Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910089104.7 (22)申请日 2019.01.30 (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 张敏杨鹤孙雷 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 樊戎冯超 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (54)发明名称 Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾 病及相关心脏疾病用药的标记物的应用 (57)摘。

2、要 本发明涉及生物医学领域， 为了解决现有精 神压力导致心脏疾病发生的诊断标志物少之又 少的问题， 提供了一种Rbm24-S181位点磷酸化作 为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记 物的应用， 本发明通过Rbm24-S181位点磷酸化为 评估精神压力与心脏疾病的分子诊断， 提供了新 的靶点和干预策略。 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 附图2页 CN 109839508 A 2019.06.04 CN 109839508 A 1.Rbm24-S181位点磷酸化在精神压力类疾病中作为生物标记物的用途。 2.Rbm24-S181位点磷酸化在诊断精神压力导致的心脏疾病中作为分子标记物的用途。

3、。 3.Rbm24-S181位点磷酸化在预防和治疗相关精神压力引起的心脏疾病中作为药物靶 点的用途 4.检测Rbm24-S181位点磷酸化水平的物质在制备预防、 诊断治疗诊断精神压力类疾病 以及由精神压力引起的心脏疾病中的产品中应用。 5.根据权利要求4所述应用， 其特征在于： 所述物质为识别Rbm24-S181磷酸化的多克隆 抗体或单克隆抗体， 所述单克隆抗体的氨基酸序列为YAApSPAATGYVAA， 如SEQ ID No.1所 示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109839508 A 2 Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病 用药的标记物的应用 技术领域 。

4、0001 本发明涉及生物医学领域， 具体涉及一种Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类 疾病及相关心脏疾病用药的标记物的应用。 背景技术 0002 随着生活节奏的加快， 社会竞争日益激烈， 人们的生活压力越来越大， 大部分人都 在超负荷运转， 很容易产生不同程度的精神压力疾病， 如抑郁， 焦虑， 失眠， 狂躁等疾病。 对 于精神疾病的诊断是十分复杂的， 目前对精神疾病的特异性诊断未能得到理想的标志物。 在临床上， 对于精神类疾病进行诊断主要是依靠患者的临床症状。 但是， 随着医学水平的不 断发展， 当前在临床诊断中， 要根据精神症状， 结合生化检查的结果可以更加准确的对精神 疾病进行确诊。

5、， 而且依据生化检查结果， 对症下药， 从而减轻药物对患者脏器的损害也有积 极的意义。 目前在临床上主要使用神经递质、 酶以及环核苷酸等生化检测指标， 可以应用于 精神疾病的辅助诊断， 但是这些生化检测仍然具有一些局限性。 0003 根据文献报道， 抑郁或者焦虑等精神障碍疾病与随后的心脏疾病的发生有密切关 系。 在抑郁症患者中， 其心脏疾病的发生率高于正常人心脏疾病发生率。 但是关于精神压力 导致心脏疾病发生的诊断标志物少之又少。 0004 因此， 发现一种诊断精神压力等亚健康人士患心脏疾病风险是否提高的标志物是 非常有必要的， 可以使得精神疾病患者在早期发现是否患有心脏疾病， 并得到及时治疗。

6、。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供了一种Rbm24-S181位点磷酸化在由 精神压力以及由精神压力导致的心脏疾病中作为生物标记物的用途， 本发明通过Rbm24- S181位点磷酸化(Rbm24-S181的其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示， 即Rbm24蛋白第181位丝 氨酸)为评估精神压力与心脏疾病的分子诊断， 提供了新的靶点和干预策略。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现： 0007 Rbm24-S181位点磷酸化在精神压力类疾病中作为生物标记物的用途。 0008 Rbm24-S181位点磷酸化在诊断精神压力导致的心脏疾病中作为分子标记物的用。

7、 途。 0009 Rbm24-S181位点磷酸化在预防和治疗相关精神压力引起的心脏疾病中作为药物 靶点的用途 0010 检测Rbm24-S181位点磷酸化水平的物质在制备预防、 诊断治疗诊断精神压力类疾 病以及由精神压力引起的心脏疾病中的产品中应用。 0011 作为优选方案， 所述物质为识别Rbm24-S181磷酸化的多克隆抗体或单克隆抗体， 所述单克隆抗体的氨基酸序列为YAApSPAATGYVAA， 如SEQ ID No.1所示。 0012 本发明的原理： 说明书 1/3 页 3 CN 109839508 A 3 0013 Rbm24属于RNA结合蛋白的RBM家族(氨基酸序列见)， 在心脏中。

8、特异高表达。 Rbm24 在调节心脏发育中发挥重要的作用， 由于Rbm24在不同物种间具有很高的序列相似性， 从而 体现出很强的功能保守性。 在小鼠中， Rbm24参与心脏的早期发育， Rbm24基因缺失在小鼠中 导致心内膜垫损伤， 进而引起胚胎期死亡。 在一项对人类冠心病的分子流行病学研究中， Rbm24被识别为冠心病发生的潜在生物标志物和主要危险因素之一， 其转录水平在冠心病 人中明显上调。 因此， Rbm24在心脏疾病的发生中有着重要的作用。 0014 蛋白磷酸化是蛋白翻译后修饰的重要机制之一， 在细胞对外界信号反应中处于首 要位置。 我们前期工作表明， 心脏Rbm24-S181位点磷酸。

9、化响应精神压力信号， 探究精神压力 与Rbm24-S181位点磷酸化的调控关系可以作为由精神压力导致的心脏疾病的分子标记物。 0015 本发明的有益效果： 0016 本发明运用Rbm24-S181位点磷酸化， 并通过血液即可实现对疾病的诊断， 有着方 便快捷的优点， 一方面可以减轻病人的痛苦， 另一方面还可以减轻医护人员的工作量， 提高 工作效率。 本发明还属于基因诊断类型的诊断方法， 特异性较高， 使病人早发现， 早治疗， 及 时控制病情。 附图说明 0017 图1a为本发明所用抗体制作的免疫肽段图； 0018 图1b为western-blot检测在成心肌细胞C2C12中过表达3Flag-R。

10、bm24的图。 0019 图1c为western-blot检测在结直肠癌细胞HCT116中敲低Rbm24蛋白水平图。 0020 图1d为western-blot检测在结直肠癌细胞HCT116中利用crispr-cas9技术敲除 Rbm24蛋白水平图 0021 图2a为western-blot检测在成心肌细胞C2C12中用肾上腺素处理后Rbm24-S181位 点磷酸化的显著变化图， 其中lithium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。 0022 图2b为western-blot检测在C57小鼠腹腔注射肾上腺素处理后， 小鼠心脏Rbm24- S181位点磷酸化的显著变化图， 其中li。

11、thium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。 0023 图2c为western-blot检测C57小鼠经过慢性压力处理后， 小鼠心脏Rbm24-S181位 点磷酸化的显著变化图， 其中lithium为Rbm24-S181位点磷酸化上游激酶抑制剂。 0024 图3为western-blot C57小鼠经过不同时间慢性压力处理后， 取血液纯化后得到 血清检测Rbm24-S181位点磷酸化的显著变化图； 0025 图4为Rbm24氨基酸序列(灰度部分是RNA结合区)。 具体实施方式 0026 下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述， 以便本领域技术人员理解。 0027 实施例1：。

12、 制备Rbm24-S181位点磷酸化抗体并验证该抗体可用 0028 图1a-图1d鉴定Rbm24-S181位点磷酸化后， 根据图1a所示肽段免疫兔子， 制备了特 异识别Rbm24-S181磷酸化的单克隆抗体， 其氨基酸序列为YAApS PAAT GYVA A， 如SEQ ID No.1所示， 此肽段在人和小鼠斑马鱼等动物中高度保守， 这一抗体可识别细胞内过表达的 Rbm24， S181D突变体(天冬氨酸D可以模拟磷酸化)， 但不识别S181A(丙氨酸A可以模拟非磷 酸化)突变体。 说明书 2/3 页 4 CN 109839508 A 4 0029 该结果说明S181D可模拟S181磷酸化， 并。

13、被磷酸化抗体特异识别。 同时， Rbm24- S181磷酸化抗体可特异识别体内表达磷酸化Rbm24， 应用siRNA技术， 将细胞中Rbm24的表达 水平降低， 发现Rbm24-S181磷酸化的水平也降低。 应用crispr-cas9技术， 将细胞中Rbm24的 基因敲除， 发现Rbm24-S181磷酸化不能发生。 0030 实施例2： Rbm24-S181位点磷酸化响应精神压力 0031 图2a的实验条件是， 在小鼠的成心肌细胞C2C12中， 加入终浓度为40uM的肾上腺素 处理30min后， 收蛋白样品。 经western-blot检测， 其结果如图2a所示， Rbm24-S181磷酸化被。

14、 明显激活(泳道3)。 泳道2和4是加Lithium组， 其中泳道2是只加Lithium可以看到Rbm24- S181磷酸化本底水平明显下调， 泳道4是在加了Lithium30min后加入肾上腺素处理30min， 可以明显看出Rbm24-S181磷酸化水平不能被激活。 0032 图2b的实验条件是， C57雄性小鼠腹腔注射5mg/kg肾上腺素， 1h后二氧化碳处死， 收心脏样品经western-blot检测， 其结果如图2b所示， Rbm24-S181磷酸化被明显激活(泳道 3)。 泳道2和4是腹腔注射Lithium组， 其中泳道2是只注射Lithium可以看到Rbm24-S181磷酸 化本底。

15、水平明显下调， 泳道4是同时注射Lithium和肾上腺素， 可以明显看出Rbm24-S181磷 酸化水平不能被激活。 0033 图2c的实验条件是， 将C57雄性小鼠孤立养殖， 即一只鼠笼养一只老鼠， 持续30天， 30天后将小鼠用co2的方式处死， 取心脏经western-blot检测， 其结果如图2c所示， Rbm24- S181磷酸化被明显激活(泳道3)。 泳道2和4是腹腔注射Lithium组， 其中泳道2是每天只注射 Lithium小鼠群居可以看到Rbm24-S181磷酸化本底水平明显下调， 泳道4是每天注射 Lithium和每天隔离持续30天， 可以明显看出Rbm24-S181磷酸化。

16、水平不能被激活。 0034 实施例3： 小鼠血清检测Rbm24-S181磷酸化 0035 图3的实验条件是， 将雄性C57小鼠进行隔离实验， 分别在隔离10天， 20天， 30天， 40 天后取小鼠血液， 将血液静置一段时间后离心得到血清， 将血清进行western-blot检测。 Western-blot结果如图3所示， 经过不同时间慢性压力的小鼠， 其血清中的Rbm24-S181磷酸 化水平呈明显梯度上调。 0036 综合上述实施例1-3， 本发明可以根据Rbm24-S181位点磷酸化水平在诊断、 预防和 治疗精神压力， 如抑郁症， 焦虑症， 失眠症等， 以及精神压力引起的心脏疾病， 如心。

17、脏增生、 心肌肥厚、 心肌细胞纤维化， 心脏瓣膜损伤等中使用， Rbm24-S181位点磷酸化在诊断精神压 力以及由精神压力引起的心脏疾病中作为分子标记使用。 0037 其它未详细说明的部分均为现有技术。 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述， 但它仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部实施例， 人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例， 这些实施例都属于本发明保护范围。 说明书 3/3 页 5 CN 109839508 A 5 序列表 华中农业大学 Rbm24-S181位点磷酸化作为精神压力类疾病及相关心脏疾病用药的标记物的 应用 2 SIPOSequenceListin。

18、g 1.0 2 13 PRT 人工合成序列(Synthetic sequence) 2 Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Ala Thr Gly Tyr Val Ala Ala 1 5 10 2 236 PRT 人工合成序列(Synthetic sequence) 2 Met His Thr Thr Gln Lys Asp Thr Thr Tyr Thr Lys Ile Phe Val Gly 1 5 10 15 Gly Leu Pro Tyr His Thr Thr Asp Ala Ser Leu Arg Lys Tyr Phe Glu 20 25 30 Val Phe Gly。

19、 Glu Ile Glu Glu Ala Val Val Ile Thr Asp Arg Gln Thr 35 40 45 Gly Lys Ser Arg Gly Tyr Gly Phe Val Thr Met Ala Asp Arg Ala Ala 50 55 60 Ala Glu Arg Ala Cys Lys Asp Pro Asn Pro Ile Ile Asp Gly Arg Lys 65 70 75 80 Ala Asn Val Asn Leu Ala Tyr Leu Gly Ala Lys Pro Arg Ile Met Gln 85 90 95 Pro Gly Phe Ala 。

20、Phe Gly Val Gln Gln Leu His Pro Ala Leu Ile Gln 100 105 110 Arg Pro Phe Gly Ile Pro Ala His Tyr Val Tyr Pro Gln Ala Phe Val 115 120 125 Gln Pro Gly Val Val Ile Pro His Val Gln Pro Thr Ala Ala Ala Ala 130 135 140 Ser Thr Thr Pro Tyr Ile Asp Tyr Thr Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Tyr 145 150 155 160 序列表 1/2 。

21、页 6 CN 109839508 A 6 Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Asp Gln Tyr 165 170 175 Pro Tyr Ala Ala Ser Pro Ala Ala Ala Gly Tyr Val Thr Ala Gly Gly 180 185 190 Tyr Gly Tyr Ala Val Gln Gln Pro Ile Thr Ala Ala Ala Pro Gly Thr 195 200 205 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Phe Gly Gln 210 215 220 Tyr Gln Pro Gln Gln Leu Gln Thr Asp Arg Met Gln 225 230 235 序列表 2/2 页 7 CN 109839508 A 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 109839508 A 8 图3 图4 说明书附图 2/2 页 9 CN 109839508 A 9 。