胞培养过程培养基中精氨酸Arg的浓度变化；F、鸡成肌细胞培养过程培养基中丝氨酸Ser的浓度变化；G、鸡成肌细胞培养过程培养基中蛋氨酸Met浓度变化；H、鸡成肌细胞培养过程培养基中异亮氨酸Leu的浓度变化）。0035图7为本发明实施例中PCMSC在0.6wt%浓度多肽水凝胶中的分化及其在分化前后的特征标记（A、鸡成肌细胞在接种24 h、72 h和120 h后的生长形态；B、鸡成肌细胞在接种24 h、72 。

22、h和120 h后细胞中Pax7、MYOD和MYOG mRNA的相对表达水平；C、鸡成肌细胞在接种24 h、72 h和120 h后细胞中MYHC蛋白的表达含量；D、鸡成肌细胞分化前后的葡萄糖、谷氨酰胺Gln、谷氨酸Glu吸收和乳酸分泌；E、鸡成肌细胞分化前后亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、缬氨酸Val的吸收。比例尺均为100m）。0036图8为本发明实施例中鸡成肌细胞成肌分化前后脂质分子的Splot曲线。0037图9为本发明实施例中鸡成肌细胞成肌分化前后差异脂质分子的Heat map图。具体实施方式0038种子细胞的体外大规模扩增培养是实现细胞培育肉规模化生产的关键技术环节，由于目前用于细胞培育肉。

23、生产的种子细胞均需以贴壁培养的方式体外培养，因此探究可食用、高效的新型成肌细胞体外扩增形式对于破解细胞规模扩增难题至关重要。说明书4/15 页6CN 117511851 A60039多肽水凝胶具有高含水量、可调机械稳定性、快速自愈能力、良好的生物相容性、合适的注射性和较低的毒性等优点，已经广泛应用于不同的生物医学领域，如药物输送、蛋白质分离、生物传感器、组织工程和伤口愈合等。随着生物支架材料的快速发展，肽序列的设计越来越具有可行性。与其他基于动物细胞生物提取物以及其他基于交联产生水凝胶相比，具有完全的生物相容性，且不含任何动物源组分及对于细胞有毒的交联剂等成分，可在培养体系通过自组装形成网络结。

24、构，并且通过共价嵌入RGD等细胞粘附序列提高其生物相容性，从而在体外创建与组织内生长细胞类似的微环境。因此这种材料将有可能通过为细胞创造一个良好的3D生长环境在细胞培育肉用细胞的体外大规模培养方面有极高的应用前景。0040本发明提供了一种多肽水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用。本发明通过探究不同浓度的多肽水凝胶溶液的流变性能测试、细胞体外三维培养验证及生物相容性分析，发现细胞在可以在浓度为0.1wt%的水凝胶里进行三维培养，但是在低浓度溶液里，细胞呈球形悬浮在支架内生长；当浓度达到0.3wt%后，成肌细胞会黏附在水凝胶的纤维上，伸展并增殖；浓度为0.6wt%时，则水凝胶浓度更高，在促使细胞黏附。

25、生长的同时又一定程度抑制了细胞往外延伸，成肌细胞在支架中会逐渐融合，呈现分化的趋势，并且更高浓度的溶液会出现无法更换培养基的问题。本发明进一步通过细胞在不同浓度的溶液中生长的增殖率比较，发现多肽水凝胶在0.3wt%浓度下最适宜细胞生长增殖，可以应用于肌肉干细胞的体外大规模培养。本发明再进一步通过对更高浓度支架内的鸡成肌细胞内的成肌相关基因的探究，发现基因PAX7和MYOD随时间增长表达量逐渐降低，而成肌分化的终末表达基因MYOG的表达则先升高再降低，这些说明鸡成肌细胞在高浓度支架里正在逐渐失去成肌分化的潜力，成肌细胞逐渐呈分化趋势，从显微观察结果也可看出细胞正逐渐形成肌管以及有可能将进一步形成。

26、组织。经实验验证，本发明提供的多肽水凝胶在浓度为0.3wt%及以上浓度时，适宜细胞的体外三维培养。通过调整水凝胶的浓度，不同的浓度适宜不同的细胞生长状态。更高浓度的水凝胶更适宜细胞的生长分化。0041下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。0042以下实施例中所用材料包括：胎牛血清(10099141C)购买自热电公司；DMEM(H)（12100）,CCK8（CA1210）购买自北京索莱宝科技有限公司。0043实施例1本实施例提供了不同浓度水凝胶支架培养。

27、鸡成肌细胞的实验方法及结果，具体如下：（一）实验方法1.1 细胞提取和培养采用酶消化法和梯度贴壁法，从18日龄的鸡胚的腿部肌肉中分离成肌细胞（JOO S T,CHOI J S,HUR S J,et al.A Comparative Study on the Taste Characteristics of Satellite Cell Cultured Meat Derived from Chicken and Cattle Muscles J.Food science of animal resources,2022,42(1):17585.）。选择18日龄的鸡胚，取下说明书5/15 页7C。

28、N 117511851 A7鸡的腿部的肌肉组织块，剔除脂肪组合和结缔组织后，喷洒70%酒精灭菌。用眼科剪在将肌肉组织剪碎后，加入5倍体积的0.25%胰酶EDTA溶液（Solarbio，T1300）后在37温度酶解反应30 min。酶解结束后，离心机300g，5min后获得酶解后的细胞团。用含10%FBS（Gibco，10099141）的DMEM培养基（Solarbio，11995）重悬细胞后，用100m的滤网(Corning，352360)过滤后，含细胞的滤液直接接种到培养皿中，然后将培养皿放置到37，5%CO2的培养箱中。培养1h后，由于成纤维细胞会比成肌细胞先贴壁，所以收集上清液，离心机3。

29、00g，5min后得到细胞团，10%FBS培养基重悬后，重新接种到培养皿里，在培养细胞占满皿底至80%时，胰酶消化传代。00441.2 免疫荧光染色将细胞培养到细胞在培养皿底部生长汇合至80%时，吸出原来的培养基，用DPBS润洗一次培养皿的底部后，加入含2%马血清的培养基，诱导成肌细胞分化。观察细胞生长形态，并分化前和分化后的细胞进行细胞核和细胞骨架染色，细胞用DPBS清洗后，加入4%多聚甲醛溶液，室温固定15分钟，然后使用DPBS清洗。使用含0.5%Triton X的DPBS溶液渗透 15 分钟，然后DPBS清洗。然后用FITC标记的鬼笔环肽稀释液和Hoechst 33342染色液稀释液，室。

30、温染色30分钟，最后用显微镜观察并拍照。00451.3 扫描电子显微镜分析每个浓度的样品取 10 L 液滴沉积在铜板上并在空气中干燥，在场发射扫描电子显微镜（mira3 TESCAN）下观察浓度为 0.1 wt%，0.3 wt%，0.6 wt%的支架的纳米纤维网络。00461.4 流变特性分析使用配备有 20 mm 平行板的流变仪在 37 下对不同浓度（0.1 wt%、0.3 wt%和0.6 wt%）的水凝胶进行流变剪切测量。对水凝胶溶液进行以1 Hz 的稳定频率，先以100%的应力对水凝胶进行破坏，然后再以 1%的应力的稳定剪切应变，时间持续 30min，收集它们的储能和损耗模量（G和G）。。

31、00471.5 傅立叶变换红外光谱分析将样品烘干后，将样品与KBr粉末一起在研钵中充分研磨成混合的粉末后，用压片机压成近乎透明的薄片，使用傅里叶红外光谱仪上机测试。对不同浓度的支架进行表面官能团的分析。00481.6 细胞形态观察在96孔板中，分别将细胞接种在0.1 wt%、0.3 wt%和0.6 wt%浓度的水凝胶里，使用光学显微镜观察细胞在水凝胶支架上的生长状况，探究不同浓度的水凝胶对细胞的支撑性能，以及细胞在支架中的三维生长形态。00491.7 细胞活力测定分别将200l浓度为0.1 wt%、0.3 wt%和0.6 wt%的水凝胶溶液加入到96孔板中，每个孔接种20000个细胞，重复3个。

32、平行。使用CCK8试剂盒检测细胞在水凝胶支架中的增殖率。在细胞接种的后的0h检测第一次，之后每隔24h检测一次，直到第120h，每次通过酶标仪在450nm记录吸光度值。00501.8 RTPCR 分析将成肌细胞接种到水凝胶支架培养后，通过离心法，收集浓度为0.6wt%的水凝胶说明书6/15 页8CN 117511851 A8中的细胞。离心后得到细胞沉淀，先细胞沉淀用PBS清洗一遍后，尽可能的去除培养基和水凝胶，然后通过RNA提取试剂盒（QIGEN，73404）提取RNA，通过cDNA 逆转录试剂盒（Takara，RR037Q）将 RNA 逆转录成 cDNA。生成的 cDNA 用于定量实时 PC。

33、R (RTPCR)，使用 GAPDH，PAX7，MYOD，MYOG的序列特异性引物对（表1）。PCR 扩增由实时荧光定量PCR仪（Roche，LightCycler 480 II）进行。0051表1:实时 PCR 引物序列00521.9 葡萄糖和乳酸分析使用配备有ELSD检测器的安捷伦1260 Infinity仪器进行葡萄糖的HPLC分析。色谱柱为Shimpack GIST NH2（4.6250mm，5m），总流速为1mL/min，流动相A为乙腈，流动相B为水（表2）。在OpenLAB CDS中进行分析，结果以绝对浓度表示，并通过标准曲线校正作为内源性对照。0053表2:葡萄糖分析过程中的流动。

34、相条件00541.10 乳酸分析使用配备有SPD20A UV检测器（210nm）的岛津LC20A进行乳酸的HPLC分析。色谱柱为Athena C18WP（100，4.6150mm，5m），总流速为1mL/min，流动相A为0.1mol/L NH4H2PO4溶液，流动相B为MeOH（表3）。在实验室溶液中进行分析，结果以绝对浓度表示，并通过标准曲线作为内源性对照进行校正。说明书7/15 页9CN 117511851 A90055表3:乳酸分析过程中的流动相条件00561.11 氨基酸分析使用配备有1260 DAD检测器（338nm和262nm）的安捷伦1260 Infinity仪器进行氨基酸的H。

35、PLC分析。色谱柱为Athena C18WP（100，4.6150mm，5m），总流速如表4所示，流动相A为40mmol/L的NaH2PO4溶液，需要用NaOH将pH调节至7.8，流动相B为MeOH:ACN:H2O=45:45:10（V:V:V）。在OpenLAB CDS中进行分析，结果以绝对浓度表示，并通过单点曲线作为内源性对照进行校正。0057表4:氨基酸分析过程中的流动相条件00581.12 数据分析使用Prism软件（GraphPad，v9.5）和Origin 2023软件（OriginLab，v2023）进行统计分析。所有实验至少重复三次，数据表示为平均值和平均值的标准误差（显示为误。

36、差线）。并对数据进行单因素方差分析，小于 0.05 的 P 值被认为具有统计学意义。0059（二）实验结果1.多肽水凝胶的表征1.1 微观结构通过扫描电镜观察不同浓度的水凝胶经过冷冻干燥后的微观结构，结果见图1。0060图1中，A、D为浓度0.1wt%的水凝胶支架微观结构，B、E为浓度0.3wt%的水凝胶支架微观结构，C、F为浓度0.6wt%的水凝胶支架微观结构。可以看出，水凝胶溶液呈现出一种多孔的网状的有序立体结构。支架多孔的结构更有利于细胞的贴附与生长，迁移，以及运输营养物质和代谢废物。对比0.1wt%的低浓度，0.3wt%和0.6wt%的高浓度溶液形成了更致密的网络。00611.2 机械。

37、性能说明书8/15 页10CN 117511851 A10流变测试说明本发明提供的水凝胶有着良好的自我修复能力，结果见图2。0062图2中，A、D为浓度0.1wt%的水凝胶支架机械性能，B、E为浓度0.3wt%的水凝胶支架机械性能，C、F为浓度0.6wt%的水凝胶支架机械性能。可以看出，水凝胶在足够强的应变下被破坏，极大应变移去后，水凝胶能够重新凝胶化的过程，随着时间的上升水凝胶溶液的储能模量G 逐渐增加。浓度为0.1wt%的水凝胶溶液的储能模量恢复速度较慢，在600s后，材料的储能模量才逐渐升高然后高于损失模量，而浓度为0.3wt%和0.6wt%的水凝胶溶液则较早地恢复呈凝胶状态。并且浓度不。

38、同，水凝胶溶液的储能模量也有差异，浓度更高的溶液的储能模量更高。剪切稀化水凝胶在施加剪切时会降低粘度，这是通过可逆交联机制实现的。在开始的对凝胶施加一个较强的剪切应后，稀释后的不同浓度的水凝胶在不同的剪切力的作用下均呈现出剪切变稀的结果，水凝胶溶液的储能模量低于损失模量，水凝胶逐渐呈现出流动的液体的特性。此时较强的剪切应力会破坏凝胶结构，材料内部的氢键断裂，但这种破坏是暂时的，一旦应变或应力停止作用，分子间的氢键重连，实现重新组装，水凝胶的储能模量又逐渐上升逐渐高于损失模量，此时水凝胶又从液体恢复为凝胶状态，这说明材料具有一定的自修复能力。实际应用中，吹打、震荡、注射、过滤、喷涂等操作均会对材。

39、料施加巨大的剪切应变或剪切应力，进行上述操作时，肽水凝胶会稀化成液态，当操作终止，材料恢复成水凝胶。00631.3 官能团分析通过傅里叶红外光谱，分析水凝胶支架的表面官能团，FITR图谱见图3。0064可以看出，水凝胶支架在3429cm1显示为NH伸缩振动，在1637cm1显示为酰胺 I键的C=O伸缩震动，在1550cm1，1402cm1处显示为酰胺键的NH基团的弯曲振动和CN基团的伸缩振动，酰胺III键的CN 的平面振动（DAS M,R S,PRASAD K,et al.EXTRACTION AND CHARACTERIZATION OF GELATIN:A FUNCTIONAL BIOPO。

40、LYMER J.International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,2017,9:239.），这将说明此水凝胶支架显示出含有酰胺键。由水凝胶的说明中可知，材料共价嵌入 RGD等细胞黏度序列。RGD是用于细胞粘附并促使细胞附着的三肽 ArgGlyAsp序列，现被发现主要存在于 ECM 蛋白和血液中（MACPHERSON D,BRAM Y,PARK J,et al.Peptidebased scaffolds for the culture and maintenance of primary human hepatocyte。

41、s J.Scientific Reports,2021,11(1):6772.）。通过使材料与RGD肽偶联或者接枝实现材料的表面功能化，本水凝胶通过RGD序列的共价结合，也将有效地为肌细胞的体外三维培养提供黏附位点，有助于促进细胞生长。00652.细胞提取和培养2.1鸡成肌细胞的提取成肌细胞在体外培养后，通过加入马血清可以将细胞诱导分化并形成肌管，结果见图4。0066图4中的图片顺序从左至右依次为细胞核染色、细胞骨架染色、合并。A、B、C为分化前，D、E、F为诱导分化后。可以看出，成肌细胞会在培养皿上逐渐贴壁生长，经诱导分化后，部分成肌细胞逐渐融合并形成肌管。这表明成功提取出鸡的成肌细胞，然后。

42、成肌细胞可以在体外培养并被诱导分化。00672.2 多肽水凝胶中鸡成肌细胞的培养说明书9/15 页11CN 117511851 A11为了验证支架的生物相容性，分别将培养的肌肉干细胞以1105个/mL的浓度接种在0.1wt%，0.3wt%，0.6wt%的水凝胶支架上，并通过显微镜每天观察细胞的生长状态，结果见图5。0068图5中，a1、a2、a3、a4为0.1wt%水凝胶支架，b1、b2、b3、b4为0.3wt%水凝胶支架，c1、c2、c3、c4为0.6wt%水凝胶支架。从上至下依次为第一天，第二天，第四天和第五天的细胞生长情况。可以看出，当浓度为0.1wt%时，细胞将不会贴附在96孔板的底部。

43、，而是能在立体的空间里生长，此时细胞的形态呈球形，水凝胶中的细胞会通过一个细胞分裂成两个细胞来增殖。而当浓度到达0.3wt%时，细胞则会在纤维上黏附，伸展，在三维空间中呈现出贴壁培养时的细胞形态，并且浓度越高，细胞在浓度为0.6wt%的支架上的伸展状态更为明显。00692.3 鸡成肌细胞在多肽水凝胶中的增殖通过CCK8实验来研究细胞在不同浓度支架上的细胞增殖率，结果见图6。0070图6中，A、鸡成肌细胞的增殖曲线；B、鸡成肌细胞增殖结果的方差分析；C、鸡成肌细胞培养过程培养基中葡萄糖的浓度变化；D、鸡成肌细胞培养过程培养基中谷氨酰胺Gln的浓度变化；E、鸡成肌细胞培养过程培养基中精氨酸Arg的。

44、浓度变化；F、鸡成肌细胞培养过程培养基中丝氨酸Ser的浓度变化；G、鸡成肌细胞培养过程培养基中蛋氨酸Met浓度变化；H、鸡成肌细胞培养过程培养基中异亮氨酸Leu的浓度变化。可以看出，与通过在96孔板上的贴壁2D培养相比，成肌细胞在水凝胶支架上的生长速率均显著高于细胞二维培养的控制组，不同浓度的支架上细胞的生长速率也呈现不同的差别。相较于0.1wt%的支架浓度体系，细胞在在0.3wt%的支架上的增殖率更高。0071在贴壁培养中，细胞贴附在塑料表面以单层形式生长，此时细胞培养成本较低，操作简便。但是由于细胞生长与组织中环境不同，细胞的形态会发生一定的改变，此时细胞分化、增殖、活力、基因和蛋白质的表。

45、达、对刺激的反应、药物代谢和其他细胞功能都会趋向于不利的方向的改变（KAPA CZYSKA M,KOLENDA T,PRZYBY A W,et al.2D and 3D cell cultures a comparison of different types of cancer cell cultures J.Arch Med Sci,2018,14(4):9109.）。而三维培养则因为模仿细胞外基质的环境，可以较好地减少细胞体外培养带来的问题。当细胞三维培养时，在非粘附条件下的一些细胞表现出细胞与细胞和细胞与基质相互作用减少，失去锚定，形成细胞球。因此当浓度较低时，水凝胶为虽然会为细胞提供。

46、一定的支撑，使细胞不会在像接种在液体培养基里时，沉降到培养皿底部，但是此时的环境仍然为一个不适宜细胞黏附的条件，此时细胞在培养基中呈现为细胞球的形态（参见图5中a1、a2、a3和a4）。随着支架材料浓度的升高，水凝胶含量更高，则支架对细胞生长的支撑作用则更强，支架材料为细胞提供了一定的黏附位点。此时，细胞可以像贴壁的细胞那样，在支架内的纤维上黏附，呈现伸展的形态，因此可以在更高的浓度中看到成肌细胞不再是球形，而是在三维空间上呈现往外生长的趋势（参见图5中b1、b2、b3和b4）。0072贴壁细胞需要黏附在一定介质上生长，当细胞与底物相互作用时，它们通过扩张板状伪足和丝状伪足来探索环境。因此支架。

47、本身的理化性质（支架的形态、孔径和表面形貌等）可以直接影响细胞的行为。细胞增殖率的结果（图6中A图）证实，高浓度的水凝胶支架可以为细胞提供一个可以贴附的表面，使呈现伸展形态，细胞之间的可以进行一定的信息交流，最后细胞的增殖率也高于呈球形的细胞，也就是说，浓度达到0.3wt%及以上的支架更利说明书10/15 页12CN 117511851 A12于肌肉干细胞在三维空间上生长。但水凝胶浓度过高，则会使溶液更粘稠，又反过来可能抑制细胞的伸展，最后使成肌细胞趋于融合而有分化的趋势。因此，我们进一步通过基因、蛋白检测和代谢分析等实验进一步验证生长在此浓度下的水凝胶中的细胞的生长状态。同时，我们还观察到，。

48、当浓度到达0.6wt%时，第5天时，在未加分化培养基的条件下，有成肌细胞有分化的趋势，正在逐渐形成肌纤维（参见图5中c1、c2、c3和c4)。00733.多肽水凝胶中PCMs的分化含0.6wt%水凝胶体系中不同培养时期鸡成肌细胞中Pax7、MyoD和MyoG的相对mRNA表达水平的RTPCR检测和MYHC蛋白的WB检测以及营养代谢分析结果参见图7。0074可以看出，肌卫星细胞的标志基因PAX7和成肌分化早期基因MYOD在五天内逐渐呈下降趋势，成肌分化末期基因MYOG呈现先增高然后下降的趋势，MYHC呈上升表达的趋势。PAX7基因是肌卫星细胞静止和激活状态下的标记基因，在肌卫星细胞分化前的表达将。

49、急剧下降（OLGUIN H C,OLWIN B B.Pax7 upregulation inhibits myogenesis and cell cycle progression in satellite cells:a potential mechanism for selfrenewal J.Dev Biol,2004,275(2):37588.）。MYOD 主要在成肌分化过程中起作用，诱导前成肌细胞分化成成肌细胞；MYOG 则在肌细胞终末分化、肌纤维成熟及维持方面起作用，通常被认为是终末肌细胞分化的关键因子（王男,李剑锋,王莉晓,et al.Pax7,MyoD及MyoG基因用于推断损伤。

50、时间的初步研究 J.）。PAX7和MYOD基因的下调可以说明在0.6wt%浓度下生长的细胞正在逐渐失去肌卫星细胞的干性，而MYOG的先高表达再低表达则说明细胞正在往成肌细胞方向分化。这进一步验证了高浓度的水凝胶支架可以促进成肌细胞在三维生长过程中逐渐分化。MYHC在培养第三天时的高表达说明了肌肉中的重要标志物肌球蛋白重链的产生，证明了鸡成肌细胞生肌分化的完成。同时，从代谢分析结果可以看到，鸡成肌细胞在分化前后对葡萄糖和三种氨基酸的吸收速率是存在显著性差异的。0075因此，本发明提供了一种水凝胶支架在细胞培育肉制备中的应用，通过探究多肽水凝胶的组成，并尝试使用它作为成肌细胞的体外3D培养支架，在。