带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质及制备和固定化酶的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910029656.9 (22)申请日 2019.01.12 (71)申请人 天津大学 地址 300350 天津市津南区海河教育园雅 观路135号天津大学北洋园校区 (72)发明人 孙彦张春玉余林玲 (74)专利代理机构 天津一同创新知识产权代理 事务所(普通合伙) 12231 代理人 王丽 (51)Int.Cl. C08F 210/10(2006.01) C08F 8/42(2006.01) C08F 8/32(2006.01) C12N 11/14(2006.01) C。

2、12N 11/08(2006.01) (54)发明名称 一种带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物 接枝纳米介质及制备和固定化酶的方法 (57)摘要 本发明涉及一种带有弱疏水性侧链的两性 离子聚合物接枝纳米介质及制备和固定化酶的 方法； 本发明选择聚(异丁烯-alt-马来酸酐)与 N,N-二甲基乙二胺的连接产物带有弱疏水性侧 链的两性离子聚合物(pID)作为修饰剂， 利用碳 二亚胺法， 在二氧化硅纳米粒子(SNPs)表面进行 接枝反应， 得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚 合物接枝纳米介质SNPs-pID； 之后以SNPs-pID为 载体， 将酶与载体表面的聚合物共价结合， 制得 固定化酶。 本发明制。

3、备的纳米介质生物相容性 好， 有助于稳定酶蛋白的结构， 以其为载体的固 定化酶具有高的催化活性和显著增强的稳定性， 而且制备过程简单易行、 低毒， 在酶催化领域将 有广阔的应用前景。 权利要求书2页 说明书9页 附图1页 CN 109836522 A 2019.06.04 CN 109836522 A 1.一种带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质； 记为SNPs-pID， 其示意结 构式如下： 二氧化硅纳米粒子。 2.权利要求1的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法， 其特 征步骤如下： 1)合成聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)与N,N-二甲基乙二胺(DME。

4、A)的连接产物带有 弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID； 2)将20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理得到氨 基化的纳米粒子SNPs-NH2； 将步骤1)得到的两性离子聚合物pID溶解在MES缓冲液中， 加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC用量为 pID所带羧基的摩尔量的1-2倍， NHS与EDC的摩尔比为0.2-1:1； 然后加入上述氨基化的纳米 粒子SNPs-NH2， 超声2-10min使纳米粒子分散均匀， 置于恒温水浴摇床中反应， 之后离心分 离， 并用去离子水反复清洗去除未反。

5、应的pID、 EDC及NHS， 得到带有弱疏水性侧链的两性离 子聚合物接枝的纳米介质， 记为SNPs-pID。 3.如权利要求2所述的方法， 其特征是所述步骤1)中两性离子聚合物pID的制备方法， 其特征步骤是： 将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然 后加入N,N-二甲基乙二胺(DMEA)混合均匀， 使得该混合液中PIMA、 DMEA和DMF的重量含量百 分比分别为6.7wt、 61wt和32.3wt， 室温下反应12-20h， 然后混合物依次用DMF、 去离 子水透析除去溶剂和未反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物。

6、 pID； 其结构式如下： 4.如权利要求2所述的方法， 其特征是MES缓冲液的pH为5.5-6.2。 5.如权利要求2所述的方法， 其特征是所述步骤2)中所述pID在缓冲液中的浓度为 权利要求书 1/2 页 2 CN 109836522 A 2 25.3-47.4mg/ml； pID与纳米粒子的质量比为0.973.79:1。 6.如权利要求2所述的方法， 其特征是所述步骤2)所述置于恒温水浴摇床中150- 200rpm反应12-20h； 离心速率是8000-10000rpm。 7.权利要求1的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质用于固定化酶的方 法， 其步骤如下： 1)将权利要求1的。

7、带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID加入到 MES缓冲液中， 超声处理2-10min使其均匀分散， 配成浓度为10-25mg/mL的悬浮液； 然后加入 过量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC 与NHS的摩尔比为2:1， 置于20-30的恒温水浴摇床中150-200rpm下反应40-60min， 活化后 9000-10000rpm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱 疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质； 2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中， 得到目标酶溶液， 并与步骤1)中。

8、活化后的带有弱疏 水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质混匀， 置于恒温空气浴摇床中振荡反应， 使目标 酶共价结合在带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质上， 反应结束后在4-10 下离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到以带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝 纳米介质为载体的固定化酶SNPs-pID-Enzyme； 其示意结构式如下： 8.如权利要求7所述的方法， 其特征是所述步骤2)中目标酶蛋白的浓度为0 .10- 0.21mg/mL， 纳米介质与目标酶蛋白的质量比例为1g： (4.8-13.1)mg。 9.如权利要求7所述的方法， 其特征是所述步骤2)中置于4-15空气浴摇床中12。

9、0- 200rpm反应12-20h， 离心速率为9000-10000rpm。 10.如权利要求7所述的方法， 其特征是固定化酶包括但不限于皱褶假丝酵母脂肪酶。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109836522 A 3 一种带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质及制 备和固定化酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质及制备和固 定化酶的方法， 属于固定化酶技术领域。 背景技术 0002 固定化酶技术是提高酶性能最有效的方法之一， 通常酶经固定化后具有稳定性 高、 易于回收再利用、 反应过程可控及提纯工艺简单等优点。 为了制备高效的固定化酶。

10、， 许 多固定化方法和物质被开发和应用， 例如聚合物材料、 纳米复合材料和无机纳米粒子等已 被用作载体通过物理吸附、 共价结合或者包埋法去固定酶。 固定化酶的性能受许多的因素 的影响， 其中载体的性质尤为重要。 载体材料可以改变固定化酶周围的微环境， 进而影响酶 的活性和稳定性。 因此， 仍需不断地开发具有生物相容性好和传质阻力小的先进载体材料。 0003 近年来， 两性离子聚合物由于生物相容性好、 抗蛋白吸附能力强等优点得到了广 泛地关注。 这类聚合物除作为抗污材料外， 在维持蛋白质的结构稳定性和生物活性方面也 具有很大的潜在应用。 而且， 两性离子聚合物功能化的纳米材料最近已被用于酶的固定。

11、化。 无论如何， 研究发现超亲水性两性离子聚合物如pCBMA可以稳定蛋白质， 但不利于酶的活化 (Poly(carboxybetaine methacrylate)-grafted silica nanoparticle:A novel carrier for enzyme immobilization.Biochemical Engineering Journal,2018,132)。 申请人之前将聚(马来酸酐-alt-十八碳烯)与N,N-二甲基乙二胺间的开环产物(p(MAO- DMEA)， 在此简写为pOD)接枝到二氧化硅纳米粒子表面， 制备了一种两性离子聚合物接枝的 纳米粒子SNPs-p。

12、(MAO-DMEA)(在此简写为SNPs-pOD)并用于固定脂肪酶(Remarkably enhanced activity and substrate affinity of lipase covalently bonded on zwitterionic polymer-grafted silica nanoparticles.Journal of Colloid& Interface Science,2018,519:14)。 由于pOD不仅具有阴阳离子基团， 还带有一疏水的长烷 基链， 所得固定化脂肪酶具有增强的生物催化活性。 但是受到pOD长的十六烷基侧链强疏水 性的限制， 载体的亲。

13、水性不佳， 虽然在一定程度上提升了酶的稳定性， 但是提升程度十分有 限。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 进而提出了一种在二氧化硅纳米粒子表 面接枝带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物并制备固定化酶的方法， 该聚合物为聚(异丁 烯-alt-马来酸酐)与N,N-二甲基乙二胺的反应产物， 分子结构中含有两性基团(叔氨基和 羧基)和弱疏水性的短烷基侧链， 具有相对较高的亲水性。 该方法得到的两性载体相较于传 统单一电荷以及两性聚合物改性载体能够保持甚至提高酶活并大幅度地增强稳定性。 并且 与两性载体SNPs-pOD相比， 载体制备过程不需要有机溶剂、 低毒、 简单易行， 所得载。

14、体亲水 性高、 生物相容性好， 对酶的稳定效果更显著， 更适合工业化应用。 说明书 1/9 页 4 CN 109836522 A 4 0005 本发明的技术方案概述如下： 0006 本发明将带有弱疏水性侧链的聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)与N,N-二甲基乙 二胺(DMEA)的连接产物pID作为修饰剂， 利用碳二亚胺法， 在二氧化硅纳米粒子(SNPs)表面 进行接枝反应， 得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID， 并用作 载体共价固定酶SNPs-pID-Enzyme。 其结构式如下： 0007 上述pID的结构式如下: 0008 0009 其中n根据PIMA。

15、的分子量确定。 0010 上述带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID的示意结构如 下： 0011 0012 上述固定化酶SNPs-pID-Enzyme的示意结构如下： 0013 0014 本发明的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质及固定化酶的制备 方法， 其特征是步骤如下： 0015 1)带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法： 将聚(异丁烯- 说明书 2/9 页 5 CN 109836522 A 5 alt-马来酸酐)(PIMA)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的开环产物带弱疏水性侧链的两性离子 聚合物pID接枝到二氧化硅纳米粒子表面， 得到。

16、带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝 纳米介质SNPs-pID； 0016 2)以带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶的制 备方法： 以SNPs-pID为载体， 通过碳二亚胺法， 将酶共价偶联在带有弱疏水性侧链的两性离 子聚合物接枝纳米介质上， 制得以带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质为载 体的固定化酶。 0017 本发明所述带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法， 其特 征是步骤如下： 0018 1)将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后加 入N,N-二甲基乙二胺(DMEA)混合均匀， 使得该。

17、混合液中PIMA、 DMEA和DMF的重量含量百分比 分别为6.7wt、 61wt和32.3wt， 室温下反应12-20h， 然后混合物依次用DMF、 去离子水 透析除去溶剂和未反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID； 0019 2)将20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理得 到氨基化的纳米粒子SNPs-NH2； 将步骤1)得到的两性离子聚合物pID溶解在MES缓冲液中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC用 量为pID所带羧基的摩尔量的1-2倍， N。

18、HS与EDC的摩尔比为0.2-1:1； 然后加入上述氨基化的 纳米粒子SNPs-NH2， 超声2-10min使纳米粒子分散均匀， 然后置于恒温水浴摇床中反应， 之 后离心分离， 并用去离子水反复清洗去除未反应的pID、 EDC及NHS， 得到带有弱疏水性侧链 的两性离子聚合物接枝纳米介质， 记为SNPs-pID。 0020 上述步骤2)中MES缓冲液的pH为5.5-6.2。 0021 上述步骤2)中pID在缓冲液中的浓度为25.3-47.4mg/ml。 0022 上述步骤2)中pID与纳米粒子的质量比为0.973.79:1。 0023 上述步骤2)中置于恒温水浴摇床中150-200rpm反应1。

19、2-20h。 0024 上述步骤2)中离心速率是8000-10000rpm。 0025 本发明所述以带有疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化 酶的制备方法， 其步骤如下： 0026 1)将带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID加入到MES缓冲 液中， 超声处理2-10min使其均匀分散， 配成浓度为10-25mg/mL的悬浮液； 然后加入过量的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC与NHS 的摩尔比为2:1， 置于20-30的恒温水浴摇床中150-200rpm下反应40-60min， 活化后90。

20、00- 10000rpm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱疏水 性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质。 0027 2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中， 得到目标酶溶液， 并与步骤1)中活化后的带有 弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质混匀， 置于恒温空气浴摇床中振荡反应， 使 目标酶共价结合在带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质上， 反应结束后在4- 10下离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到以带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物 接枝纳米介质为载体的固定化酶SNPs-pID-Enzyme； 0028 上述步骤1)中MES缓冲液的pH为5.0-6.0。。

21、 说明书 3/9 页 6 CN 109836522 A 6 0029 上述步骤2)中目标酶蛋白的浓度为0.10-0.21mg/mL,纳米介质与目标酶蛋白的质 量比例为1g： (4.8-13.1)mg。 0030 上述步骤2)中离心速率为9000-10000rpm。 0031 上述步骤2)中置于4-15空气浴摇床中120-200rpm反应12-20h。 0032 本发明的目标酶包括但不限于皱褶假丝酵母脂肪酶。 0033 本发明利用聚(异丁烯-alt-马来酸酐)与N,N-二甲基乙二胺间的开环反应合成带 有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID， 并用其修饰二氧化硅纳米粒子。 这种两性离子聚合 物pID。

22、具有亲水性的阴阳离子基团和弱疏水性的烷基侧链， 能够在纳米粒子的微环境中引 入亲/疏水性， 而亲水/疏水平衡对于保持酶活性和结构具有重要意义。 0034 经实验证明， 带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质能够很好地稳定 酶蛋白结构， 所得固定化酶具有高的催化活性和显著增强的稳定性。 与之前的带有长的十 六烷基侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质相比， 该纳米介质所含两性离子聚合物烷基侧 链较短、 疏水性较弱， 生物相容性好， 能够为酶创造一个生物友好的微环境， 以至于在不利 条件下更好地保护酶的活性构象， 而且制备简单， 低毒环保， 在固定化酶的制备中将有广阔 的应用前景。 附图说明 00。

23、35 图1为不同温度对固定化酶和游离酶稳定性的影响。 0036 图2为固定化酶与游离酶在50的热稳定性。 具体实施方式 0037 为了更好的理解本发明， 下面结合具体的实例将对本发明提供的方法予以进一步 的说明。 0038 本发明将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)与N,N-二甲基乙二胺(DMEA)的连接产 物带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID接枝到二氧化硅纳米粒子(SNPs)表面， 制备带 有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID， 并用作载体共价固定酶。 0039 上述pID的反应式如下： 0040 0041 其中n根据PIMA的分子量确定。 0042 上述S。

24、NPs-pID及固定化酶的反应式如下： 说明书 4/9 页 7 CN 109836522 A 7 0043 0044 本发明所述两性离子聚合物接枝的纳米介质的制备方法， 其特征是步骤如下： 0045 1)将聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(PIMA)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后加 入N,N-二甲基乙二胺(DMEA)混合均匀， 使得该混合液中PIMA、 DMEA和DMF的重量含量百分比 分别为6.7wt、 61wt和32.3wt， 室温下反应12-20h， 然后混合物依次用DMF、 去离子水 透析除去溶剂和未反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID。 。

25、0046 2)将20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)处理得 到氨基化的纳米粒子SNPs-NH2； 将步骤1)得到的两性离子聚合物pID溶解在MES缓冲液中， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC用 量为pID所带羧基的摩尔量的1-2倍， NHS与EDC的摩尔比为0.2-1:1； 然后加入上述氨基化的 纳米粒子SNPs-NH2， 超声2-10min使纳米粒子分散均匀， 置于恒温水浴摇床中反应150- 200rpm反应12-20h， 之后8000-10000rpm离心分离， 并用去离子水反复。

26、清洗去除未反应的 pID、 EDC及NHS， 得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝的纳米介质SNPs-pID。 0047 上述步骤2)中MES缓冲液的pH为5.5-6.2。 0048 上述步骤2)中pID在缓冲液中的浓度为25.3-47.4mg/ml。 0049 上述步骤2)中pID与纳米粒子的质量比为0.973.79:1。 0050 本发明所述以带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质为载体的固定 化酶的制备方法， 其步骤如下 0051 1)将带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID加入到MES缓冲 液(pH5.0-6.0)中， 超声处理2-10min使其均匀分散。

27、， 配成浓度为10-25mg/mL的悬浮液； 加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， EDC与NHS 的摩尔比为2:1， 置于20-30的恒温水浴摇床中150-200rpm下反应40-60min， 活化后9000- 10000rpm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱疏水 性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质； 0052 2)将目标酶溶解于磷酸缓冲液中， 得到目标酶溶液， 并与步骤1)中活化后的带有 弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质混匀， 使悬浮液中酶蛋白浓度为0.10- 0.21mg/mL、 纳。

28、米介质与目标酶蛋白的质量比例为1g： (4.8-13.1)mg， 将其置于4-15恒温 说明书 5/9 页 8 CN 109836522 A 8 空气浴摇床中120-200rpm振荡反应12-20h， 置于恒温空气浴摇床中振荡反应， 使目标酶共 价结合在带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质上， 反应结束后在4-10下 9000-10000rpm离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到以带有弱疏水性侧链的两性离 子聚合物接枝纳米介质为载体的固定化酶SNPs-pID-Enzyme。 0053 所述步骤2)中， 目标酶包括但不限于皱褶假丝酵母脂肪酶。 0054 实施例1： 0055 本实施例。

29、中的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如 下： 0056 1)1g聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(分子量6000g/mol， n39)溶解于5.1mL N,N-二 甲基甲酰胺(DMF， 密度0.945g/ml)中,然后加入12ml N,N-二甲基乙二胺(分子量88.15g/ mol， 密度0.807g/ml)， 室温下反应15h， 然后混合物依次用DMF、 去离子水透析除去溶剂和未 反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID； 0057 2)将平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)处理为氨基化的。

30、纳米粒子SNPs-NH2； 将505mg两性离子聚合物pID溶解在17mL MES 缓冲液(50mM， pH6.2)中， 配成浓度为29.7mg/mL的溶液， 加入0.604g 1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和362.53mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， 使EDC用量为pID所带 羧基的摩尔量的1.5倍， NHS与EDC的摩尔比为1:1； 然后加入520mg上述氨基化的纳米粒子 SNPs-NH2， 超声2min使纳米粒子分散均匀， 置于恒温水浴摇床中反应150rpm反应12h， 之后 8000rpm离心分离， 并用大量去离子水反复清洗， 得到聚合物接枝量约为0。

31、.01g/g SNPs的带 有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID。 0058 实施例2： 0059 本实施例中的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如 下： 0060 1)1g聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(分子量6000g/mol， n39)溶解于5.1mL N,N-二 甲基甲酰胺(DMF， 密度0.945g/ml)中,然后加入12ml N,N-二甲基乙二胺(分子量88.15g/ mol， 密度0.807g/ml)， 室温下反应20h， 然后混合物依次用DMF、 去离子水透析除去溶剂和未 反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物。

32、pID； 0061 2)将平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)处理为氨基化的纳米粒子SNPs-NH2； 将948mg两性离子聚合物pID溶解在20mL MES 缓冲液(50mM， pH6.0)中， 配成浓度为47.4mg/mL的溶液， 加入1.51g 1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和302mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)， 使EDC用量为pID所带羧基 的摩尔量的2倍， NHS与EDC的摩尔比为0.33:1， 然后加入486mg上述氨基化的纳米粒子SNPs- NH2， 超声10min使纳米粒子分散均匀， 置于。

33、恒温水浴摇床中反应200rpm反应16h， 之后 10000rpm离心分离， 并用大量去离子水反复清洗， 得到聚合物接枝量约为0.03g/g SNPs的 带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID。 0062 实施例3： 0063 本实施例中的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质的制备方法如 下： 0064 1)1g聚(异丁烯-alt-马来酸酐)(分子量6000g/mol， n39)溶解于5.1mL N,N-二 说明书 6/9 页 9 CN 109836522 A 9 甲基甲酰胺(DMF， 密度0.945g/ml)中,然后加入12ml N,N-二甲基乙二胺(分子量88。

34、.15g/ mol， 密度0.807g/ml)， 室温下反应12h， 然后混合物依次用DMF、 去离子水透析除去溶剂和未 反应的DMEA， 冷冻干燥后得到带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物pID； ； 0065 2)将平均粒径为20-30nm的二氧化硅纳米粒子(SNPs)用氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)处理为氨基化的纳米粒子SNPs-NH2； 将379mg两性离子聚合物pID溶解在15mL MES 缓冲液(50mM， pH5.5)中， 配成浓度为25.3mg/mL的溶液， 加入0.301g 1-(3-二甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和36.08mg N-羟基丁二酰亚胺(NH。

35、S)， 使EDC用量为pID所带羧 基的摩尔量的1倍， NHS与EDC的摩尔比为0.2:1， 然后加入100mg上述氨基化的纳米粒子 SNPs-NH2， 超声5min使纳米粒子分散均匀， 置于恒温水浴摇床中反应170rpm反应20h， 之后 9000rpm离心分离， 并用大量去离子水反复清洗， 得到聚合物接枝量约为0.05g/g SNPs的带 有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质SNPs-pID。 0066 下面实施例4-9中以皱褶假丝酵母脂肪酶为例对本发明提供的固定化酶的制备方 法予以说明。 0067 实施例4： 0068 1)将248mg实例1中制备得到的聚合物接枝量约为0.01g/。

36、g SNPs的带有弱疏水性 侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到10mLMES缓冲液(50mM， pH5.0)中， 超声处理 10min使其均匀分散， 加入2.0mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和 1.0mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)置于20的恒温水浴摇床中150rpm下反应60min， 活化后 10000rpm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱疏水 性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质； 0069 2)称取13mg皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)粗粉溶解于5ml磷酸缓冲液(50mM， pH 7.4) 中， 高速冷冻离。

37、心除去不溶物， 采用Bradford方法测定酶液中的蛋白浓度， 得到蛋白浓度为 0.10mg/mL的脂肪酶溶液， 加入到步骤1)中活化后的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物 接枝纳米介质， 混合均匀， 使得悬浮液中纳米粒子的浓度为21mg/mL， 将其置于15恒温空 气浴摇床中200rpm振荡反应12h， 使目标酶共价结合在带有弱疏水性侧链的两性离子聚合 物接枝纳米介质上， 反应结束后在10下10000rpm离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到固定化脂肪酶SNPs-pID-CRL。 0070 通过Bradford方法测定固定化反应前后反应液中的蛋白浓度， 根据物料平衡计算 得出本实施例中制备。

38、的固定化脂肪酶的酶载量为0.72mg/g SNPs-pID。 0071 实施例5： 0072 1)将82mg实例2中制备得到的聚合物接枝量约为0.03g/g SNPs的带有弱疏水性侧 链的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到5.0mLMES缓冲液(50mM， pH6.0)中， 超声处理5min 使其均匀分散， 加入1 .0mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和 0.5mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的， 置于30的恒温水浴摇床中200rpm下反应45min， 活 化后9500pm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱疏 水性侧链。

39、的两性离子聚合物接枝纳米介质； 0073 2)称取27mg皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)粗粉溶解于2.5ml磷酸缓冲液(50mM， pH7.4)中， 高速冷冻离心收集上层酶溶液， 除去不溶物， 采用Bradford方法测定酶液中的蛋 白浓度， 得到蛋白浓度为0.21mg/mL的脂肪酶溶液， 加入步骤1)中活化后的带有弱疏水性侧 说明书 7/9 页 10 CN 109836522 A 10 链的两性离子聚合物接枝纳米介质， 混合均匀， 使得悬浮液中纳米粒子的浓度为16mg/mL， 将其置于10恒温空气浴摇床中150rpm振荡反应20h， 使目标酶共价结合在两性离子聚合 物修饰的载体上， 反应结束后。

40、在5下9500rpm离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到 固定化脂肪酶SNPs-pID-CRL。 0074 通过Bradford方法测定固定化反应前后反应液中的蛋白浓度， 根据物料平衡计算 得出本实施例中制备的固定化脂肪酶的酶载量为1.88mg/g SNPs-pID。 0075 实施例6： 0076 1)将50mg实例3中制备得到的聚合物接枝量约为0.05g/g SNPs的带有弱疏水性侧 链的两性离子聚合物接枝纳米介质加入到5.0mLMES缓冲液(50mM， pH5.5)中， 超声处理2min 使其均匀分散， 加入1.30mmol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)。

41、和 0.65mmol N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的， 置于25的恒温水浴摇床中170rpm下反应40min， 活 化后9000rpm离心弃上清， 之后用磷酸缓冲液清洗活化的纳米介质， 得到活化后的带有弱疏 水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质； 0077 2)称取22mg皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)粗粉溶解于5ml磷酸缓冲液(50mM， pH 7.4) 中， 高速冷冻离心收集上层酶溶液， 除去不溶物， 采用Bradford方法测定酶液中的蛋白浓 度， 得到蛋白浓度为0.178mg/mL的脂肪酶溶液， 加入到步骤1)中活化后的带有弱疏水性侧 链的两性离子聚合物接枝纳米介质， 混合均匀， 使悬浮。

42、液中纳米粒子的浓度为20mg/mL， 将 其置于4恒温空气浴摇床中120rpm振荡反应16h， 使目标酶共价结合在两性离子聚合物修 饰的载体上， 反应结束后在4下9000rpm离心分离并用相同的磷酸缓冲液洗涤， 得到固定 化脂肪酶SNPs-pID-CRL。 0078 通过Bradford方法测定固定化反应前后反应液中的蛋白浓度， 根据物料平衡计算 得出本实施例中制备的固定化脂肪酶的酶载量为2.63mg/g SNPs-pID。 0079 实施例7： 0080 所用固定化酶为实施例6中制备得到的固定化脂肪酶(SNPs-pID-CRL)， 以乙酸对 硝基苯酯(p-NPA)为底物测定固定化脂肪酶(SN。

43、Ps-pID-CRL)和游离脂肪酶(CRL)的催化活 性， 即将0.1mL酶液加入到含有2.4mL磷酸盐缓冲液(pH7.0， 0.02M)和0.5mL对硝基苯基乙酸 酯(p-NPA， 溶于乙腈)的混合溶液中， 37反应10min后立即测定400nm处的吸光值。 一个酶 活力单位(U)定义为测试条件下每分钟释放1umol对硝基苯酚所需脂肪酶的数量。 结果发现 固定化脂肪酶的活性是游离酶的1.21倍， 说明本发明实施例6制得的固定化酶具有较高的 酶活力， 表明所用纳米介质SNPs-pID有助于酶活力的保持。 0081 实施例8： 0082 将实施例6中制备得到的固定化脂肪酶(SNPs-pID-CR。

44、L)与游离酶在一定温度(25- 60)下温浴20min后， 以乙酸对硝基苯酯为底物测定酶样品的残留活性。 结果如图1所示： 游离酶和固定化酶的稳定性均随着温度的升高而降低， 但是在整个测试的温度范围内实施 例6中制备得到的固定化脂肪酶(SNPs-pID-CRL)的耐热性均高于游离酶。 0083 实施例9: 0084 将实施例6中制备得到的固定化脂肪酶(SNPs-pID-CRL)与游离酶在磷酸缓冲液 (pH7.0)、 50下温浴没溶液每隔30min取样品测定酶活性， 确定游离酶和固定化酶的热稳 定性。 结果如图2所示： 游离酶的活性快速失活， 180min后仅保留初始活性的14， 而固定化 说明。

45、书 8/9 页 11 CN 109836522 A 11 酶仍然有73的活性， 这说明带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质上固定的 酶的热稳定性大幅度提高。 0085 热稳定性的研究结果(实施例8和实施例9)表明固定在带有弱疏水性侧链的两性 离子聚合物接枝纳米介质(SNPs-pID)上的酶能够大幅度地提高酶的热稳定性， 比如在25- 60的温度范围内温浴， 本发明中的SNPs-pID-CRL能够保持高的活性， 但之前研究的以两 性离子聚合物接枝纳米粒子为载体的固定化酶(SNPs-pOD-CRL)(Remarkably enhanced activity and substrate af。

46、finity of lipase covalently bonded on zwitterionic polymer-grafted silica nanoparticles.Journal of Colloid&Interface Science, 2018,519:14)随温度的升高活性损失迅速增加， 在60温育20分钟后， SNPs-pOD-CRL仅保 留23的初始活性， 而本发明中的SNPs-pID-CRL的残留活性仍然高达60。 在50热处理 180分钟后， SNPs-pOD-CRL的残留活性降至31， 而SNPs-pID-CRL仍保留其原始活性的 73。 这些结果说明本发明的固定化。

47、酶对于高温下的生物催化反应十分有利， 这对工业应 用十分重要。 0086 综上所述， 本发明所述带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质作为固 定化酶载体能够很好的保持酶的催化活性、 稳定酶蛋白构象、 大幅度的提高稳定性， 是一类 具有应用前景的固定化酶载体； 所制备的固定化酶催化活性高， 稳定性好， 在酶催化反应中 具有更大的实际应用价值。 0087 本发明提出的带有弱疏水性侧链的两性离子聚合物接枝纳米介质及固定化酶的 制备方法， 已通过现场较佳实施例进行了描述， 相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合， 来实现本发明技术。 特别需 要指出的是， 所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 他们都被视 为包括在本发明精神、 范围和内容中。 说明书 9/9 页 12 CN 109836522 A 12 图1 图2 说明书附图 1/1 页 13 CN 109836522 A 13 。