一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910117363.6 (22)申请日 2019.02.15 (71)申请人 温州医科大学附属第二医院、 温州 医科大学附属育英儿童医院 地址 325000 浙江省温州市鹿城区学院西 路109号 (72)发明人 褚茂平郭晓令李超陈显武 (74)专利代理机构 温州名创知识产权代理有限 公司 33258 代理人 陈加利 (51)Int.Cl. C12N 15/66(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 9/02(2006.01) (54)发明名称。

2、 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、 相应基 因载体及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种人源一氧化氮合酶2(NOS2) 基因过表达慢病毒载体、 NOS2基因过表达慢病毒 及其构建方法和应用。 本发明通过分子克隆技 术， 将普通质粒上的人源NOS2基因利用PCR扩增 技术加上XhoI和BamHI酶切位点， 并经酶切后连 接到空载的过表达慢病毒载体上， 得到NOS2基因 过表达的慢病毒载体。 再使用慢病毒包装质粒对 NOS2基因过表达慢病毒载体进行包装， 通过转染 293T细胞， 得到相应的慢病毒。 本发明构建的 NOS2基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高， 能特异性、 持续、 高效的。

3、促进人源NOS2基因在宿 主细胞中稳定表达。 同时， 本发明构建的NOS2基 因过表达慢病毒载体能特异性合成可诱导型一 氧化氮合酶(iNOS)， 并带有绿色荧光蛋白标签， 为进一步研究人源一氧化氮合酶2(NOS2)的功能 和潜在作用机理提供了实验基础。 权利要求书1页 说明书9页 序列表2页 附图10页 CN 109868280 A 2019.06.11 CN 109868280 A 1.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体的制备方法， 其特征在于， 所述人源 一氧化氮合酶2基因为NOS2基因， 所述制备方法包括以下步骤： 以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板， 通。

4、过上游引物NOS2-F和下游引物 NOS2-R对该模板进行PCR扩增获得NOS2基因， 此上下游引物两端分别预先设计加入XhoI和 BamHI酶切位点序列， 所述NOS2-F的上游引物序列为： CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT， NOS2-R的下游引物序列为： GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG； 确认步骤中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的NOS2基因； 用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的NOS2基因和空载的过 表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后， 回收纯化带有酶切粘。

5、性末端的NOS2基 因和pLVX-IRES-ZsGreen1； 采用T4 DNA连接酶将NOS2基因连接到pLVX-IRES-ZsGreen1上， 得到NOS2基因过表达 的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。 2.一种如权利要求1所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒 载体。 3.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法， 其特征在于， 所述人源一氧 化氮合酶2基因为NOS2基因， 所述制备方法为： 使用慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包装质 粒pMD2.G对所述NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2进行包。

6、装并通过转 染293T细胞， 得到NOS2基因过表达慢病毒。 4.如权利要求3所述的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法， 其特征在 于， 所述制备方法具体包括以下步骤： S1： 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞并培养， 待倒置光学显微镜下观察细胞达 到70-90汇合度时准备转染； S2： 用所述过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、 慢病毒包装质粒psPAX2及慢 病毒包装质粒pMD2.G转染步骤S1中得到的293T细胞， 过表达慢病毒载体pLVX-IRES- ZsGreen1-NOS2、 慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G的比率为。

7、2:1:1； S3： 对转染后的293T细胞进行细胞培养12h后， 弃细胞上清液后再用PBS轻轻洗涤3次， 重新加入新鲜的完全培养基后继续培养48h后回收细胞上清液， 经低速离心、 过滤、 超速离 心、 吸弃上清后留沉淀， 用冰上预冷的PBS重悬沉淀后得到所述人源一氧化氮合酶2基因过 表达慢病毒。 5.一种如权利要求3至4中任一所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表 达慢病毒。 6.人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒在合成可诱导型一氧化氮合酶中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109868280 A 2 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、 相应基因载体及其制备方 法和应用 技。

8、术领域 0001 本发明属于分子生物学领域， 尤其涉及一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病 毒载体、 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。 背景技术 0002 NO是一种新型生物信使分子， 广泛存在于多种细胞中。 其结构简单、 可快速透过生 物膜进行扩散； NO分子中有一未配对电子， 可形成自由基,从而可与超氧自由基、 氧分子或 过渡金属反应； 此外， NO作为第二信使普遍存在于脊椎动物中， 对血管的流速、 流量及血管 阻力起调节作用。 人体的免疫功能、 血小板凝集反应、 记忆和神经传递等内环境稳定都与其 有关。 因此， NO受到人们的普遍重视。 0003 NO是活性氮簇(RNS。

9、)的一员， 由一氧化氮合酶(NOS)产生， 可诱导型NOS (iNOS)是 NOS的一种亚型， 由NOS2基因编码。 研究表明， iNOS在慢性神经变性疾病、 炎症、 梗阻性病变、 肿瘤、 移植/植入等行为中发挥重要作用。 iNOS 的表达与信号通路中的丝裂原活化蛋白激 酶(MAPK)通路、 核因子(NF-kB)通路、 蛋白激酶(PK)C通路、 环腺营酸(cAMP)依赖PKA通路、 核 激素受体过氧化物酶体增生激活受体(PPAR)通路、 磷脂酰肌醇兰羟基激酶(P13K)-蛋白激 酶 B(Akt通路)、 JAK/信号转导及转录活化因子(STAT)通路、 血红素加氧酶(HO)-1/ 一氧化 碳(C。

10、O)通路均密切相关。 构建NOS2基因过表达慢病毒载体从而具有重要意义。 0004 为实现NOS2基因在目的细胞中过表达， 目前普遍采用将整合有NOS2基因的普通过 表达质粒通过脂质体对宿主细胞进行转染， 但是对大多数细胞脂质体转染效率较低。 因此， 如何提高NOS2基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。 发明内容 0005 未解决上述技术问题， 本发明提供了一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病 毒载体、 一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。 0006 本发明提供一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体及其制备方法。 制 备方法包括以下步骤：。

11、 0007 以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板， 通过上游引物NOS2-F 和下游引 物NOS2-R对该模板进行PCR扩增， 预先在上下游引物两端分别设计加入XhoI和BamHI酶切位 点序列以获取一氧化氮合酶2(NOS2)基因， 所述 NOS2-F的上游引物序列为 CACCTCGAGATG GCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT， NOS2-R的下游引物序列为GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG。 0008 确认步骤在中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的一氧化氮合酶2 (NOS2) 基因。 0009 用XhoI限制性内切酶和Bam。

12、HI限制性内切酶分别对所述纯化的一氧化氮合酶2 (NOS2)基因和空载过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后， 回收纯化带有酶 切粘性末端的NOS2基因和pLVX-IRES-ZsGreen1。 说明书 1/9 页 3 CN 109868280 A 3 0010 采用T4 DNA连接酶将一氧化氮合酶2(NOS2)基因连接到 pLVX-IRES-ZsGreen1 上， 得到NOS2基因过表达的慢病毒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。 0011 人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体即为上述制备方法制备获得。 0012 此外还提供一种一氧化氮。

13、合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒及其制备方法， 制备方 法为： 使用慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包装质粒pMD2.G对所述 pLVX-IRES-ZsGreen1- NOS2进行包装并通过转染293T细胞， 得到NOS2基因过表达慢病毒。 0013 进一步， 所述制备方法具体包括以下步骤： 0014 S1： 用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞并培养消化后的293T细胞， 待倒置光 学显微镜下观察细胞达到70-90汇合度时准备转染。 0015 S2： 用所述NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、 慢病毒包装质 粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2。

14、.G转染步骤S1中得到的293T 细胞， NOS2基因过表达慢病 毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、 慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G的比 率为2:1:1。 0016 S3： 对转染后的293T细胞进行细胞培养12h后， 弃细胞上清液后再用PBS 轻轻洗3 次。 重新加入新鲜的完全培养基后继续培养48h， 然后回收细胞上清液、 低速离心、 过滤、 超 速离心、 吸弃上清后留沉淀， 用冰上预冷的PBS重悬沉淀后得到人源一氧化氮合酶2(NOS2) 基因过表达慢病毒。 0017 一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒即为上述制备方法制备所获得。 0018。

15、 此外， 还提供一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒在感染人源心肌细胞HMC中 的应用。 0019 本发明提供的人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、 一氧化氮合酶2 (NOS2)基因过表达慢病毒以及他们的构建方法。 本发明构建的人源一氧化氮合酶2(NOS2) 基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高， 能特异性、 持续、 高效的促进一氧化氮合酶基因 在宿主细胞中稳定表达。 同时， 本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒载体能特异性合成可 诱导型一氧化氮合酶(iNOS)， 并带有绿色荧光蛋白标签， 为进一步研究一氧化氮合酶2 (NOS2)的功能和潜在作用机理提供了实验基础。 00。

16、20 以下结合附图对本发明进行更进一步详细的说明。 附图说明 0021 图1为pDoubleEx-EGFP-NOS2普通质粒图谱。 0022 图2为pLVX-IRES-ZsGreen1空载过表达慢病毒载体图谱。 0023 图3为psPAX2慢病包装质粒图谱。 0024 图4为pMD2.G慢病包装质粒图谱。 0025 图5为PCR扩增NOS2基因。 0026 图6为菌落PCR鉴定(随机挑选1-20号菌落)， 其中A为PCR鉴定电泳图， B为200bp DNA marker图。 0027 图7为2号阳性克隆测序报告图。 0028 图8为人源NOS2基因过表达慢病毒感染的293T细胞， 其中A表示明。

17、场， B表示荧光 场， C表示明场和荧光场叠加。 说明书 2/9 页 4 CN 109868280 A 4 0029 图9为人源NOS2基因过表达慢病毒感染人源心肌细胞HCM， 其中A表示明场， B表示 荧光场， C表示明场和荧光场叠加。 0030 图10为qPCR定量检测比较NOS2基因过表达慢病毒感染或未感染的HCM 细胞NOS2 基因表达水平。 *P0.05表示有统计学意义。 0031 图11为WB定量检测比较NOS2基因过表达慢病毒感染或未感染的HCM 细胞可诱导 型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平， 其中A为WB蛋白条带， B为蛋白条带定量图。 *P0.05表示 有统计学意义。 具体。

18、实施方式 0032 本文所称NOS2基因过表达慢病毒载体、 慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2均 为一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体， 所称NOS2基因过表达慢病毒为一氧化氮 合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒。 所称Tryptone为胰蛋白胨， 所称Yeast Extract为酵母粉， 所称NaCl为氯化钠。 下面， 通过示例性的实施例本发明具体描述。 0033 实施例1 0034 实验材料包括有： DH5a感受态细胞(Invitrogen)； 293T细胞(ATCC)； 人源心肌细胞 HCM(ATCC)。 0035 LB培养基(Sigma)； 普通过表达。

19、质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2(长沙赢润生物)； 慢病 毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1(南京麦田生物)； 慢病毒包装质粒psPAX2 和pMD2.G； 胎牛血清 FBS(Invitrogen)； 胰蛋白酶(Gibco)； DEMEM-F12基础培养基(Gibco)； PBS缓冲液(Gibco)； 100U/mL青霉素(Gibco)； 100ug/mL 链霉素(Gibco)； XhoI和BamHI限制性内切酶(Takara)； 去内毒素质粒提取试剂盒(TIANGEN)； 切胶回收试剂盒(TIANGEN)； T4 DNA连接酶(NEB)； Amp 抗生素(上海宁杭生物)； 。

20、DNA marker(Invitrogen)； Q5超保真DNA聚合酶 (NEB)； DNA聚合酶 (NEB)； 引物合成(上海生工)； 基因测序(天擎生物)； 逆转录试剂盒(TOYOBO)； qPCR试剂盒 (NEB)； LTX脂质体转染试剂盒 (Invitrogen)。 0036 实验过程如下所示： 0037 LB培养基包括有10克Tryptone， 5克Yeast Extract和10克NaCl。 将这些内容物用 去离子水溶解， 调节PH至7.0， 再定容至1000mL， 分装到LB管中， 每管5mL， 高压灭菌， 4保 存。 0038 如果配置LB固体培养基， 需加入2(质量/体积)琼。

21、脂粉。 0039 人源NOS2基因过表达的慢病毒载体构建 0040 步骤、 利用长片段高保真性DNA聚合酶， 以购买普通质粒 pDoubleEx-EGFP-NOS2 为基因模板， 通过如表1所示引物进行PCR扩增获取 NOS2基因， 在上下游引物两端分别预先 设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列。 0041 表1 NOS2-F与NOS2-R的引物情况 0042 引物名称 引物序列 PCR产物 NOS2-F CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT 3462bp NOS2-R GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG 3462bp 0043 P。

22、CR反应体系与条件如表2所示。 说明书 3/9 页 5 CN 109868280 A 5 0044 表2 PCR反应体系与条件 0045 成分 体积 模板(pDoubleEx-EGFP-NOS2质粒) 1 L NOS2-F(10 M) 1.25 L NOS2-R(10 M) 1.25 L 5Q5反应缓冲液 5 L 5Q5 High GC Enhancer 5 L dNTPs(10mM) 0.5 L Q5超保真DNA聚合酶 0.3 L ddH2O 10.7 L 总体积 20 L 0046 PCR反应程序如表3所示。 0047 表3 PCR反应程序 0048 0049 NOS2基因CDS核苷酸序列。

23、如SEQ ID NO.1所示。 0050 步骤、 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否为3462bp， 如果吻合， 切割在琼脂 糖凝胶电泳中的目的片段， 采用切胶回收试剂盒回收纯化NOS2基因。 0051 步骤、 用XhoI和BamHI限制性内切酶分别对NOS2基因和慢病毒载体pLVX-IRES- ZsGreen1进行双酶切(37酶切4h)， 反应体系如表4所示： 0052 表4限制性内切酶的酶切反应体系 0053 试剂 体积 pLVX-IRES-ZsGreen1或NOS2基因 2 L(1 g) 10H Buffer 6 L 10K Buffer 6 L XhoI 3 L BamHI 3 L 。

24、ddH2O 30 L 总体积 50 L 0054 应用琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果， 切割在琼脂糖凝胶电泳中的NOS2基因和慢病 说明书 4/9 页 6 CN 109868280 A 6 毒载体， 采用切胶回收试剂盒回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和慢病毒载体。 0055 步骤、 采用T4 DNA连接酶于16水浴锅中， 将NOS2基因和慢病毒载体的粘性末 端进行连接过夜(12h)。 反应体系如表5所示。 0056 表5连接酶连接的反应体系 0057 0058 0059 为证实确实建构了可应用的NOS2基因慢病毒载体， 进行以下实验过程： 0060 实验例1： 0061 转化感受态细胞： 从。

25、-80冰箱取出1管100 L DH5a感受态细胞， 放4冰箱解冻， 吸取50 L DH5a感受态细胞转移到新的EP管中。 然后取上述连接产物10 L 加入到其中一管 感受态细胞中混匀， 另外一管加入10 L的ddH2O作为对照组。 冰浴吸附30min， 42水浴锅总 热激90s， 冰上静止5min。 接着加入400 L LB液体培养基， 37恒温摇床(转速150转/min)恢 复培养45min， 同时将LB固态培养板(带Amp抗生素)放入37恒温箱中预热。 然后将其混匀 后涂布到预热后的 LB固态培养板上， 然后37培养箱静止培养1h， 最后37倒置培养过夜 (10h)。 0062 菌落PCR。

26、鉴定： 观察培养过夜后对照组LB平板是否有菌落长出， 如果没有， 证明没 有杂菌污染。 接着采用200 L灭菌的枪头随机挑取实验组中数个菌落划痕到新的LB固态培 养板对应方格中上继续培养12h(该培养板提前在反面画均匀的方格并标上序号)。 把划痕 后的枪头置于装有LB液体培养基(带Amp抗生素) 的EP管中(管盖提前对应平板上方格做好 编号)， 并用移液器吹打几次， 使菌液混匀到培养基中。 将EP管置于管架上， 用报纸包裹， 转 移到37摇床培养12h， 要倾斜放置。 培养12h后， 固体培养板用封口膜封住， 4保存， EP管 菌液进行菌液PCR鉴定。 鉴定引物如表6， 反应体系如表7， 反应。

27、条件如表8： 0063 表6鉴定引物情况表 0064 引物名称 引物序列 PCR产物 NOS2-JD-F CAGGGTGGAAGCGGTAACAA 495bp NOS2-JD-R ACCTCAAGCACAAGGTCAGG 495bp 0065 表7 PCR反应体系与条件 说明书 5/9 页 7 CN 109868280 A 7 0066 0067 0068 表8 PCR反应程序 0069 0070 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小是否为495bp， 如果吻合， 则证明该编号下菌液 为阳性克隆。 再将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行进一步测序验证， 测序引物选用CMV启 动子。 0071 实验结。

28、果： 如图1所示， 商业化带人源NOS2基因的模板， 该基因CDS序列已经克隆到 普通过表达质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2上。 0072 如图5所示， 利用PCR扩增技术获取两端分别带XhoI和BamHI酶切位点序列的NOS2 基因， 分子量3500bp左右。 如图2所示， 通过酶切和酶连操作将NOS2基因克隆到pLVX-IRES- ZsGreen1慢病毒载体上。 如图6所示， 通过菌液PCR鉴定， 成功筛选除19个(总共挑选20个克 隆)阳性克隆， 除5号外均成功PCR获得500bp 左右的目的条带。 随机挑选部分阳性克隆测 序， 其中2号菌液测序结果如图7所示， 经过核酸序列B。

29、last在线软件比对， 成功将NOS2基因 整合到pLVX-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上， 获得NOS2基因过表达慢病毒载体 pLVX-IRES- ZsGreen1-NOS2。 0073 以下提供实施例2， 以阐述NOS2慢病毒的包装和建构。 说明书 6/9 页 8 CN 109868280 A 8 0074 实施例2 0075 步骤S1： 取对数生长期的293T细胞， 用胰蛋白酶消化细胞， 然后用细胞计数板进行 计数， 按细胞浓度1105个/孔接种于6孔细胞培养板中。 每孔加入2mL 完全培养基(DEMEM- F12+10FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)， 转。

30、移至37二氧化碳培养箱继续培养2-3 天， 待倒置光学显微镜下观察细胞达到 70-90汇合度时准备转染。 0076 步骤S2： 按商业化LTX脂质体转染试剂盒说明书进行共转染重组慢病毒过表达载 体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2和慢病毒包装质粒psPAX2及pMD2.G。 针对6孔板每个孔， 三种 质粒DNA比率按2:1:1， 具体量如表9所示。 0077 表9三种质粒DNA具体量 0078 质粒 质量 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2 2 g psPAX2 1 g pMD2.G 1 g 0079 步骤S3： 转染后的细胞转移至37二氧化碳培养箱培养12h， 然后弃。

31、去培养基， 细 胞用PBS轻轻洗3次。 向每孔细胞中重新加入2mL完全培养基继续培养48h。 然后回收此时的 上清， 采用低速离心机2000转/min离心， 吸取上清液， 弃沉淀从而除去死细胞及细胞碎片。 此上清液采用0.45 m的滤器进行过滤一次。 然后将所有的过滤后的上清液进行4， 离心力 55200g超速离心2h， 缓慢吸弃上清(50mL 超离管底预留200 L左右液体不要吸， 以免造成病 毒损失)。 然后加入500 L冰上预冷的PBS重悬， 4放置过夜， 即得到浓缩的NOS2基因过表达 慢病毒。 如果需长期保持， 转移至-80冰箱。 0080 实验结果： 通过脂质体转染， 成功将pLV。

32、X-IRES-ZsGreen1-NOS2， psPAX2 和pMD2.G 三种质粒转运至293T细胞中。 由于pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2带绿色荧光蛋白标签， 因此， 如图8所示， 倒置显微镜下我们能观察到大部分293T细胞发绿色荧光， 说明成功实现NOS2慢 病毒包装。 0081 以下， 提供实验例2至实验例4， 以阐述NOS2慢病毒的实际作用。 0082 实验例2： NOS2慢病毒感染人源心肌细胞HCM 0083 实验过程： 取对数生长期的HCM细胞， 用胰蛋白酶消化细胞， 然后用细胞计数板进 行计数， 按细胞浓度1105个/孔接种于6孔细胞培养板中。 每孔加入2mL 完。

33、全培养基 (DEMEM-F12+10FBS+100U/mL青霉素+100ug/mL链霉素)， 转移至37二氧化碳培养箱继续 培养2天， 待倒置光学显微镜下观察细胞达到 60-80汇合度时准备NOS2慢病毒感染。 0084 吸弃培养基上清， PBS洗1遍。 吸取2mL完全培养基到5mL EP管中， 加入20 L 上述 NOS2慢病毒浓缩液， 充分混匀后， 将混合液加入到细胞中。 转移至37二氧化碳培养箱继续 培养2天。 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2带绿色荧光蛋白标签， 可倒置荧光显微镜下观察间接 观察NOS2过表达情况。 同时可以提取细胞mRNA 和总蛋白进行定量评估NOS2过。

34、表达水平。 进 而作为很好工具进一步研究NO和 NOS2对宿主细胞影响及作用机理。 0085 实验结果： 如图9所示， 回收的NOS2慢病毒浓缩液感染HCM细胞， 感染2 天后， 荧光 显微镜下观察到大部分HCM细胞发绿色荧光， 说明NOS2慢病毒可成功感染HCM。 0086 实验例3： 蛋白印迹检测 说明书 7/9 页 9 CN 109868280 A 9 0087 将上述感染NOS2慢病毒后的HCM， 吸掉上清， PBS洗1遍， 放置冰上操作， 加入细胞裂 解液(RIPA)裂解30分钟， 收集裂解液， 4冷冻离心(16000转/min, 15min)收集上清， BCA定 量试剂盒测定蛋白浓。

35、度后， -20冰箱保存。 跑胶前解冻后与溴酚兰(4:1)混混合， 加入 巯 基乙醇后煮沸制样。 各组分别用微量注射器取50 g蛋白样进行12十二烷基硫酸钠凝胶电 泳， 电泳后进行电转(按 “滤纸-PVDF膜-胶-滤纸” 的顺序叠好， 电流恒流180mA， 电压120V， 湿 转2.5h)， 将蛋白样转移到PDVF膜上。 然后用5脱脂奶粉对PDVF膜进行4封闭处理 1h， 接 着加入一抗： 兔多克隆iNOS抗体(1:500)和鼠单克隆 -Actin抗体(1:5000)， 4孵育过夜。 然后TBST洗5遍， 每次10min， 接着加入二抗： HRP标记羊抗兔 IgG和HRP标记羊抗鼠IgG抗体 (。

36、1:5000)室温孵育2h。 之后TBST洗5遍， 每次 10min， 加入ECL发光液后在蛋白荧光成像系统 下曝光并拍照。 0088 实验结果： 图11所示， 通过蛋白免疫印迹进行蛋白定量分析， 感染NOS2慢病毒的 HCM表达NOS2蛋白水平显著高于对照组未感染NOS2慢病毒。 从而说明， 本发明构建的NOS2基 因过表达慢病毒对宿主细胞HCM实现高效转染， 能特异性、 持续、 高效的促进NOS2基因在宿 主细胞中稳定表达。 0089 实验例4： 定量PCR(qPCR)检测 0090 利用Trizol(Invitrogen)提取各组细胞总的RNA， 并测定OD， 保证提取各组的RNA OD。

37、260/OD280值在1.8和2.1之间， 以保证其纯度。 然后总RNA利用逆转录试剂盒进行反转录成 cDNA， 反应体系和反应程序参照产品说明书。 cDNA用来做qPCR， 引物如表10所示： 0091 表10引物情况 0092 0093 0094 反应体系参考qPCR试剂盒说明书， 瞬离后上机,反应程序如表11所示： 0095 表11 PCR反应程序 0096 说明书 8/9 页 10 CN 109868280 A 10 0097 反应后根据Ct值统计分析， 绘制标准曲线， 使用基于Ct(2- Ct)方法进行定量分 析。 0098 实验结果： 如图10所示， 通过基因定量分析， 感染NOS。

38、2基因过表达慢病毒的HCM表 达NOS2基因表达水平显著高于对照组未感染NOS2慢病毒。 从而说明， 本发明构建的NOS2慢 病毒对宿主细胞HCM实现高效转染， 能特异性、 持续、 高效的促进NOS2基因在宿主细胞中稳 定表达。 0099 以上具体实施例仅仅是对本发明的解释， 其并不是对本发明的限制， 本领域技术 人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改， 但只要在 本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。 说明书 9/9 页 11 CN 109868280 A 11 温州医科大学附属第二医院、 温州医科大学附属育英儿童医院 一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、 相应。

39、基因载体及其制备方法和应用 2019101173636 2019-02-15 1 SIPOSequenceListing 1.0 1 3462 DNA 人源 1 atggcctgtc cttggaaatt tctgttcaag accaaattcc accagtatgc aatgaatggg 60 gaaaaagaca tcaacaacaa tgtggagaaa gccccctgtg ccacctccag tccagtgaca 120 caggatgacc ttcagtatca caacctcagc aagcagcaga atgagtcccc gcagcccctc 180 gtggagacgg。

40、 gaaagaagtc tccagaatct ctggtcaagc tggatgcaac cccattgtcc 240 tccccacggc atgtgaggat caaaaactgg ggcagcggga tgactttcca agacacactt 300 caccataagg ccaaagggat tttaacttgc aggtccaaat cttgcctggg gtccattatg 360 actcccaaaa gtttgaccag aggacccagg gacaagccta cccctccaga tgagcttcta 420 cctcaagcta tcgaatttgt caaccaat。

41、at tacggctcct tcaaagaggc aaaaatagag 480 gaacatctgg ccagggtgga agcggtaaca aaggagatag aaacaacagg aacctaccaa 540 ctgacgggag atgagctcat cttcgccacc aagcaggcct ggcgcaatgc cccacgctgc 600 attgggagga tccagtggtc caacctgcag gtcttcgatg cccgcagctg ttccactgcc 660 cgggaaatgt ttgaacacat ctgcagacac gtgcgttact ccacca。

42、acaa tggcaacatc 720 aggtcggcca tcaccgtgtt cccccagcgg agtgatggca agcacgactt ccgggtgtgg 780 aatgctcagc tcatccgcta tgctggctac cagatgccag atggcagcat cagaggggac 840 cctgccaacg tggaattcac tcagctgtgc atcgacctgg gctggaagcc caagtacggc 900 cgcttcgatg tggtccccct ggtcctgcag gccaatggcc gtgaccctga gctcttcgaa 960 。

43、atcccacctg accttgtgct tgaggtggcc atggaacatc ccaaatacga gtggtttcgg 1020 gaactggagc taaagtggta cgccctgcct gcagtggcca acatgctgct tgaggtgggc 1080 ggcctggagt tcccagggtg ccccttcaat ggctggtaca tgggcacaga gatcggagtc 1140 cgggacttct gtgacgtcca gcgctacaac atcctggagg aagtgggcag gagaatgggc 1200 ctggaaacgc acaag。

44、ctggc ctcgctctgg aaagaccagg ctgtcgttga gatcaacatt 1260 gctgtgctcc atagtttcca gaagcagaat gtgaccatca tggaccacca ctcggctgca 1320 gaatccttca tgaagtacat gcagaatgaa taccggtccc gtgggggctg cccggcagac 1380 tggatttggc tggtccctcc catgtctggg agcatcaccc ccgtgtttca ccaggagatg 1440 ctgaactacg tcctgtcccc tttctactac。

45、 tatcaggtag aggcctggaa aacccatgtc 1500 tggcaggacg agaagcggag acccaagaga agagagattc cattgaaagt cttggtcaaa 1560 gctgtgctct ttgcctgtat gctgatgcgc aagacaatgg cgtcccgagt cagagtcacc 1620 序列表 1/2 页 12 CN 109868280 A 12 atcctctttg cgacagagac aggaaaatca gaggcgctgg cctgggacct gggggcctta 1680 ttcagctgtg ccttca。

46、accc caaggttgtc tgcatggata agtacaggct gagctgcctg 1740 gaggaggaac ggctgctgtt ggtggtgacc agtacgtttg gcaatggaga ctgccctggc 1800 aatggagaga aactgaagaa atcgctcttc atgctgaaag agctcaacaa caaattcagg 1860 tacgctgtgt ttggcctcgg ctccagcatg taccctcggt tctgcgcctt tgctcatgac 1920 attgatcaga agctgtccca cctgggggcc 。

47、tctcagctca ccccgatggg agaaggggat 1980 gagctcagtg ggcaggagga cgccttccgc agctgggccg tgcaaacctt caaggcagcc 2040 tgtgagacgt ttgatgtccg aggcaaacag cacattcaga tccccaagct ctacacctcc 2100 aatgtgacct gggacccgca ccactacagg ctcgtgcagg actcacagcc tttggacctc 2160 agcaaagccc tcagcagcat gcatgccaag aacgtgttca ccatg。

48、aggct caaatctcgg 2220 cagaatctac aaagtccgac atccagccgt gccaccatcc tggtggaact ctcctgtgag 2280 gatggccaag gcctgaacta cctgccgggg gagcaccttg gggtttgccc aggcaaccag 2340 ccggccctgg tccaaggtat cctggagcga gtggtggatg gccccacacc ccaccagaca 2400 gtgcgcctgg aggccctgga tgagagtggc agctactggg tcagtgacaa gaggctgccc。

49、 2460 ccctgctcac tcagccaggc cctcacctac ttcctggaca tcaccacacc cccaacccag 2520 ctgctgctcc aaaagctggc ccaggtggcc acagaagagc ctgagagaca gaggctggag 2580 gccctgtgcc agccctcaga gtacagcaag tggaagttca ccaacagccc cacattcctg 2640 gaggtgctag aggagttccc gtccctgcgg gtgtctgctg gcttcctgct ttcccagctc 2700 cccattctga。

50、 agcccaggtt ctactccatc agctcctccc gggatcacac gcccacagag 2760 atccacctga ctgtggccgt ggtcacctac cacacccgag atggccaggg tcccctgcac 2820 cacggcgtct gcagcacatg gctcaacagc ctgaagcccc aagacccagt gccctgcttt 2880 gtgcggaatg ccagcggctt ccacctcccc gaggatccct cccatccttg catcctcatc 2940 gggcctggca caggcatcgc gccc。