转基因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒.pdf

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1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310625991.1(22)申请日 2023.05.30(71)申请人 海南波莲科技有限公司地址 570125 海南省海口市美兰区南宝路36证券大厦9楼(72)发明人 安保光金雄霞王健华欧阳超陈思兰李新鹏(74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限公司 11002专利代理师 李正(51)Int.Cl.C12Q 1/6851(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称转基因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒(57)摘要本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种转基。

2、因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒。本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法以转基因生物的基因组DNA为模板，若目的基因在转基因生物中表达，则可利用目的基因和内源基因的共用引物对，在同一qPCR反应体系中扩增得到两种大小不同、含量不同、GC比例不同的PCR产物；进而通过分析所述PCR产物的熔解曲线，根据目的基因熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，可准确定量转基因生物目的基因拷贝数，且具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。权利要求书2页 说明书18页序列表（电子公布）附图4页CN 116606914 A2023.08.18CN 116606914。

3、 A1.转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、基于转基因生物目的基因与野生型生物内源基因包含的相同或相似序列，设计得到共用引物对；S2、使用步骤S1所述共用引物对，以待测转基因样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据目的基因熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；所述目的基因熔解峰和内源基因熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；所述目的基因熔解峰和内源基因熔解峰对应的温度差值0.5。。

4、2.根据权利要求1所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，转基因生物目的基因拷贝数K(目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)，K为常数。3.根据权利要求1或2所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述转基因生物包括GAT转基因农作物。4.根据权利要求3所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述目的基因选择GAT5400，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述内源基因选择水稻内源基因Os01g0715400或者玉米内源基因Zm00001eb154950；所述水稻内源基因Os01g0715400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述玉米内源基。

5、因Zm00001eb154950的第110000bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第1000120000bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，第2000123463bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。5.根据权利要4所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，所述共用引物对的上游引物在Os01g0715400基因的结合位置为第7外显子，所述共用引物对的下游引物在Os01g0715400基因的结合位置为第8外显子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；或者，所述共用引物对的上游引物在Zm00001eb154950基因的结合位。

6、置为第12外显子，所述共用引物对的下游引物在Zm00001eb154950基因的结合位置为第13外显子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。6.根据权利要求5所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，若目的基因熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.38，且0.70，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.82，且1.21，则所述转基因生物目的基因拷贝数为2；若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值1.27，且1.85，则所述转。

7、基因生物目的基因拷贝数为3。7.根据权利要求36任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR的反应体系以10 L计，包括0.5 l上游引物10 M，0.5 l下游引物10 M，5 l 权利要求书1/2 页2CN 116606914 A2qCR Master Mix 2x，0.1 l CXR 100 x*，1 l模板DNA 102ng，用ddH2O补足10 l。8.根据权利要求37任意一项所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法，其特征在于，步骤S2所述qPCR的反应程序为：50，1min；9495，7min；9495，1020sec；6062收集荧光信号1min，。

8、共计25个循环；6095持续收集荧光信号，建立熔解曲线；优选的，所述6095持续收集荧光信号的程序为：60，1min；温度增量步进：0.2/sec至95，5sec；20，10sec。9.转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，包括步骤S1所述共用引物对；优选的，还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer和DNA饱和性染料。10.根据权利要求9所述转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，其特征在于，所述DNA饱和性染料选自SYBR green、EvaGreen、LCGreenPLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。权利要求书2/2 页3CN 116606914 A3转基。

9、因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒技术领域0001本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种转基因生物目的基因拷贝数检测方法及试剂盒。背景技术0002随着分子生物技术快速发展，特别是转基因技术的出现，给植物育种带来新的技术手段。目前转基因技术有基因枪转化法、农杆菌介导转化法等。其中转基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此，检测转入目标基因的拷贝数是转基因研究中关键的一步。0003目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：比较基因组杂交技术(comparative genome hybridization,CGH)、TaqMan荧光探针技术、变性高效液相色谱(denaturin。

10、g high performance liquid chromatography,DHPLC)技术、多重连接探针扩增技术(multiplex ligationdependent probe amplification,MLPA)和新一代测序技术等。尽管这些技术应用广泛，但其缺陷依旧明显：CGH技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出，同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广；TaqMan荧光探针合成原料成本高、获取难度大，且通常无法克服信噪比低的缺陷，实验数据可重复性差；DHPLC技术在实践应用中，分辨力常受到实验设计、检测环境等因。

11、素的影响，存在可靠性和稳定性欠佳的问题；MLPA技术操作复杂，且需要毛细管电泳进行产物分析，整个实验耗时过长；新一代测序技术适合大样本的检测，但其依托的测序平台价格昂贵，且需要专业实验操作和数据分析人员，不适宜在普通实验室、基层医院或医学检验所开展。0004实时荧光定量PCR技术(quantitative realtime PCR，qPCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量，通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。常规qPCR用于拷贝数分析时，需要至少两对引物，一对引物用于扩增目的基因，一对引物用于扩增内参基因(一。

12、般选取基因组中的单拷贝基因)，通过扩增效率和ct值计算各自的表达量并转换成相对定量或绝对定量，最终通过目的基因的量与内参基因的量的比值计算得出目的基因的拷贝数。该方法最常见的问题有：两对引物扩增效率不一致；每次实验都需检测扩增效率或固定扩增效率但批次之间会有差异；目的基因检测与内参基因检测在不同样品孔中，不同反应体系中操作中的微小差异容易导致定量变化。由于qPCR的灵敏度较高，上述微小差异最终可能导致计算所得的定量值偏离实际较远，故常规qPCR在鉴定拷贝数时存在较大的误差，其与southern blot结果吻合度偏低。发明内容0005有鉴于背景技术中存在的技术问题，本发明提供了一种转基因生物目。

13、的基因拷贝数检测方法及试剂盒。所述方法首次利用实时荧光定量PCR熔解曲线法进行转基因生物目说明书1/18 页4CN 116606914 A4的基因拷贝数的检测。具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。0006具体的，本发明的技术方案如下：0007第一方面，本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测方法，包括如下步骤：0008S1、基于转基因生物目的基因与野生型生物内源基因包含的相同或相似序列，设计得到共用引物对；0009S2、使用步骤S1所述共用引物对，以待测转基因样品的基因组DNA为模板，或者，分别以待测转基因样品的基因组DNA和对照野生型样品的基因。

14、组DNA为模板，进行qPCR，得到PCR产物；0010S3、分析步骤S2所述PCR产物的熔解曲线，根据目的基因熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，判定转基因生物目的基因拷贝数；所述目的基因熔解峰和内源基因熔解峰由待测转基因样品的基因组DNA扩增产物熔解得到；所述目的基因熔解峰和内源基因熔解峰对应的温度差值0.5。0011在本发明中，所述内源基因是指在转基因生物及野生型生物中具有相同或相似功能的基因。所述内源基因不仅限于目的基因改造来源的基因，还可以选择与目的基因改造来源基因相似性较高的其他基因。0012在本发明中，所述目的基因的序列中包含与所述内源基因部分序列相近似或者相同的区段，进而可基于。

15、转基因生物目的基因与野生型生物内源基因包含的相同或相似序列，设计得到共用引物对。0013在本发明中，所述目的基因的序列与所述内源基因的序列存在差异，该差异程度能使目的基因熔解峰和内源基因熔解峰对应的温度差值0.5。0014在本发明中，步骤S1设计共用引物对的原则优选包括：使内源基因与目的基因的扩增产物因GC含量的差异而在待测样品中呈现两个单一可区分的熔解峰。0015在本发明中，步骤S3所述熔解曲线的获取方法优选包括：把qPCR法扩增后的PCR产物缓慢升温至95，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，利用仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，。

16、绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图。0016本发明以转基因生物的基因组DNA为模板，若目的基因在转基因生物中表达，则可利用目的基因和内源基因的共用引物对，在同一qPCR反应体系中扩增得到两种大小不同、含量不同、GC比例不同的PCR产物。0017进一步的，本发明利用PCR产物的大小差异及GC比例差异，可在熔解曲线中呈现两个单一可区分的熔解峰；利用PCR产物的含量差异，可在熔解曲线中呈现不同的熔解峰荧光值。本发明通过分析所述PCR产物的熔解曲线，根据目的基因熔解峰和内源基因熔解峰的荧光强度比值，可准确定量转基因生物目的基因拷贝数。0018本发明提供的转基。

17、因生物目的基因拷贝数检测方法在一个PCR反应体系中进行，读取单管PCR产物的数据，便可计算转基因植株中目的基因拷贝数；整个扩增和检测过程均为闭管操作，可避免污染和假阳性结果；使用一对引物扩增，其扩增效率完全相同，避免了不同管不同批次间的差异，与常规方法相比准确度大大提高；无需构建标准曲线、无需筛选说明书2/18 页5CN 116606914 A5严格的符合扩增效率的引物；扩增片段短，采用较高的退火温度，保证了扩增的特异性。0019本发明建立了一种快速检测转基因生物中目的基因拷贝数的方法，该方法能显著提高其准确性和特异性，且操作简单，耗时短，费用低廉，为转基因生物中目的基因拷贝数的快速检测提供了。

18、有效方法。0020在本发明优选的实施方式中，转基因生物目的基因拷贝数K(目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)，K为常数，更具体的，所述K的值优选根据内源基因在作物中的拷贝倍数确定。当内源基因在作物中的拷贝倍数为C时，KCn(n为作物的倍性)。例如，当所述转基因生物为二倍体的水稻，且选取的内源基因Os01g0715400为单拷贝时，则KCn122，即K值为2；当所述转基因生物为二倍体玉米，且选取的内源基因Zm00001eb154950为单拷贝时，则n2，K值为2；当所述转基因生物为六倍体的小麦，且选取的内源基因为两拷贝时，则KCn2612，即K值为12等。0021第二方面，本发明提供了一。

19、种具体的转基因生物目的基因拷贝数检测方法，所述转基因生物包括GAT转基因农作物。0022优选的，所述目的基因选择GAT5400，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述内源基因选择水稻内源基因Os01g0715400或者玉米内源基因Zm00001eb154950；其中，水稻内源基因Os01g0715400的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；玉米内源基因Zm00001eb154950的第110000bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第1000120000bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，第2000123463bp的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。相。

20、较于其他的目的基因和内源基因的组合，该目的基因和对应农作物的内源基因对应的熔解曲线峰线条清晰更易区分，无干扰峰，且重复性好。0023优选的，当待测转基因生物为GAT转基因水稻时，所述共用引物对的上游引物在Os01g0715400基因的结合位置为第7外显子，所述共用引物对的下游引物在Os01g0715400基因的结合位置为第8外显子。该共用引物对用于GAT转基因水稻的目的基因扩增，其扩增产物间的区分性良好。0024作为另一种优选的实施方式，当待测转基因生物为GAT转基因玉米时，所述共用引物对的上游引物在Zm00001eb154950基因的结合位置为第12外显子，所述共用引物对的下游引物在Zm00。

21、001eb154950基因的结合位置为第13外显子。该共用引物对用于GAT载体转基因玉米的目的基因扩增，其扩增产物间的区分性良好。0025进一步优选的，用于GAT转基因水稻检测的共用引物对的序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。以转基因水稻为例，此对引物扩增水稻内源基因序列时，获得片段长度为263bp；扩增GAT转基因水稻中目的基因序列时，获得片段长度为161bp，二者存在102bp差异，且GC含量也存在明显差异。0026作为另一种优选的实施方式，用于GAT转基因玉米检测的共用引物对的序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。以转基因玉米为例，此对引。

22、物扩增玉米内源基因序列时，获得片段长度为364bp；扩增GAT转基因玉米中目的基因序列时，获得片段长度为260bp，二者存在104bp差异，且GC含量也存在明显差异。0027优选的，步骤S2所述qPCR的反应体系以10 L计，包括0.5 l上游引物10 M，0.5 l下游引物10 M，5 l qCR Master Mix 2x，0.1 l CXR 100 x*，1 l模板DNA 102ng，用ddH2O补足10 l。说明书3/18 页6CN 116606914 A60028优选的，步骤S2所述qPCR的反应程序为：50，1min；9495，7min；9495，1020sec；6062收集荧光信。

23、号1min，共计25个循环；6095持续收集荧光信号，建立熔解曲线，获得的熔解曲线区分度更好。0029进一步优选的，所述6095持续收集荧光信号的程序为：60，1min；温度增量步进：0.2/sec至95，5sec；20，10sec。0030本发明在所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法的结果判断过程中，优选采用如下判断方法：0031若目的基因熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；0032若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.38，且0.70，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；0033若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.82，且1.21，则。

24、所述转基因生物目的基因拷贝数为2；0034若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值1.27，且1.85，则所述转基因生物目的基因拷贝数为3。0035进一步优选的，若目的基因熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则所述转基因生物目的基因拷贝数为0；0036若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.50，且0.64，则所述转基因生物目的基因拷贝数为1；0037若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0.92，且1.12，则所述转基因生物目的基因拷贝数为2；0038若目的基因熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值1.34，且1.64，则所述转基因生物目的基因拷贝数为3。0039上述判断方法得到。

25、的拷贝数检测结果准确性高，重复性好。0040在本发明进一步提供的具体实施方式中，所述转基因生物目的基因拷贝数检测方法以水稻内源基因编码水稻淀粉酶的Os01g0715400基因/玉米内源基因玉米Zm00001eb154950基因为例，检测GAT转基因水稻/玉米GAT5400目的基因拷贝数，具体包括如下步骤：0041(1)设计转基因目的基因与内源基因共同的上下游引物：根据水稻 淀粉酶的Os01g0715400基因、玉米Zm00001eb154950基因与GAT5400目的基因的序列特点，分别设计上下游引物；其中GAT5400目的基因自水稻 淀粉酶的Os01g0715400基因的CDS序列，经过序列。

26、比对，在exon7与exon8上设计共同的上下游引物，使内源基因与目的基因扩增片段大小不同；而GAT5400目的基因与玉米Zm00001eb154950同源，经过序列比对，在exon12与exon13上设计共同的上下游引物，使内源基因与目的基因扩增片段大小不同。0042(2)提取野生型对照及待测转基因样本的基因组DNA；0043(3)配制反应体系：在反应体系中加入上游引物、下游引物、DNA聚合酶，dNTPs以及PCR Buffer，DNA饱和性染料，后分别加入野生型基因组DNA和待测转基因样本的基因组DNA；0044(4)进行PCR反应：将配制好的反应体系置于PCR仪进行PCR反应，实现基因扩。

27、增；说明书4/18 页7CN 116606914 A70045(5)分析熔解曲线并判定目的基因的拷贝数：根据熔解曲线中GAT5400目的基因和Os01g0715400基因/Zm00001eb154950基因PCR产物熔解峰的荧光强度比值，判定待测样本GAT5400目的基因的拷贝数。0046进一步的，步骤(1)中上下游引物设计原则优选为，使内源基因与目的基因的扩增产物由于GC含量的差异而在待测样品中呈现可区分的两个单一的熔解峰。0047更进一步的，GAT转基因水稻上游引物选择Os5400qF(27nt)：00485 GGCTATGTCTACATCTTAACTCACCCA3(SEQ ID NO.4。

28、)；0049下游引物选择Os5400qR(27nt)：00505 AAATTTCCCTCTGCTTTCAGTATCTTG3(SEQ ID NO.5)；0051而GAT转基因玉米上游引物选择Zm5400qF(26nt)：00525 CATTGGAGGTTCCCCTATGGTATGGA3(SEQ ID NO.6)；0053下游引物选择Zm5400qR(22nt)：00545 CCGCTTGGCTCAAAATGTTCTG3(SEQ ID NO.7)；0055进一步的，步骤(3)中以单管反应体系10 L计，各个加入物的用量优选为：0.5 l上游引物10 M，0.5 l下游引物10 M，5 l qCR 。

29、Master Mix 2x，0.1 l CXR 100 x*，1 l模板DNA 102ng，用ddH2O补足10 l。0056进一步的，步骤(4)中PCR反应参数设置优选为：50，1min；9495，7min；9495，1020sec，6062(收集荧光信号)1min，共计25个循环；6095持续收集荧光信号，建立熔解曲线，(60，1min，温度增量步进：0.2/sec至95，5sec)；20，10sec。0057进一步的，步骤(3)所述DNA饱和性染料优选包括但不局限于SYBR green、EvaGreen、LCGreenPLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。0058进一步的。

30、，步骤(5)优选根据下式判定待测样本目的基因的拷贝数：GAT5400拷贝数2(GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)。0059其中，GAT转基因水稻的拷贝数：GAT5400拷贝数2(GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值)；0060GAT转基因玉米的拷贝数：GAT5400拷贝数2(GAT5400熔解峰荧光值/Zm00001eb154950熔解峰荧光值)。0061若样本GAT5400熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰，则该样本的GAT5400目的基因拷贝数为0；若样本的GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值在0.380.70之间，则该样本的GAT54。

31、00目的基因拷贝数为1；若样本的GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值在0.821.21之间，则该样本的GAT5400目的基因拷贝数为2；若样本的GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值在1.271.85之间，则该样本的GAT5400目的基因拷贝数为3。0062本发明首次利用实时荧光定量PCR熔解曲线法进行转基因植株目的基因拷贝数检测，扩增产物双链DNA随温度升高逐渐变性解链产生单链，解链过程中嵌到双链中的荧光染料会被释放出来，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线，并得到相应PCR产物的熔解曲线峰图，根据熔解曲线中目的基因和内源基。

32、因产物熔解峰的荧光强度比值，能准确定量目的基因拷贝数。0063本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法普适性广，成本低；不涉及荧说明书5/18 页8CN 116606914 A8光探针的酶切或链置换反应，因此所有适合PCR的DNA聚合酶均适用于本体系，且无需添加其他特殊组分；同时适用于各种型号的荧光定量PCR平台。0064本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法操作简单，耗时短；无需样本特殊处理等步骤，整个操作流程仅需要1.5小时左右即可完成样本的分析。0065本发明提供的转基因生物目的基因拷贝数检测方法，结果分析简单，实验数据可重复性好；对每个样本只需知道其熔解峰信号强度便可完成结果。

33、判定，无需参照标准品，可完全依靠仪器配套的软件同时分析大量样本。0066第三方面，本发明提供了一种转基因生物目的基因拷贝数检测试剂盒，包括上述共用引物对。0067进一步的，所述试剂盒优选还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCRBuffer和DNA饱和性染料。所述DNA饱和性染料优选自SYBR green、EvaGreen、LCGreenPLUS、ResoLight、SYTO9中的任意一种。0068利用本发明提供的试剂盒进行转基因生物目的基因拷贝数的检测，同样具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。0069有益效果：0070发明提供了一种转基因生物目的基因拷。

34、贝数检测方法及试剂盒。所述方法首次利用实时荧光定量PCR熔解曲线法进行转基因生物目的基因拷贝数的检测。具有检测灵敏度高、结果准确性高、检测效率高、成本低、检测周期短及普适性广等优点。附图说明0071为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。0072图1是本发明实施例1中为检测GAT5400目的基因拷贝数的qPCR引物设计示意图，其中GAT为水稻基因Os01g0715400的CDS，Os01g0715400/Zm00001eb154950基因分别是水稻、玉米基因组。0073图2是本发明实施例3中的基因拷贝数检测数据统计图。其中，A、B和。

35、C分别是实施例3中应用于400例GAT转基因水稻样本的GAT5400基因拷贝数检测数据统计图；D、E和F分别是本发明实施例3中应用于215例GAT转基因玉米样本的GAT5400基因拷贝数检测数据统计图。另外，A和D为GAT5400基因拷贝数为1的样本拷贝数检测的数据统计图；B和E为GAT5400基因拷贝数为2的样本拷贝数检测的数据统计图；C和F为GAT5400基因拷贝数为3的样本拷贝数检测的数据统计图。0074图3是本发明实施例3中拷贝数为0/1/2/3的样品GAT5400基因检测实验结果图。其中，A为GAT转基因水稻样本的GAT5400基因检测实验结果图，Os为水稻内源基因Os01g0715。

36、400缩写；B为GAT转基因玉米样本的GAT5400基因检测实验结果图，Zm为玉米内源基因Zm00001eb154950缩写。0075图4是本发明对比例1和2中相对标准曲线法检测基因拷贝数的标准曲线。其中，A为内参水稻淀粉分支酶基因(RBE4)的标准曲线；B为水稻内参蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)的标准曲线；C为GAT转基因水稻目标基因PG47的标准曲线；D为玉米淀粉合成酶7基因(zSSIIb)的标准曲线；E图为GAT转基因玉米目标基因启动子PC32的标准曲线。说明书6/18 页9CN 116606914 A90076图5是本发明实验例1中利用Southern Blot试验验证实时荧光定量PCR。

37、的检测试验结果图。具体实施方式0077以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。0078若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。0079实施例10080(1)获得GAT转基因水稻及检测拷贝数引物对设计0081本实施例以GAT转基因水稻中GAT5400目的基因与水稻内源基因序列为例，进行序列比对及引物设计。0082本实施例基于遗传智能化育种技术GAT，使用花粉育性恢复基因、花粉败育基因、。

38、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在GAT载体pC0309KhvMaauMCMK5400上(参照我司公开专利CN202010379287.9)，成功导入水稻植株中花11(ZH11，携带纯合隐性雄性不育基因Oscyp704b23)中。GAT载体元件之一的花粉败育基因(Os01g0715400)是水稻来源基因，GAT载体中所使用的是其CDS序列(GAT5400)，无内含子。由于水稻基因组中的内源序列基因结构包含8个外显子和7个内含子，因此，在外显子上设计引物，可有效区分转化事件中载体区段的GAT5400序列(SEQ ID NO.1)(无内含子，较短)和水稻内源的Os01g0715400基。

39、因序列(SEQ ID NO.2)(有内含子，较长)。两个大小不同的片段，在实时荧光定量PCR(qPCR)中呈现出不同大小的溶解曲线峰，而溶解曲线峰值可进一步反映不同扩增片段的含量，由于基因组中内源序列拷贝数是固定的，因此可通过上述方法中比较两个片段熔解曲线峰值来反映转基因的拷贝数。0083特异性引物设计：从GenBank上获得Os01g0715400的DNA序列，在Os01g0715400的第7和第8个外显子上分别设计特异性上下游检测引物(如图1)，具体序列如表1所示。利用此对引物，扩增水稻内源基因序列时，获得片段长度为263bp；扩增GAT转基因中目的基因序列时，获得片段长度为161bp。两。

40、片段存在102bp差异，且GC含量也存在差异。0084表1 GAT转基因水稻(GAT5400)拷贝数检测引物00850086(2)获得GAT转基因玉米及检测拷贝数引物对设计0087本实施例将GAT5400导入玉米植株B104中,其中GAT5400(Os01g0715400)是水稻来源基因的花粉败育基因的CDS序列，无内含子。其在玉米基因组中内源基因的Zm00001eb154950，从Ensembl基因组数据库上获得Zm00001eb154950的DNA序列(SEQ ID 说明书7/18 页10CN 116606914 A10NO.3、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示序列依。

41、次串联)，含13个外显子和12个内含子。根据水稻检测拷贝数引物对设计特点，在Zm00001eb154950的第12和第13个外显子上分别设计特异性上下游检测引物(如图1)，具体序列如表2所示。利用此对引物，扩增水稻内源基因序列时，获得片段长度为364bp；扩增GAT转基因玉米中目的基因序列时，获得片段长度为260bp。两片段存在104bp差异，且GC含量也存在差异。0088表2 GAT5400转基因玉米(GAT5400)拷贝数检测引物00890090实施例20091本实施例分别以GAT转基因水稻和GAT转基因玉米中GAT5400目的基因与其内源基因序列为例，构建SYBR Green I实时定量。

42、PCR反应体系。0092分别以野生型中花11(ZH11)的Os01g0715400和玉米B104的Zm00001eb154950作为2拷贝对照，随机挑选对应的GAT转基因水稻或者GAT转基因玉米T13代，分别选取各植株幼嫩叶片，采用CTAB法提取DNA(参照CTAB法标准步骤进行)，稀释至10ng/ul待用；利用qPCR检测GAT转基因水稻中GAT5400目的基因拷贝数，具体体系如表3所示。0093表3 SYBR Green I实时定量PCR体系009400950096注：每个样品3个重复，所有操作在冰上配置并混匀。0097SYBR Green I实时定量PCR的反应程序：50，1min；94。

43、95，7min；9495，1020sec，6062(收集荧光信号)1min，共计25个循环；6095持续收集荧光信号，建立熔解曲线，(60，1min，温度增量步进：0.2/sec至95，5sec)；20，10sec。0098实施例30099本实施例在实施例2的基础上，使用熔解曲线分析GAT5400拷贝数。0100SYBR Green I实时定量PCR反应结束后，利用QuantStudioTMDesign&Analysis SC Software软件进行数据分析，结合熔解峰图，并根据下式初步判定待测样本目的基因的拷贝数：GAT5400拷贝数2(GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值)。。

44、说明书8/18 页11CN 116606914 A110101(1)利用熔解曲线法检测GAT转基因水稻拷贝数0102本部分有1、2、3拷贝三组数据，共400个样本，分别作图分析，结果如图2中A、B和C所示。0103结果显示：GAT5400基因拷贝数为1、2、3的样本，其GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值范围分别为0.380.70，0.821.21，1.271.85，三组样本的数据无交叉覆盖现象。更严格的，根据标准差划定的范围，GAT5400基因拷贝数为1、2、3的样本，其GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值范围分别为0.500.64，0。

45、.921.12，1.341.64。0104基于该结果，GAT5400基因拷贝数的参考范围是：0105若样本的GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值在0.500.64(0.380.70)之间，则该样本的GAT5400基因拷贝数为1；若样本的GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值在0.921.12(0.821.21)之间，则该样本的GAT5400基因拷贝数为2；若样本的GAT5400熔解峰荧光值/Os01g0715400熔解峰荧光值在1.341.64(1.271.85)之间，则该样本的GAT5400基因拷贝数为3；若样本GAT5400熔解峰缺失，。

46、仅存在Os01g0715400熔解峰，则该样本的GAT5400基因拷贝数为0。GAT转基因水稻(GAT5400)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围如表4所示。0106表4 GAT转基因植株(GAT5400)qPCR拷贝数鉴定荧光比值参考范围0107GAT5400拷贝数GAT5400熔解峰荧光值/内源基因熔解峰荧光值0GAT5400熔解峰缺失，仅存在内源基因熔解峰10.500.64(0.380.70)20.921.12(0.821.21)31.341.64(1.271.85)0108利用qPCR对400多株GAT转基因进行拷贝数检测，设置3个重复，根据表4拷贝数鉴定荧光比值参考范围，结果表明：2。

47、03个样是单拷贝、105个样是双拷贝、65个样是3拷贝。图3中A图显示拷贝数为0/1/2/3的部分样品检测实验结果。表5为统计部分样品qPCR拷贝数。0109表5 GAT转基因水稻(GAT5400)qPCR拷贝数(13拷贝)部分0110说明书9/18 页12CN 116606914 A1201110112注：83621为GAT V3 8362转化事件的世代株系，其他株系以此类推。0113(2)利用熔解曲线法检测GAT转基因玉米拷贝数0114根据本实施例中(1)熔接曲线法检测GAT转基因玉米(GAT5400)拷贝数。0115本部分有1、2、3拷贝三组数据，共215个样本，分别作图分析，结果如图2。

48、中D、E和F所示。0116结果显示：基因 拷贝数为1、2、3的 样本，其G AT5400熔解峰 荧光值/Zm00001eb154950熔解峰荧光值范围分别为0.400.70，0.821.21，1.341.67；更严格的，根据标准差划定的范围，分别为0.500.64，0.921.12，1.411.59(落入表4所示荧光比值的参考范围内)。0117鉴定荧光比值参考范围如表4所示。即利用qPCR对215株GAT转基因玉米进行拷贝数检测，设置3个重复，根据表4拷贝数鉴定荧光比值参考范围，结果表明：85个样是单拷贝、98个样是双拷贝、32个样是3拷贝。图3中B图显示拷贝数为0/1/2/3的部分样品检测实。

49、验结果图。表6为统计部分样品qPCR拷贝数。0118表6 GAT转基因玉米(GAT5400)qPCR拷贝数(13拷贝)部分说明书10/18 页13CN 116606914 A1301190120注：147为GAT5400玉米转化事件的世代株系，其他株系以此类推。0121对比例10122本对比例使用常规相对标准曲线法，检测GAT转基因水稻中GAT5400目的基因的拷贝数，用于同实施例3(1)的检测结果进行比较。0123(1)获取DNA样品和引物0124随机挑选GAT转基因水稻T13代，用常规qPCR鉴定拷贝数的内参对照法来计算样品基因的拷贝数。分别以常用的水稻淀粉分支酶基因(RBE4)、蔗糖磷酸。

50、合成酶(SPS)作为内参基因(一般选取基因组中的单拷贝基因)；以花粉败育基因元件的启动子PG47作为目的基因，进行qPCR扩增。通过比较PG47扩增的Ct值与RBE4或SPS的Ct值来计算PG47的拷贝数，其中PG47为GAT5400目的基因启动子，代表花粉败育基因(GAT5400)的拷贝数，具体引物序列如表7所示。0125表7相对标准曲线检测GAT转基因水稻(GAT5400)拷贝数引物说明书11/18 页14CN 116606914 A1401260127(2)qPCR相对标准曲线法反应体系0128使用同实施例2的方法获取野生型中花11(ZH11)和待测样本的基因组DNA并稀释至10ng/u。