碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202311585663.X(22)申请日 2023.11.24(71)申请人 湖南金浩粮油工业有限公司地址 410200 湖南省长沙市望城经济技术开发区铜官循环经济工业基地新源路210号(72)发明人 李艳张涛李逢蒋依霖胡金刚(74)专利代理机构 长沙市标致专利代理事务所(普通合伙)43218专利代理师 胡吟(51)Int.Cl.C11B 1/02(2006.01)C11B 1/04(2006.01)C11B 3/00(2006.01)(54)发明名称一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶。

2、籽油的方法(57)摘要本发明公开了一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，包括以下步骤：1)收集乳化液；2)提取内源性蛋白酶；3)碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳：向乳化液中加入蒸馏水和碱性蛋白酶进行一次酶解，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的0.52，一次酶解时间为T1，且60minT175min，按乳化液重量的0.61.4加入内源性蛋白酶进行二次酶解，二次酶解时间为T2，且15minT235min，一次酶解和二次酶解的总时间小于100min，得到油状乳液；4)灭酶、离心，得到成品油茶籽油。本发明采用碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳，不仅能提高破乳率和油茶籽油的提取率，还能够抑。

3、制苦味氨基酸的生成，使制备的油茶籽油不含有苦味，提高了油茶籽油的风味和品质。权利要求书2页 说明书11页 附图6页CN 117701330 A2024.03.15CN 117701330 A1.一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)收集采用水酶法提取鲜果油茶籽油过程中产生的乳化液；2)从茶籽饼粕中提取内源性蛋白酶；3)碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和碱性蛋白酶进行一次酶解，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的0.52，一次酶解时间为T1，且60minT175min，再按乳化液重量的0.61.4加入内源性蛋白酶进行二次酶解，二。

4、次酶解时间为T2，且15minT235min，一次酶解和二次酶解的总时间小于100min，得到油状乳液；4)灭酶、离心，得到成品油茶籽油。2.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤1)的具体操作步骤为：将油茶籽粉末与蒸馏水按料液比为1:17混合制成匀浆，按油茶籽粉末重量的23向匀浆中加入中性蛋白酶，在温度为55下酶解3h后于100下灭酶10min，冷却后离心，得到重固相、水相和混合相，收集混合相得到乳化液。3.如权利要求2所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤1)中，中性蛋白酶的酶活为50000U/。

5、g，所述离心的转速为4000r/min10000r/min，离心的时间为10min30min，油茶籽粉的水分含量为38。4.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤2的具体操作步骤为：a)将脱脂后的油茶籽饼粕和蒸馏水按照1：13的料液比进行混合，在121下灭菌20min；b)制备浓度为8.0107CFU/mL醋酸菌菌悬液以及8.0107CFU/mL酵母菌菌悬液；c)将醋酸菌菌悬液和酵母菌菌悬液以体积比为1:15进行混合，得到混合菌悬液；d)将混合菌悬液以接种量为1.02.5接种至灭菌后的油茶籽饼粕中，然后置于温度为3035下液态发酵35d，得。

6、到发酵产物，备用；e)采用发酵产物制备内源性蛋白酶的粗酶液，用浓度为0.08mol/LNaOH调节粗酶液的pH至4.5，使杂蛋白沉淀，离心得到透明上清液，经超滤、喷雾干燥，得到内源性蛋白酶。5.如权利要求4所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤b)中醋酸菌菌悬液的制备步骤为：将醋酸菌接种至HS平板培养基上以划线方式获得单菌落，然后将单菌落接种至HS培养基中，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液中的醋酸菌进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，确定醋酸菌菌悬液最终浓度为8.0107CFU/mL，备用；酵母菌菌悬液的制备步骤为：将酵母菌转接至。

7、麦芽汁琼脂培养基上以获得单菌落；然后将单菌落接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液的酵母菌进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，确定酵母菌菌悬液最终浓度为8.0107CFU/mL，备用。6.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤e)中粗酶液的制备步骤为：按体积比为1:2向发酵产物中加入4的去离子水混合，在10000rpm的转速下搅拌1min，静置40s后继续在10000rpm的转速下搅拌1min，循环操作5次后在4下保留10min以使内源性蛋白酶充分浸出；再将浸出液在8000rpm下离心10m。

8、in，保留上清液，即为粗酶液。7.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，权利要求书1/2 页2CN 117701330 A2其特征在于，所述步骤3)中的蒸馏水按料液比为11:3加入至乳化液中，所述一次酶解时的温度为4060，pH为89，所述二次酶解时的温度为6070，pH为35。8.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶的酶活为5000U/g，内源性蛋白酶的酶活为5000U/g。9.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述一次酶解的时间为60min，所述。

9、二次酶解的时间为15min。10.如权利要求1所述一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其特征在于，所述步骤4)的具体操作步骤为：将油状乳液于100下灭酶10min后在8000r/min下离心10min。权利要求书2/2 页3CN 117701330 A3一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法技术领域0001本发明涉及食用油加工技术领域，特别涉及一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法。背景技术0002油茶是我国特有的木本食用油料树种，有2000多年的栽培和利用历史，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物，与乌桕、油桐和核桃并称为我国四大。

10、木本油料植物。油茶籽含油量在2035之间，油茶籽油是一种营养价值高且具有一定保健功能的木本植物食用油。油茶籽油易于被人体吸收，对预防心脏病、血管硬化以及治疗高血压大有好处，被誉为“东方橄榄油”。0003目前，常见的油茶籽油的提取方法包括有机溶剂浸提法、物理压榨法和水酶法。其中，水酶法是利用水作为提取介质的同时添加具有破坏植物细胞壁或油脂体结构的酶，来提取出细胞中的油脂，再利用蛋白和碳水化合物对油和水的溶解度差异分离获得油脂的工艺。水酶法的优势是在提取油脂的同时能有效回收原料中的蛋白质(或其水解产物)及碳水化合物，且在提油过程中一些油料中的有毒或抗营养因子能被很好地除去。然而，在采用水酶法提油的。

11、过程中会产生大量的乳状液，被提取出来的油进入乳状液中导致游离油难以分离，使得提油率不高，导致经济效益下降，需要经过适当的破乳才能够回收其中的油。0004常 见 的 破 乳 方 法 是 在 乳 状 液 中 加 入 碱 性 蛋 白 酶，如 专 利 申 请 号 为CN201510589650.9公开了一种水酶法提取茶叶籽油的破乳处理方法，其采用离心方式收集水酶法提取茶叶籽油过程中产生的乳状液，并通过碱性蛋白酶来破坏乳状液的稳定性而获得清油，提高茶叶籽油的提油率，提高经济效益。采用本发明方法，通过选择合适的反应条件，破乳率可达92.1，为茶叶籽工业化应用解决了破乳的技术难题。0005上述方法采用碱性蛋。

12、白酶对水酶法提取的乳状液进行破乳，虽然能够在一定程度上提高破乳率，但在实际应用过程中发现，采用碱性蛋白酶破乳在破乳过程中会出现苦味，使制备的油茶籽油中含有苦味，不仅降低了成品油的口感，并且在破乳出现苦味时所制备的油茶籽油的提取率偏低。因此，如何解决碱性蛋白酶破乳时产生的苦味的同时提高油茶籽油的提取率成为亟待解决的问题。发明内容0006本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种工艺简单、可有效提高提取率、降低苦味的碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法。0007本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：包括以下步骤：1)收集采用水酶法提取鲜果油茶籽油过程中产生的乳化液；2)。

13、从茶籽饼粕中提取内源性蛋白酶；3)碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和碱性蛋白酶进行一次酶解，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的0.52，一次酶解时间为T1，且60minT175min，再按说明书1/11 页4CN 117701330 A4乳化液重量的0.61.4加入内源性蛋白酶进行二次酶解，二次酶解时间为T2，且15minT235min，且一次酶解和二次酶解的总时间小于100min，得到油状乳液；4)灭酶、离心，得到成品油茶籽油0008本发明先采用碱性蛋白酶对水酶法提取油茶籽油产生的乳化液进行一次酶解处理，可初步破坏乳化液的稳定性，实现对乳化液的初步破乳，使部分游离油从乳。

14、化液中逐渐被分离出来；随着酶解时间的延长，碱性蛋白酶在酶解过程中会生成苦味氨基酸，在破乳过程中，为了将形成苦味主要的苦味氨基酸的含量控制能够品尝到的阈值以下，本发明在一次酶解T1(60minT175min)时向一次酶解液中加入内源性蛋白酶进行二次酶解，内源性蛋白酶在该临界时间段(60minT175min)的添加不仅能够协同碱性蛋白酶进一步破坏乳化液的稳定性，使乳化液中残留的油脂被有效分离出来，提高油茶籽油的提取率，还能够及时有效抑制破乳过程中因碱性蛋白酶酶解产生的形成苦味主要的苦味氨基酸的生成，降低苦味氨基酸的生成速率，使苦味氨基酸在整个破乳过程中的含量始终保持在阈值以下，保证了油茶籽油不含有。

15、苦味，提高了油茶籽油的风味和品质。0009进一步，所述步骤1)的具体操作步骤为：将油茶籽粉末与蒸馏水按料液比为1:17混合制成匀浆，按油茶籽粉末重量的23向匀浆中加入中性蛋白酶，在温度为55下酶解3h后于100下灭酶10min，冷却后离心，得到重固相(粕类)、水相(含可溶性淀粉和蛋白质)和混合相(油茶籽油蛋白质水乳液相)，收集混合相得到乳化液。0010优选地，所述油茶籽粉末与蒸馏水的料液比为1：5。0011进一步，所述油茶籽粉末的制备方法为：选用刚采摘后的去杂油茶鲜果，进行色选，去除油茶鲜果青壳，备用；将去杂后的鲜果进入剥壳机中进行剥壳，随后进行破碎机中粉碎，备用；将粉碎后的油茶籽进行烘干，烘。

16、干的温度为100150，烘干时间为2040min。0012优选地，所述烘干温度为140，烘干时间为30min。0013进一步，所述步骤1)中，中性蛋白酶的酶活为50000U/g，所述离心的转速为4000r/min10000r/min，离心的时间为10min30min，油茶籽粉的水分含量为38。0014优选地，油茶籽粉末的水分含量为4。0015进一步，所述步骤2的具体操作步骤为：0016a)将脱脂后的油茶籽饼粕和蒸馏水按照1：13的料液比进行混合，在121下灭菌20min；0017b)制备浓度为8.0107CFU/mL醋酸菌菌悬液以及8.0107CFU/mL酵母菌菌悬液；0018c)将醋酸菌菌悬。

17、液和酵母菌菌悬液以体积比为1:15进行混合，得到混合菌悬液；0019d)将混合菌悬液以接种量为1.02.5接种至灭菌后的油茶籽饼粕中，然后置于温度为3035下液态发酵35d，得到发酵产物，备用；0020e)采用发酵产物制备内源性蛋白酶的粗酶液，用浓度为0.08mol/LNaOH调节粗酶液的pH至4.5，使杂蛋白沉淀，离心得到透明上清液，经超滤、喷雾干燥，得到内源性蛋白酶。0021优选地，所述油茶籽饼粕和蒸馏水的料液比为1：2，所述醋酸菌菌悬液和酵母菌菌悬液的体积比为1：4，醋酸菌菌悬液和酵母菌菌悬液的接种量为1.5，液态发酵的温度为33。0022进一步，所述步骤b)中醋酸菌菌悬液的制备步骤为：。

18、将醋酸菌接种至HS平板培养基上以划线方式获得单菌落(HS平板培养基的组成为：葡萄糖2，蛋白胨0.5，酵母浸粉说明书2/11 页5CN 117701330 A50.5，柠檬酸0.115，十二水合磷酸氢二钠0.68，0.1那他霉素，1.8琼脂，其余为无菌水，用醋酸将pH调至6.0)，然后将单菌落接种至HS培养基(HS培养基的组成为：葡萄糖2，蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，柠檬酸0.115，十二水合磷酸氢二钠0.68，其余为无菌水，用醋酸将pH调至6.0)中，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液中的醋酸菌进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，确定醋酸菌菌悬液最终浓度为8.0107CF。

19、U/mL，备用；0023酵母菌菌悬液的制备步骤为：将酵母菌转接至麦芽汁琼脂培养基(麦芽汁琼脂培养基的组成为麦芽汁提取物2，葡萄糖2，蛋白胨0.1，琼脂1.5，其余为无菌水)上以获得单菌落；然后将单菌落接种至酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基的组成为葡萄糖2，蛋白胨2，酵母浸粉1，其余为无菌水)中，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液的酵母菌进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，确定酵母菌菌悬液最终浓度为8.0107CFU/mL，备用。0024进一步，所述步骤e)中粗酶液的制备步骤为：按体积比为1:2向发酵产物中加入4的去离子水混合，在10000rpm的转速下搅拌。

20、1min，静置40s后继续在10000rpm的转速下搅拌1min，循环操作5次后在4下保留10min以使内源性蛋白酶充分浸出；再将浸出液在8000rpm下离心10min，保留上清液，即为粗酶液。0025进一步，所述步骤3)中的蒸馏水按料液比为11:3加入至乳化液中，所述一次酶解时的温度为4060，pH为89，所述二次酶解时的温度为6070，pH为35。0026优选地，所述步骤3)中的蒸馏水按料液比为1:1加入至乳化液中，所述一次酶解时的温度为55，pH为9，所述二次酶解时的温度为65，pH为4。0027进一步，所述碱性蛋白酶的酶活为5000U/g，其添加量为1，所述内源性蛋白酶的酶活为5000。

21、U/g，添加量为1。0028进一步，所述一次酶解的时间为60min，所述二次酶解的时间为15min。0029进一步，所述步骤4)的具体操作步骤为：将油状乳液于100下灭酶10min后在8000r/min下离心10min。0030本发明一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法的有益效果：0031(1)本发明的工艺简单，其先采用中性蛋白酶对油茶籽进行水酶法提取制备乳化液，然后采用碱性蛋白酶对乳化液先进行初步破乳，再采用内源性蛋白酶和碱性蛋白酶协同破乳的方法，在内源性蛋白酶和碱性蛋白酶的共同作用下，使破乳率和油茶籽油的提取率分别达到98和99.5，能够有效提高破乳率和油茶籽油的提取率；。

22、0032(2)本发明在采用碱性蛋白酶初步破乳6070min后及时添加内源性蛋白酶，能够及时有效抑制破乳过程中因碱性蛋白酶酶解产生的苦味氨基酸(缬氨酸和精氨酸)的生成，使在整个破乳过程中形成苦味贡献最大的缬氨酸和精氨酸的含量始终保持在阈值以下，解决了在油茶籽油制备过程中采用碱性蛋白酶形成苦味造成的困扰，保证了采用碱性蛋白酶破乳的方法制备的油茶籽油不含有苦味，提高了油茶籽油的风味和品质。附图说明0033图1为本发明一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法的说明书3/11 页6CN 117701330 A6工艺流程图；0034图2为碱性蛋白酶酶解不同时间对缬氨酸含量的影响图；0035图。

23、3为碱性蛋白酶酶解不同时间对精氨酸含量的影响图；0036图4为一次酶解时间对制备的成品油茶籽油提取率的影响图；0037图5为总酶解时间对成品油茶籽油提取率的影响0038图6为总酶解时间对缬氨酸含量的影响图；0039图7为总酶解时间对精氨酸含量的影响图；0040图8为总酶解时间对仅采用碱性蛋白酶破乳以及采用碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳时缬氨酸含量的影响总图；0041图9为总酶解时间对仅采用碱性蛋白酶破乳以及采用碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳时精氨酸含量的影响总图；0042图10为不同内源性蛋白酶添加量对缬氨酸增加值的影响图；0043图11为不同内源性蛋白酶添加量对精氨酸增加值的影响图。图1。

24、2为不同内源性蛋白酶添加量对油茶籽油提取率的影响图。具体实施方式0044以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。0045实施例10046一种碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备油茶籽油的方法，其工艺流程图如图1所示，包括以下步骤：00471)收集采用水酶法提取鲜果油茶籽油过程中产生的乳化液：0048S1.选用刚采摘后的去杂油茶鲜果，进行色选，去除油茶鲜果青壳，备用；0049S2.去杂后的鲜果进入剥壳机中进行剥壳，随后进行破碎机中粉碎，备用；0050S3.将粉碎后的油茶籽进行烘干，烘干的温度为140，烘干时间为30min，烘干后得到的油茶籽粉。

25、末的水分含量为4；0051S4.将烘干后的油茶籽粉末与蒸馏水按料液比1:5混合制成匀浆，按油茶籽粉末重量的3向匀浆中加入酶活为50000U/g的中性蛋白酶(CAS号为9068591，为现有技术公开的蛋白酶)，在温度为55下酶解3h后于100下灭酶10min，冷却后于10000r/min下离心10min，得到重固相(粕类)、水相(含可溶性淀粉和蛋白质)和混合相(油茶籽油蛋白质水乳液相)，收集混合相得到乳化液；检测乳化液中氨基酸的含量和品尝是否有苦味，氨基酸的检测方法参照文献 小麦蛋白低苦味肽的制备及其脱苦机理研究，刘伯业，测定油的提取率乳化液中油的重量/油茶籽粉末中油的重量100，结果表明，采用。

26、中性蛋白酶酶解后提取得到的乳化液中缬氨酸的含量为0.15mg/g，精氨酸的含量为0.1mg/g，没有苦味，提取率为55.2。00522)从茶籽饼粕中提取内源性蛋白酶：0053a)将脱脂后的油茶籽饼粕和蒸馏水按照1：2的料液比进行混合，在121下灭菌20min；0054b)制备浓度为8.0107CFU/mL醋酸菌(为现有技术中的醋酸菌AS1.41，可市场购说明书4/11 页7CN 117701330 A7得)菌悬液：将醋酸菌接种至HS平板培养基上以划线方式获得单菌落(HS平板培养基：葡萄糖2，蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，柠檬酸0.115，十二水合磷酸氢二钠0.68，0.1那他霉素，1.8琼脂，。

27、其余为无菌水，用醋酸将pH调至6.0)；然后接种2环单菌落至50mL HS培养基中(HS培养基：葡萄糖2，蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，柠檬酸0.115，十二水合磷酸氢二钠0.68，其余为无菌水，用醋酸将pH调至6.0)，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液中的醋酸菌进行计数，按照100mL HS培养基约1104CFU的比例进行接种，接种完成后30静置培养7d，培养结束后，采用稀释涂布平板法进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，将最终菌悬液浓度控制在8.0107CFU/mL；0055制备浓度为8.0107CFU/mL酵母菌(为现有技术中的安琪酿酒活性干酵母，可市场购得)菌悬液:。

28、将安琪酿酒活性干酵母转接至麦芽汁琼脂培养基上以获得单菌落(麦芽汁琼脂培养基：麦芽汁提取物2，葡萄糖2，蛋白胨0.1，琼脂1.5，其余为无菌水)；接种4环单菌落至在50mL酵母浸出粉胨葡萄糖培养基中(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基：葡萄糖2，蛋白胨2，酵母浸粉1，其余为无菌水)，30静置培养24h，作为种子液；采用稀释涂布平板法对种子液的酵母菌进行计数，用灭菌蒸馏水进行稀释，确定酵母菌菌悬液最终浓度为8.0107CFU/mL；0056c)将醋酸菌菌悬液和酵母菌菌悬液以体积比为1:4进行混合，得到混合菌悬液；0057d)将混合菌悬液以接种量为1.5接种至灭菌后的油茶籽饼粕中，然后置于温度为33下液态发酵。

29、5d，得到发酵产物，备用；0058e)按体积比为1:2向发酵产物中加入4的去离子水混合，在10000rpm的转速下搅拌1min，静置40s后继续在10000rpm的转速下搅拌1min，循环操作5次后在4下保留10min以使内源性蛋白酶充分浸出；再将浸出液在8000rpm下离心10min，保留上清液，即为内源性蛋白酶的粗酶液；0059用浓度为0.08mol/L的NaOH调节粗酶液的pH值至4.5，置于50下孵育6h，搅拌速度为70r/min；将孵育好的浆液，在室温下，3000rpm条件下离心5min，弃去沉淀，得到透明蛋白水解物上清液；将透明蛋白水解物上清液用8kDa超滤膜超滤，得到分子质量小于。

30、8kDa的滤液，并经旋转蒸发器进行浓缩，最后利用喷雾干燥器进行喷雾干燥，得到内源性蛋白酶；00603)碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶(即Alcalase酶，由41的水、50的甘油和9的枯草菌素组成，Novozymes,Denmark，为现有技术公开的蛋白酶)在温度为55、pH为9的条件下进行一次酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的1，一次酶解60min后，再按乳化液重量的1加入酶活为5000U/g的内源性蛋白酶(酶活检测方法参考SB/T 10317)，在温度为65、pH为4的条件下进行二次酶解，二次酶。

31、解时间为15min，一次酶解和二次酶解的总时间为75min，得到油状乳液；00614)灭酶、离心：所述步骤4)的具体操作步骤为：将油状乳液于100下灭酶10min后在8000r/min下离心10min，得到成品油茶籽油。对该成品油茶籽油进行食用油国标检测，结果为：酸价0.35mg/g，过氧化值0.029g/100g，水分及挥发物含量0.04，不溶性杂质0.03，均符合 GB/T 11765 2018油茶籽油 中水酶法一级油茶籽油的标准。0062实施例20063本实施例与实施例1的不同之处在于：一次酶解的时间为70min，二次酶解的时间说明书5/11 页8CN 117701330 A8为15mi。

32、n。对制备的成品油茶籽油进行食用油国标检测，结果为酸价0.36mg/g，过氧化值0.031g/100g，水分及挥发物含量0.041，不溶性杂质0.032，均符合 GB/T 11765 2018油茶籽油 中水酶法一级油茶籽油的标准。0064实施例30065本实施例与实施例1的不同之处在于：一次酶解的时间为60min，二次酶解的时间为35min。对制备的成品油茶籽油进行食用油国标检测，结果为酸价0.35mg/g，过氧化值0.030g/100g，水分及挥发物含量0.04，不溶性杂质0.035，均符合 GB/T 11765 2018油茶籽油 中水酶法一级油茶籽油的标准。0066对比例10067本对比例。

33、与实施例1的不同之处在于：去掉步骤2)，且仅采用碱性蛋白酶对制备的乳化液进行破乳，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：0068碱性蛋白酶破乳：向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶在温度为55、pH为9的条件下进行酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的2，酶解时间为75min，得到油状乳液。0069对比例20070本对比例与实施例1的不同之处在于：仅采用内源性蛋白酶对乳化液进行破乳，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：0071内源性蛋白酶破乳：向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的内源性蛋白酶在温度为65、pH为4的。

34、条件下进行酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，内源性蛋白酶的添加量为乳化液重量的2，酶解时间为75min，得到油状乳液。0072对比例30073本对比例与实施例1的不同之处在于：将破乳时协同碱性蛋白酶使用的内源性蛋白酶替换为风味蛋白酶，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：0074碱性蛋白酶和风味蛋白酶协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶在温度为55、pH为9的条件下进行一次酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的1，一次酶解60min后，再按乳化液重量的1加入酶活为5000U的风味蛋白酶在温度为50、pH为6的条件下进行。

35、二次酶解，二次酶解时间为15min，一次酶解和二次酶解的总时间为75min，得到油状乳液。0075对比例40076本对比例与实施例1的不同之处在于：将破乳时协同碱性蛋白酶使用的内源性蛋白酶替换为酸性蛋白酶，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：0077碱性蛋白酶和酸性蛋白酶协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶在温度为55、pH为9的条件下进行一次酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的1，一次酶解60min后，再按乳化液重量的1加入酶活为5000U的酸性蛋白酶在温度为55、pH为3.5的条件下进行二次酶解，二次酶解时间为15。

36、min，一次酶解和二次酶解的总时间为75min，得到油状乳液。0078对比例50079本对比例与实施例1的不同之处在于：将破乳时协同碱性蛋白酶使用的内源性蛋白酶替换为三氯蔗糖，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：说明书6/11 页9CN 117701330 A90080碱性蛋白酶和无水柠檬酸协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶在温度为55、pH为9的条件下进行一次酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的1，一次酶解60min后，再按乳化液重量的1三氯蔗糖，在温度为65、pH为4的条件下进行二次酶解，二次酶解时间为15min。

37、，一次酶解和二次酶解的总时间为75min，得到油状乳液。0081对比例60082本对比例与实施例1的不同之处在于：将破乳时协同碱性蛋白酶使用的内源性蛋白酶替换为无水柠檬酸，其他步骤均与实施例1相同，具体破乳操作步骤如下：0083碱性蛋白酶和无水柠檬酸协同破乳：先向乳化液中加入蒸馏水和酶活为5000U/g的碱性蛋白酶在温度为55、pH为9的条件下进行一次酶解，乳化液与蒸馏水的料液比为1:1，碱性蛋白酶的添加量为乳化液重量的1，一次酶解60min后，再按乳化液重量的1无水柠檬酸，在温度为65、pH为4的条件下进行二次酶解，二次酶解时间为15min，一次酶解和二次酶解的总时间为75min，得到油状乳。

38、液。上述实施例1与对比例16制备油茶籽油时的方法不同之处如表1所示：0084表1对比例16与实施例1制备成品油茶籽油时的方法的差异00850086本发明对实施例13以及对比例16制备的成品油茶籽油的提取率、破乳率、氨基酸的含量以及苦味进行了测定(缬氨酸苦味阈值0.4mg/g，精氨酸苦味阈值0.5mg/g)，结果如下表所示，提取率()成品油茶籽油的重量/油茶籽粉中油的重量100，破乳率()成品油茶籽油的重量/乳状液中油的重量100，油茶籽粉和乳状液中油的重量的检测方说明书7/11 页10CN 117701330 A10法为称重法。0087表2实施例1和对比例16制备的成品油茶籽油各项指标的测定结。

39、果008800890090从表2的检测数据中可看出，实施例1、2和3采用本发明中碱性蛋白酶和内源性蛋白酶协同破乳制备的成品油茶籽油的提取率达到了99.5，破乳率达到了98，且制备的成品油茶籽油不含有苦味，提高了油茶籽油的风味品质。0091与对比例1相比，实施例1制备的成品油茶籽油的提取率和破乳率均显著高于对比例1，缬氨酸和精氨酸的含量均显著低于对比例1，且均处于阈值以下，表明，本发明采用碱性蛋白酶和内源性蛋白酶处理经中性蛋白酶处理后的乳化液可有效提高破乳率，进而提高油茶籽油的提取率；且采用内源性蛋白酶处理经碱性蛋白酶一次酶解后的酶解液还能够有效抑制碱性蛋白酶在酶解过程中产生的苦味氨基酸(缬氨酸。

40、和精氨酸)的形成，使苦味氨基酸(缬氨酸和精氨酸)在整个破乳过程中的含量始终保持在阈值以下，起到明显改善苦味的效果，保证了油茶籽油不含有苦味，提高了油茶籽油的风味和品质。0092与对比例1相比，对比例2在破乳过程中均采用内源性蛋白酶处理乳化液确实具有很明显的去除苦味的效果，但破乳率和提取率均低于对比例1，且显著低于实施例1，表明，单独采用内源性蛋白酶处理乳化液无法获得提取率和破乳率高的油茶籽油。0093与对比例1相比，对比例36先采用碱性蛋白酶处理后分别采用常见的能够去除苦味的风味蛋白酶、酸性蛋白酶、三氯蔗糖和无水柠檬酸处理，对应的油茶籽油中缬氨酸和精氨酸含量均低于对比例1，且对比例36对应的破。

41、乳率和提取率与对比例1无明显差异，说明风味蛋白酶、酸性蛋白酶、三氯蔗糖和无水柠檬酸破乳效果差，不能够有效提高油茶籽油的提取率，具有降低苦味的作用；但与实施例1相比，对比例36对应的油茶籽油中缬氨酸和精氨酸的含量均高于实施例1，且其破乳率和提取率均显著低于实施例1，表明本发明采用内源性蛋白酶协同碱性蛋白酶处理的方法不仅比其他常规去除苦味的物质具有更好的抑制说明书8/11 页11CN 117701330 A11缬氨酸和精氨酸的形成速率的效果，能够更好的去除碱性蛋白酶酶解产生的苦味，还能够有效提高油茶籽油的破乳率和提取率。0094实验例10095参照对比例1的方法，在采用碱性蛋白酶进行一次酶解时，研。

42、究采用酶解时间为20min、40min、60min、80min和100min时对应的油状乳液制备的油茶籽油的苦味、提取率和苦味氨基酸的含量的变化趋势，结果如表34和图24所示。0096表3一次酶解时间对制备的成品油茶籽油苦味的测定结果0097测定指标20min40min60min80min100min苦味不苦不苦不苦很苦很苦0098表4一次酶解时间对制备的成品油茶籽油提苦味氨基酸的测定结果00990100结合表3和表4可知，随着碱性蛋白酶破乳酶解时间(一次酶解时间)的延长，油茶籽油中苦味氨基酸的含量均呈现逐渐增大的趋势，且在酶解100min以内蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和组氨酸的含量均。

43、没有达到相应的苦味阈值，而缬氨酸和精氨酸的含量均在酶解80min时已超过相应的苦味阈值，从而使油茶籽油呈现明显很苦的味道。0101为了进一步了解碱性蛋白酶酶解时间与缬氨酸和精氨酸的关系，对碱性蛋白酶不同酶解时间与缬氨酸、精氨酸含量结果进行方程拟合，结果分别如图2和图3所示。0102由图2可知，将碱性蛋白酶不同酶解时间与缬氨酸含量结果进行方程拟合，得到方程Y0.0663e0.0238x，R20.9951，表明酶解时间与缬氨酸含量具有良好的相关性，且酶解时间为75min时，其缬氨酸含量为0.4mg/g。0103由图3可知，将碱性蛋白酶不同酶解时间与精氨酸含量结果进行方程拟合，得到方程Y0.0189。

44、e0.0418x，R20.9922，表明酶解时间与精氨酸含量具有良好的相关性。0104验证例1参照对比例1的方法，在采用碱性蛋白酶进行一次酶解时，酶解时间为说明书9/11 页12CN 117701330 A1275min，研究该酶解时间下的油茶籽油中缬氨酸和精氨酸含量。0105通过采用碱性蛋白酶进行一次酶解，酶解时间为75min，油茶籽油中缬氨酸含量为0.4mg/g，精氨酸含量为0.45mg/g。表明，在碱性蛋白酶酶解75min时，缬氨酸的含量刚好达到阈值，而精氨酸的含量还未达到阈值，使得油茶籽油呈现微苦的口感。0106从图4可知，随着碱性蛋白酶破乳酶解时间(一次酶解时间)的延长，油茶籽油的提。

45、取率呈现先显著增大后趋于平缓的趋势，当达到60min时提取率达到87.3，随着酶解时间的继续延长，提取率增大不明显。为缩短提取时间以及避免缬氨酸和精氨酸在酶解过程中达到阈值以改善碱性蛋白酶酶解时的苦味，优选出一次酶解时间T1为60minT175min，最优选为60min。0107实验例20108采用实施例1的方法研究采用碱性蛋白酶一次酶解处理60min后，再采用内源性蛋白酶进行二次酶解时间为15min、20min、25min、30min、35min和40min对应总酶解时间(75min、80min、85min、90min、95min和100min)时的油状乳液制备的油茶籽油的苦味、提取率和缬氨。

46、酸、精氨酸的含量的变化趋势，结果如表5和图59所示。0109表5总酶解时间对制备的成品油茶籽油各项指标的测定结果01100111结合表5和图5可以看出，当二次酶解时间为15min40min(总酶解时间为75100min)时，油茶籽油的提取率在一次酶解60min(对应总酶解时间为60min提取率为87.3)的基础上进一步得以显著提高，说明在一次酶解60min时加入内源性蛋白酶，可协同碱性蛋白酶对油状乳液进行进一步的破乳，从而显著提高了油茶籽油的提取率；当总酶解时间为95min(对应二次酶解时间为35min)时提取率已达到了99.7，当总提取时间继续延长至100min时，提取率没有变化，且当总酶解。

47、时间为75min(对应二次酶解时间为15min)时的提取率与总酶解时间为95min对应的提取率之间没有显著的差异，为了提高油茶籽油的制备效率，最优选二次酶解时间为15min。0112由图6和图7可知，缬氨酸和精氨酸的含量在总酶解时间100min内都没有达到阈值，且缬氨酸的含量在总酶解时间为100min时，才达到阈值；0113从图8可知，当采用碱性蛋白酶进行一次酶解60min后若不添加内源性蛋白酶协同破乳(对应图中蓝色线条，数据标记类型为圆形)，在总酶解时间为75min时，缬氨酸的含量达到阈值(0.4mg/g)，且油茶籽油呈现微苦的口感；而通过采用本发明的方法，在一次酶解60min时及时向一次酶。

48、解液中加入内源性蛋白酶(对应图中橙色线条，数据标记类型为正方形)，使缬氨酸的含量在总酶解时间为60100min以内都保持在其苦味阈值以下，且提取率均大于或等于99.5；表明，内源性蛋白酶的添加不仅能够进一步提高油茶籽油的提取率，还可有效抑制酶解过程中缬氨酸的生成速率，提高油茶籽油的口感。0114从图9可知，当采用碱性蛋白酶进行一次酶解60min后若不添加内源性蛋白酶协同破乳(对应图中蓝色线条，数据标记类型为圆形)，在总酶解时间为80min时，精氨酸的含量已超过阈值(0.5mg/g)，且油茶籽油呈现明显的苦味；而通过采用本发明的方法，在一次酶说明书10/11 页13CN 117701330 A1。

49、3解60min时及时向一次酶解液中加入内源性蛋白酶(对应图中橙色线条，数据标记类型为正方形)，使精氨酸的含量在总酶解时间为60100min都保持在其苦味阈值以下，且提取率均大于或等于99.5；表明，内源性蛋白酶的添加不仅能够进一步提高油茶籽油的提取率，还可有效抑制酶解过程中精氨酸的生成速率，提高油茶籽油的口感。0115实验例30116采用实施例1的方法研究采用不同添加量的内源性蛋白酶进行二次酶解时的油状乳液制备的油茶籽油的提取率以及缬氨酸和精氨酸的含量的变化趋势，具体操作为:先采用碱性蛋白酶进行一次酶解60min，再采用不同添加量的内源性蛋白酶进行二次酶解15min，研究内源性蛋白酶添加量分别。

50、为0、0.2、0.6、1、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0时对油状乳液制备的油茶籽油缬氨酸和精氨酸的含量变化(增加值)的影响。增加值成品油茶籽油中氨基酸的含量一次酶解液中氨基酸的含量，结果如图10、图11和图12所示。0117由图10可知，随着内源性蛋白酶添加量的增加，缬氨酸含量的增加值呈现先显著下降(添加量为00.6)后趋于不变(0.63)的趋势，缬氨酸含量的增加值与内源性蛋白酶添加量之间呈现负相关的关系，说明内源性蛋白酶能够有效的抑制缬氨酸的生成速率。0118由图11可知，随着内源性蛋白酶添加量的增加，精氨酸含量的增加值呈现先显著下降(添加量为00.6)后趋于不变(0.63)的趋势，。