调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910233452.7 (22)申请日 2019.03.26 (71)申请人 安徽工程大学 地址 241000 安徽省芜湖市鸠江区北京中 路8号 (72)发明人 刘艳胡润薛正莲杨超英 王洲钱森和胡刘秀李松 杨自名冯静静高越 (74)专利代理机构 芜湖安汇知识产权代理有限 公司 34107 代理人 王冰冰 (51)Int.Cl. C12N 15/31(2006.01) C12N 15/75(2006.01) C12N 15/65(2006.01) C12N 1/21(2006。

2、.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜 特性的方法 (57)摘要 本发明公开了一种调控纳豆芽孢杆菌自凝 集能力和菌膜特性的方法。 该方法通过改变非特 异性DNA结合蛋白HBsu编码基因表达水平和蛋白 表达量达到改变纳豆芽孢杆菌自凝集能力和菌 膜特性， 并进一步改变纳豆芽孢杆菌合成维生素 K2的能力。 本发明为维生素K2优良菌株的选育提 供了一条新思路， 在食品、 生物制药领域具有较 大的实际意义和广阔的应用前景。 权利要求书1页 说明书7页 序列表1页 附图1页 CN 109837289 A 2019.06.04 CN 10983。

3、7289 A 1.一种调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 包括如下步骤： a、 将纳豆芽孢杆菌在LB液体培养基中培养； b、 提取纳豆芽孢杆菌全基因组； c、 以非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因为目的基因设计引物对进行过表达， 对纳豆 芽孢杆菌全基因组进行PCR扩增目的基因片段； d、 将目的基因片段与载体连接构建用于增强HBsu活性的增强载体； e、 增强载体转化纳豆芽孢杆菌， 并利用载体上的抗性基因筛选转化子， 将筛选到的转 化子转接到斜面培养基上； f、 从斜面培养基上挑取菌落在种子培养基上进行培养突变株； g、 通过调节突变株分别在加入IPTG培养时的温度。

4、以调控突变株自凝集能力和菌膜特 性。 2.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 所述步骤g中调控突变株自凝聚能力的方法为： 先将突变株接入发酵培养基中培养， 之后加 入IPTG在15-30培养至OD6003.0， 然后依次经离心、 洗涤、 重悬， 并控制OD6002.5， 最 后将重悬液静置24小时后测定自凝集后各培养液下1cm处的菌液OD600， 计算得出自凝集 率， 自凝集率的计算公式为： AAg()(自凝集后上层菌液OD600-自凝集前OD600)/自凝集前OD600100。 3.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特。

5、征在于， 所述g中调控菌膜特性的方法为： 先将突变株在LB培养基中培养至OD6000.02， 之后转接 至发酵培养基培养至OD6002.0时， 加入IPTG在15-30振荡培养， 然后移出培养液， 依次 经洗涤、 染色、 静置、 再次洗涤至无紫色， 最后加入乙酸处理， 在可见光597nm下测定所得溶 液的吸光度， 记为菌膜形成率。 4.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 通过改变非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因表达水平和蛋白表达量以改变纳豆芽孢杆菌 自凝集能力和菌膜特性。 5.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征。

6、在于， 所述步骤c中目的基因片段两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列。 6.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 所述步骤d中的载体为诱导表达型载体。 7.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 所述步骤e中抗性基因筛选选用的是氨苄青霉素和四环素抗性。 8.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 所述HBsu基因是SEQ ID No： 1所示的碱基序列。 9.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在于， 所述步骤c中的引物对为SEQ ID 。

7、No： 2和SEQ ID No： 3所示的核苷酸序列。 10.根据权利要求1所述调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 其特征在 于， 所述方法通过调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性以改变纳豆芽孢杆菌合成维生 素K2的能力。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109837289 A 2 一种调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法 技术领域 0001 本发明属于工业微生物菌种改造技术领域， 具体涉及一种调控纳豆芽孢杆菌自凝 集能力和菌膜特性的方法。 背景技术 0002 作为一类重要的脂溶性维生素， 维生素K2在食品和医药领域都有着重要应用。 健 康人群适量补充富含维生素K2食品， 可。

8、有效减小骨折发病率。 另外， 越来越多的资料显示维 生素K2缺乏是引发世界性婴儿出血疾病和死亡的重要原因。 并且， 近几年国内外学者在 Science和Nature等顶级国际期刊发表的研究报道都表明， 同辅酶Q相似， 维生素K2作为一 种膜结合电子载体， 具有修复损伤细胞线粒体的功能， 这对于人类免受帕金森症折磨起着 重要的作用。 由于这三方面的应用， 国际市场对功能性食品维生素K2的需求近年来不断增 加。 0003 有研究发现， 纳豆芽胞杆菌摇瓶规模下静态发酵自凝集产生了大量生物膜， 而这 些生物膜的形成明显促进了维生素K2的合成。 因此， 调控纳豆芽孢杆菌自凝集能力和菌膜 特性， 对于促进。

9、维生素K2的合成代谢， 具有十分重要的意义。 然而， 目前国内对于纳豆芽孢 杆菌自凝集能力和菌膜特性的研究仍鲜有报道。 发明内容 0004 本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。 为此， 本发明提供一种调控纳豆芽 孢杆菌自凝集能力和菌膜特性的方法， 通过调控HBsu编码基因表达水平和蛋白量， 纳豆芽 孢杆菌自凝集能力和菌膜形成能力显著增强， 进而最终提高了维生素K2的合成水平。 0005 为了实现上述目的， 本发明采取的技术方案为： 0006 一种调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法， 包括如下步骤： 0007 a、 将纳豆芽孢杆菌在LB液体培养基中培养； 0008 b、 提取纳豆芽孢。

10、杆菌全基因组； 0009 c、 以非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因为目的基因设计引物对进行过表达， 对 纳豆芽孢杆菌全基因组进行PCR扩增目的基因片段； 0010 d、 将目的基因片段与载体连接构建用于增强HBsu活性的增强载体； 0011 e、 增强载体转化纳豆芽孢杆菌， 并利用载体上的抗性基因筛选转化子， 将筛选到 的转化子转接到斜面培养基上； 0012 f、 从斜面培养基上挑取菌落在种子培养基上进行培养突变株； 0013 g、 通过调节突变株分别在加入IPTG培养时的温度以调控突变株自凝集能力和菌 膜特性。 0014 所述步骤g中调控突变株自凝聚能力的方法为： 先将突变株接入发酵培。

11、养基中培 养， 之后加入IPTG在15-30培养至OD6003.0， 然后依次经离心、 洗涤、 重悬， 并控制OD600 2.5， 最后将重悬液放置24小时后测定自凝集后各培养液下1cm处的菌液OD600， 计算得出 说明书 1/7 页 3 CN 109837289 A 3 自凝集率， 自凝集率的计算公式为： 0015 AAg()(自凝集后上层菌液OD600-自凝集前OD600)/自凝集前OD600100。 0016 优选的， 将原纳豆芽孢杆菌及突变株分别接入发酵培养基中， 检测各菌株自凝集 特性的大小。 培养条件是37培养2天， 加入IPTG诱导表达， 转15、 20、 25、 30接着培养。

12、至 OD6003.0。 6000g离心10min收集菌体， 并用磷酸盐缓冲液洗涤菌体两次。 最后， 以磷酸 盐缓冲液重悬菌体， 并控制OD6002.5。 取重悬液5mL置于玻璃试管中， 4下静置24小时， 测定各培养液面下1cm处的菌液浓度， 每个样品设三个平行。 0017 所述g中调控菌膜特性的方法为： 先将突变株在LB培养基中37培养至OD600 0.02， 之后转接至发酵培养基培养至OD6002.0时， 加入IPTG在15-30振荡培养， 然后移 出培养液， 依次经洗涤、 染色、 静置、 再次洗涤至无紫色， 最后加入乙酸处理， 在可见光597nm 下测定所得溶液的吸光度(以原始菌为空白对。

13、照)， 记为菌膜形成率。 0018 优选的， 以原纳豆芽孢杆菌及突变株为研究对象， LB培养基中培养至OD600 0.02， 转接至5mL含TSB培养基试管， 培养至OD6002.0时， 加入IPTG培养， 15、 20、 25、 30振 荡培养24小时后， 缓缓移去试管中的培养物， 用蒸馏水清洗23次， 晾干后加入3mL的质量 体积比为0.1结晶紫溶液(w/v)进行染色， 室温静置20min， 倒掉染色剂后再以蒸馏水清 洗23次， 洗去浮色， 倒置晾干20min， 除去残余水分， 最后加入2mL 33乙酸(v/v)超声 脱色10min， 以体积分数33乙酸为参照， 在可见光597nm下测定所。

14、得溶液的吸光度(以原始 菌为空白对照)， 记为菌膜形成率。 0019 将原纳豆芽孢杆菌及突变株分别接入发酵培养基中， 37培养2天， 加入IPTG转 15、 20、 25、 30接着培养至3-5天后测定发酵液维生素K2产量。 并采用反转录PCR或荧光定 量PCR检测各菌株hbs表达水平。 测定发酵液维生素K2含量采用HPLC进行测量， 荧光定量PCR 检测采用SYBR Green Real-Time qPCR试剂盒进行检测。 0020 所述发酵培养基是TSB， 成分(w/v)为： 胰蛋白胨17g， 大豆木瓜蛋白酶消化物3g， 氯化钠5g， 磷酸二氢钾2.5g， 葡萄糖2.5g。 0021 所述。

15、步骤c中目的基因片段两侧加有限制性内切酶的酶切位点和保护碱基序列。 0022 所述步骤d中的载体为诱导表达型载体。 0023 所述步骤e中载体转化纳豆芽孢杆菌的方式可以为电激转化、 采用聚乙二醇介导 的原生质体转化、 异丙醇转化或二甲基亚砜转化。 0024 所述步骤e中抗性基因筛选选用的是氨苄青霉素和四环素抗性。 0025 所述HBsu基因是SEQ ID No： 1所示的碱基序列。 0026 所述步骤c中的引物对为SEQ ID No： 2和SEQ ID No： 3所示的核苷酸序列。 0027 通过改变非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因表达水平和蛋白表达量以改变纳豆 芽孢杆菌自凝集能力和菌膜。

16、特性。 改变的方式是通过过表达非特异性DNA结合蛋白的表达 水平调控纳豆芽孢杆菌自凝集能力和菌膜特性。 0028 所述方法通过调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性以改变纳豆芽孢杆菌合 成维生素K2的能力。 0029 本发明的有益效果： 本发明通过过表达非特异性DNA结合蛋白的表达水平调控纳 豆芽孢杆菌自凝集能力和菌膜特性， 获得一株能富集生成生物膜的突变株； 本发明获得的 突变株菌体自凝集率大幅度提高， 菌体对数生长期延长， 生物膜形成能力提高。 进入发酵后 说明书 2/7 页 4 CN 109837289 A 4 期生物膜形成后， 维生素K2产量也有明显提高。 该方法通过温度诱导调控非特异性。

17、DNA结合 蛋白(HBsu)的表达量， 最终影响了纳豆芽孢杆菌合成维生素K2的能力。 本发明为维生素K2优 良菌株的选育提供了一条新思路， 在食品、 生物制药领域具有较大的实际意义和广阔的应 用前景。 附图说明 0030 本说明书包括以下附图， 所示内容分别是： 0031 图1为原始菌及不同诱导温度下获得的突变株采用荧光定量PCR测得hbs基因的不 同表达水平； 0032 图2为原始菌及不同诱导温度下获得的突变株采用Western blot测得HBsu的不同 表达量。 具体实施方式 0033 下面通过对实施例的描述， 对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明， 目的 是帮助本领域的技术人员对本。

18、发明的构思、 技术方案有更完整、 准确和深入的理解， 并有助 于其实施。 0034 实施例1 0035 以纳豆芽孢杆菌BS-13为出发菌株， 依次按照下列步骤进行操作： 0036 1、 将纳豆芽孢杆菌培养在50mL LB培养基中37摇床培养48h。 0037 2、 收集培养液， 离心后收集菌体沉淀， 用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20。 0038 3、 非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因hbs为目的基因， 设计引物对如下： 0039 Primer-F 5-GCGTCGACATGAACAAAACAGAACTTATCAATGCG 3(SEQ ID No： 2) 0040 Primer-R 。

19、5-GAATTCCGTTATTTTCCGGCAACTGCGTCTTTAAG 3(SEQ ID No： 3) 0041 以基因组DNA为模板， 用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增， 目的片段约为279bp。 0042 4、 将载体pHY-P43转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素和 四环素抗性的平板上， 于37恒温培养箱中培养过夜(12-16h)。 从转化平板中挑取单菌落， 液体培养后用质粒提取试剂盒提取质粒后保存于-20。 0043 5、 分别将载体与目的片段用SalI和EcoRI酶切后， 在T4DNA连接酶作用下连接成增 强载体pHY-P43。 0044 6、 获得的增。

20、强载体利用电转化法进入纳豆芽孢杆菌BS-13， 利用氨苄青霉素和四 环素抗性筛选转化子， 筛选到的转化子转接到斜面培养基上保存。 0045 7、 从斜面培养基上挑取菌落至50mL LB种子培养基中进行培养， 于37恒温培养 箱中培养48h。 0046 8、 将纳豆芽孢杆菌突变株种液分别按5的接种量接入含50mL发酵培养基的 500mL锥形瓶中， 37下220r/min培养2天。 发酵培养基是TSB， 成分(w/v)为： 胰蛋白胨 17g， 大豆木瓜蛋白酶消化物3g， 氯化钠5g， 磷酸二氢钾2.5g， 葡萄糖2.5g。 加入IPTG转15 接着培养至OD6003.0， 然后6000g离心10m。

21、in收集菌体， 并用磷酸盐缓冲液洗涤菌体两 次。 最后， 以磷酸盐缓冲液重悬菌体， 并控制磷酸盐缓冲液添加量使自凝集前菌体OD600 2.5。 取重悬液5mL置于玻璃试管中， 4放置24小时后测定自凝集后培养液下1cm处的菌液 说明书 3/7 页 5 CN 109837289 A 5 OD600为5.5-6.5， 突变株自凝集率为120-160。 0047 9、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株LB培养基中培养至OD6000.02， 转接至5mL含 TSB培养基试管， 培养至OD6002.0时， 加入IPTG培养， 15振荡培养24小时后， 缓缓移去试 管中的培养物， 用蒸馏水清洗23次， 晾。

22、干后加入3mL的质量体积比为0.1结晶紫溶液(w/ v)进行染色， 室温静置20min， 倒掉染色剂后再以蒸馏水清洗23次， 洗去浮色， 倒置晾干 20min， 除去残余水分， 最后加入2mL 33乙酸(v/v)超声脱色10min， 以体积分数33乙 酸为参照， 在可见光597nm下测定所得溶液的吸光度， 突变株菌膜形成率(以纳豆芽孢杆菌 BS-13为空白对照)OD597为1.3-1.8。 0048 10、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株分别接入发酵培养基中， 37培养2天， 加入 IPTG转15接着培养至3-5天后， 突变株维生素K2产量为37.8-59.4mg/L， 较BS-13提高2.。

23、1- 3.3倍。 0049 实施例2 0050 以纳豆芽孢杆菌BS-13为出发菌株， 依次按照下列步骤进行操作： 0051 1、 将纳豆芽孢杆菌培养在50mL LB培养基中37摇床培养48h。 0052 2、 收集培养液， 离心后收集菌体沉淀， 用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20。 0053 3、 非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因hbs为目的基因， 设计引物对如下： 0054 Primer-F 5-GCGTCGACATGAACAAAACAGAACTTATCAATGCG 3(SEQ ID No： 2) 0055 Primer-R 5-GAATTCCGTTATTTTCCGGCAACTGC。

24、GTCTTTAAG 3(SEQ ID No： 3) 0056 以基因组DNA为模板， 用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增， 目的片段约为279bp。 0057 4、 将载体pHY-P43转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素和 四环素抗性的平板上， 于37恒温培养箱中培养过夜(12-16h)。 从转化平板中挑取单菌落， 液体培养后用质粒提取试剂盒提取质粒后保存于-20。 0058 5、 分别将载体与目的片段用SalI和EcoRI酶切后， 在T4DNA连接酶作用下连接成增 强载体pHY-P43。 0059 6、 获得的增强载体利用电转化法进入纳豆芽孢杆菌BS-13， 利用氨苄。

25、青霉素和四 环素抗性筛选转化子， 筛选到的转化子转接到斜面培养基上保存。 0060 7、 从斜面培养基上挑取菌落至50mL LB种子培养基中进行培养， 于37恒温培养 箱中培养48h。 0061 8、 将纳豆芽孢杆菌突变株种液分别按5的接种量接入含50mL发酵培养基的 500mL锥形瓶中， 37下220r/min培养2天。 发酵培养基是TSB， 成分(w/v)为： 胰蛋白胨 17g， 大豆木瓜蛋白酶消化物3g， 氯化钠5g， 磷酸二氢钾2.5g， 葡萄糖2.5g。 加入IPTG转20 接着培养至OD6003.0， 然后6000g离心10min收集菌体， 并用磷酸盐缓冲液洗涤菌体两 次。 最后，。

26、 以磷酸盐缓冲液重悬菌体， 并控制磷酸盐缓冲液添加量使自凝集前菌体OD600 2.5。 取重悬液5mL置于玻璃试管中， 4放置24小时后测定自凝集后培养液下1cm处的菌液 OD600为5.2-7.0， 突变株自凝集率为110-180。 0062 9、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株LB培养基中培养至OD6000.02， 转接至5mL含 TSB培养基试管， 培养至OD6002.0时， 加入IPTG培养， 20振荡培养24小时后， 缓缓移去试 管中的培养物， 用蒸馏水清洗23次， 晾干后加入3mL的质量体积比为0.1结晶紫溶液(w/ v)进行染色， 室温静置20min， 倒掉染色剂后再以蒸馏水清。

27、洗23次， 洗去浮色， 倒置晾干 说明书 4/7 页 6 CN 109837289 A 6 20min， 除去残余水分， 最后加入2mL 33乙酸(v/v)超声脱色10min， 以体积分数33乙 酸为参照， 在可见光597nm下测定所得溶液的吸光度， 突变株菌膜形成率(以纳豆芽孢杆菌 BS-13为空白对照)OD597为1.2-2.6。 0063 10、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株分别接入发酵培养基中， 37培养2天， 加入 IPTG转20接着培养至3-5天后， 突变株维生素K2产量为50.4-77.4mg/L， 较BS-13提高2.8- 4.3倍。 0064 实施例3 0065 以纳豆芽。

28、孢杆菌BS-13为出发菌株， 依次按照下列步骤进行操作： 0066 1、 将纳豆芽孢杆菌培养在50mL LB培养基中37摇床培养48h。 0067 2、 收集培养液， 离心后收集菌体沉淀， 用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20。 0068 3、 非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因hbs为目的基因， 设计引物对如下： 0069 Primer-F 5-GCGTCGACATGAACAAAACAGAACTTATCAATGCG 3(SEQ ID No： 2) 0070 Primer-R 5-GAATTCCGTTATTTTCCGGCAACTGCGTCTTTAAG 3(SEQ ID No： 3) 00。

29、71 以基因组DNA为模板， 用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增， 目的片段约为279bp。 0072 4、 将载体pHY-P43转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素和 四环素抗性的平板上， 于37恒温培养箱中培养过夜(12-16h)。 从转化平板中挑取单菌落， 液体培养后用质粒提取试剂盒提取质粒后保存于-20。 0073 5、 分别将载体与目的片段用SalI和EcoRI酶切后， 在T4DNA连接酶作用下连接成增 强载体pHY-P43。 0074 6、 获得的增强载体利用电转化法进入纳豆芽孢杆菌BS-13， 利用氨苄青霉素和四 环素抗性筛选转化子， 筛选到的转化子转接到斜。

30、面培养基上保存。 0075 7、 从斜面培养基上挑取菌落至50mL LB种子培养基中进行培养， 于37恒温培养 箱中培养48h。 0076 8、 将纳豆芽孢杆菌突变株种液分别按5的接种量接入含50mL发酵培养基的 500mL锥形瓶中， 37下220r/min培养2天。 发酵培养基是TSB， 成分(w/v)为： 胰蛋白胨 17g， 大豆木瓜蛋白酶消化物3g， 氯化钠5g， 磷酸二氢钾2.5g， 葡萄糖2.5g。 加入IPTG转25 接着培养至OD6003.0， 然后6000g离心10min收集菌体， 并用磷酸盐缓冲液洗涤菌体两 次。 最后， 以磷酸盐缓冲液重悬菌体， 并控制磷酸盐缓冲液添加量使自。

31、凝集前菌体OD600 2.5。 取重悬液5mL置于玻璃试管中， 4放置24小时后测定自凝集后培养液下1cm处的菌液 OD600为5.2-6.3， 突变株自凝集率为110-150。 0077 9、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株LB培养基中培养至OD6000.02， 转接至5mL含 TSB培养基试管， 培养至OD6002.0时， 加入IPTG培养， 25振荡培养24小时后， 缓缓移去试 管中的培养物， 用蒸馏水清洗23次， 晾干后加入3mL的质量体积比为0.1结晶紫溶液(w/ v)进行染色， 室温静置20min， 倒掉染色剂后再以蒸馏水清洗23次， 洗去浮色， 倒置晾干 20min， 除去残余。

32、水分， 最后加入2mL 33乙酸(v/v)超声脱色10min， 以体积分数33乙 酸为参照， 在可见光597nm下测定所得溶液的吸光度， 突变株菌膜形成率(以纳豆芽孢杆菌 BS-13为空白对照)OD597为1.4-2.1。 0078 10、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株分别接入发酵培养基中， 37培养2天， 加入 IPTG转25接着培养至3-5天后， 突变株维生素K2产量为32.4-43.2mg/L， 较BS-13提高1.8- 说明书 5/7 页 7 CN 109837289 A 7 2.4倍。 0079 实施例4 0080 以纳豆芽孢杆菌BS-13为出发菌株， 依次按照下列步骤进行操作：。

33、 0081 1、 将纳豆芽孢杆菌培养在50mL LB培养基中37摇床培养48h； 0082 2、 收集培养液， 离心后收集菌体沉淀， 用试剂盒提取基因组DNA后保存于-20。 0083 3、 非特异性DNA结合蛋白HBsu编码基因hbs为目的基因， 设计引物对如下： 0084 Primer-F 5-GCGTCGACATGAACAAAACAGAACTTATCAATGCG 3(SEQ ID No： 2) 0085 Primer-R 5-GAATTCCGTTATTTTCCGGCAACTGCGTCTTTAAG 3(SEQ ID No： 3) 0086 以基因组DNA为模板， 用Taq DNA聚合酶进行。

34、PCR扩增， 目的片段约为279bp。 0087 4、 将载体pHY-P43转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞后涂布于含氨苄青霉素和 四环素抗性的平板上， 于37恒温培养箱中培养过夜(12-16h)。 从转化平板中挑取单菌落， 液体培养后用质粒提取试剂盒提取质粒后保存于-20。 0088 5、 分别将载体与目的片段用SalI和EcoRI酶切后， 在T4DNA连接酶作用下连接成增 强载体pHY-P43。 0089 6、 获得的增强载体利用电转化法进入纳豆芽孢杆菌BS-13， 利用氨苄青霉素和四 环素抗性筛选转化子， 筛选到的转化子转接到斜面培养基上保存。 0090 7、 从斜面培养基上挑取菌落。

35、至50mL LB种子培养基中进行培养， 于37恒温培养 箱中培养48h。 0091 8、 将纳豆芽孢杆菌突变株种液分别按5的接种量接入含50mL发酵培养基的 500mL锥形瓶中， 37下220r/min培养2天。 发酵培养基是TSB， 成分(w/v)为： 胰蛋白胨 17g， 大豆木瓜蛋白酶消化物3g， 氯化钠5g， 磷酸二氢钾2.5g， 葡萄糖2.5g。 加入IPTG转30 接着培养至OD6003.0， 然后6000g离心10min收集菌体， 并用磷酸盐缓冲液洗涤菌体两 次。 最后， 以磷酸盐缓冲液重悬菌体， 并控制磷酸盐缓冲液添加量使自凝集前菌体OD600 2.5。 取重悬液5mL置于玻璃试。

36、管中， 4放置24小时后测定自凝集后培养液下1cm处的菌液 OD600为5.1-5.8， 突变株自凝集率为104-130。 0092 9、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株LB培养基中培养至OD6000.02， 转接至5mL含 TSB培养基试管， 培养至OD6002.0时， 加入IPTG培养， 30振荡培养24小时后， 缓缓移去试 管中的培养物， 用蒸馏水清洗23次， 晾干后加入3mL的质量体积比为0.1结晶紫溶液(w/ v)进行染色， 室温静置20min， 倒掉染色剂后再以蒸馏水清洗23次， 洗去浮色， 倒置晾干 20min， 除去残余水分， 最后加入2mL 33乙酸(v/v)超声脱色10m。

37、in， 以体积分数33乙 酸为参照， 在可见光597nm下测定所得溶液的吸光度， 突变株菌膜形成率(以纳豆芽孢杆菌 BS-13为空白对照)OD597为1.1-1.6。 0093 10、 将纳豆芽孢杆菌BS-13及突变株分别接入发酵培养基中， 37培养2天， 加入 IPTG转30接着培养至3-5天后， 突变株维生素K2产量为21.6-34.2mg/L， 较BS-13提高1.2- 1.9倍。 0094 本发明采用过表达的方式， 通过调节温度控制hbs的过表达水平和非特异性DNA结 合蛋白(HBsu)的蛋白过表达量(见附图1， 2)， 调控纳豆芽孢杆菌自凝集能力和菌膜特性， 最 终影响了纳豆芽孢杆菌。

38、合成维生素K2的能力。 0095 以上对本发明进行了示例性描述。 显然， 本发明具体实现并不受上述方式的限制。 说明书 6/7 页 8 CN 109837289 A 8 只要是采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进； 或未经改进， 将 本发明的上述构思和技术方案直接应用于其它场合的， 均在本发明的保护范围之内。 说明书 7/7 页 9 CN 109837289 A 9 SEQUENCE LISTING 安徽工程大学 一种调节纳豆芽孢杆菌自凝聚能力和菌膜特性的方法 1 3 PatentIn version 3.3 1 279 DNA 纳豆芽孢杆菌hbs 1 atgaacaaaa。

39、 cagaacttat caatgcggtt gcagaagcaa gcgaattgtc taaaaaagac 60 gctacaaaag cagttgactc tgtttttgat acgatcttag atgcacttaa aaacggtgat 120 aaaatccaac tgatcggttt tggtaacttc gaggtgcgtg aacgttctgc acgtaaagga 180 cgcaaccctc aaacaggtga agaaatcgaa attccagcga gcaaagtacc tgctttcaaa 240 ccaggtaaag cgcttaaaga cgcagttgcc ggaaaataa 279 2 35 DNA 人工序列 2 gcgtcgacat gaacaaaaca gaacttatca atgcg 35 3 35 DNA 人工序列 3 gaattccgtt attttccggc aactgcgtct ttaag 35 序列表 1/1 页 10 CN 109837289 A 10 图1 图2 说明书附图 1/1 页 11 CN 109837289 A 11 。