测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法.pdf

《测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法.pdf（9页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910173951.1 (22)申请日 2019.03.08 (71)申请人 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 地址 250100 山东省济南市历城区桑园路8 号 (72)发明人 刘兴华骆永明章海波谢寅雨 朱荣生王怀中呼红梅黄保华 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 韩百翠 (51)Int.Cl. G01N 23/2208(2018.01) G01N 23/2258(2018.01) G01N 23/2202(2018.01) (54)。

2、发明名称 一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间 分布的方法 (57)摘要 本发明公开了一种测定土壤有机质吸附有 机污染物空间分布的方法。 该方法采用13C标记 的抗生素等有机污染物在土壤有机质上进行吸 附， 然后用NanoSIMS技术分析土壤有机质吸附有 机污染物的空间分布特征。 该方法不仅可以有效 地克服了区分土壤有机质和污染物中的碳分布 难题， 而且可以实现有机质二维空间分布特征的 直观展示， 还可以对三维空间分布进行测定。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 109916938 A 2019.06.21 CN 109916938 A 1.一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的。

3、方法， 其特征是， 包括以下步骤： 1)用13C标记有机污染物， 用土壤有机质吸附13C标记的有机污染物， 震荡吸附达到平衡 状态， 得到吸附13C标记的有机污染物的土壤有机质； 2)制作不添加13C标记有机污染物的土壤有机质作为空白对照； 3)将步骤1)和步骤2)中的土壤有机质， 冷冻成形； 4)将步骤3)中冷冻成形的土壤有机质制作切片， 然后进行TEM观察； 5)根据TEM观察结果选择目标有机质分布的位置， 记录目标物有机质的坐标点； 6)利用纳米离子探针NanoSIMS扫描步骤5)中的目标有机质， 根据目标物有机质的坐标 点定位扫描区域， 分别获得土壤有机质的NanoSIMS图片和吸附标。

4、记13C有机污染物的土壤有 机质图片， 吸附标记13C有机污染物的土壤有机质图片与未吸附的土壤有机质图片对比， 有 明显的13C富集， 则得到有机污染物在土壤有机质颗粒上表面的分布图。 2.如权利要求1所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其特征 是， 利用纳米离子探针NanoSIMS重复扫描步骤5)中的目标有机质， 每扫描一次， 有机质样片 表面的被侵蚀厚度为155nm， 重复至少8次， 制备100-500nm的厚度内的有机污染物的三维 空间分布图。 3.如权利要求2所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其特征 是， 所述有机质样片表面的被侵蚀厚度为15n。

5、m， 重复10次， 制备150nm的厚度内的有机污染 物的三维空间分布图。 4.如权利要求1-3中任意一项所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的 方法， 其特征是， 所述有机污染物为抗生素、 有机农药、 酚类、 合成洗涤剂和由城市污水、 污 泥及施肥带来的有害微生物中的任意一种。 5.如权利要求1-3中任意一项所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的 方法， 其特征是， 所述步骤1)用土壤有机质吸附13C标记的有机污染物的具体方法如下： 配制 NaCl溶液作为吸附实验的背景溶液， 用背景溶液配制13C标记的有机污染物的吸附液； 然后 用土壤有机质吸附吸附液中13C标记的有机污。

6、染物， 震荡吸附达到平衡状态。 6.如权利要求5所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其特征 是， 所述步骤2)为： 重复步骤1)的过程且吸附液为不添加步骤1)中13C标记有机污染物的背 景溶液。 7.如权利要求1-3中任意一项所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的 方法， 其特征是， 所述步骤3)的冷冻成形为： 将土壤有机质在-20冷冻成楔形。 8.如权利要求7所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其特征 是， 冷冻前将土壤有机质在铝箔纸中固定形状， 放入-20， 冷冻成楔形后剥去铝箔纸。 9.如权利要求1-3中任意一项所述的一种测定土壤有机质吸。

7、附有机污染物空间分布的 方法， 其特征是， 所述步骤4)的制作切片为： 在液氮环境中将冷冻成形的土壤有机质切成厚 度为500nm的切片。 10.如权利要求1或9所述的一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其 特征是， 所述步骤4)每切一片， 需用睫毛笔蘸取切片， 把切片转移到亲水性硅片上平铺， 然 后进行TEM观察。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109916938 A 2 一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种测定土壤有机质吸附有机污染物后， 有机污染物在土壤有机质上 的空间分布的方法。 背景技术 0002 土壤是农业生态系统物质和。

8、能量交换的载体， 是作物生长的物质基础和陆地生命 的基础。 土壤作为环境的重要组成部分， 不仅可以承接来自其他环境介质的污染， 同时也是 其他环境介质的污染源。 土壤一旦被污染， 将会严重威胁人类健康和环境安全。 因此， 对土 壤污染及机制的研究越来越多地引起了研究者的关注。 有机污染物是目前环境中普遍存在 的主要污染物之一， 主要包括抗生素、 有机农药、 酚类、 合成洗涤剂以及由城市污水、 污泥及 施肥带来的有害微生物等。 尽管很多种类的有机化学试剂现在已经禁用多年， 但由于其化 学性质稳定、 难降解或者降解后的次级产物对环境依旧有毒害作用， 这些污染物的残留和 污染仍然十分严重。 土壤有机。

9、质是土壤的重要组分， 其对有机污染物的吸附具有重要作用。 土壤有机质根据其稳定性差异可以分为活性有机质、 惰性有机质和稳定性有机质， 不同稳 定性的土壤有机质吸附的有机污染物对环境的毒害作用不同， 比如随着腐殖化程度的加 深， 活性较高、 稳定性较低的颗粒态有机质吸附的有机污染物可能会再次释放形成二次污 染等。 土壤有机质具有复杂的空间结构， 这些结构对土壤有机污染物的吸附固定机制不相 同， 抵抗土壤环境中的动植物活动的作用也不同， 比如进入到有机质闭蓄态孔隙中的污染 物较难被释放出来等。 因此， 明确土壤有机质吸附有机污染物的空间结构特征可以为土壤 有机污染物的污染效应和环境风险评估提供数据。

10、基础和科学依据。 0003 当前有研究者结合同步辐射光谱学， 采用能量堆栈的方法研究污染物在土壤中的 二维空间分布。 该方法实验条件控制要求苛刻， 很难得到较为理想的有机碳分布数据。 而且 利用该方法用于有机污染物在有机质上分布(污染物和有机质同时含有碳)的研究显得束 手无策。 发明内容 0004 为了解决当前研究的困境， 本发明提供了一种测定土壤有机质吸附有机污染物空 间分布的新方法。 该方法采用13C标记的抗生素等有机污染物在土壤有机质上进行吸附， 然 后用NanoSIMS技术分析土壤有机质吸附有机污染物的空间分布特征。 该方法不仅可以有效 地克服了区分土壤有机质和污染物中的碳分布难题， 。

11、而且可以实现有机质二维空间分布特 征的直观展示， 还可以对三维空间分布进行测定。 0005 本发明的技术方案是： 一种测定土壤有机质吸附有机污染物空间分布的方法， 其 特征是， 0006 1)用13C标记有机污染物， 用土壤有机质吸附13C标记的有机污染物， 震荡吸附达到 平衡状态， 得到吸附13C标记的有机污染物的土壤有机质； 0007 2)制作不添加13C标记有机污染物的土壤有机质作为空白对照； 说明书 1/4 页 3 CN 109916938 A 3 0008 3)将步骤1)和步骤2)中的土壤有机质， 冷冻成形； 0009 4)将步骤3)中冷冻成形的土壤有机质制作切片， 然后进行TEM观。

12、察； 0010 5)根据TEM观察结果选择目标有机质分布的位置， 记录目标物有机质的坐标点； 0011 6)利用纳米离子探针(NanoSIMS)扫描步骤5)中的目标有机质， 根据目标物有机质 的坐标点定位扫描区域， 分别获得土壤有机质的NanoSIMS图片和吸附标记13C有机污染物的 土壤有机质图片， 吸附标记13C有机污染物的土壤有机质图片与未吸附的土壤有机质图片对 比， 有明显的13C富集， 则得到有机污染物在土壤有机质颗粒上表面的分布图； 0012 7)利用纳米离子探针(NanoSIMS)重复扫描步骤5)中的目标有机质， 每扫描一次， 有机质样片表面的被侵蚀厚度为155nm， 重复至少8。

13、次， 制备100-500nm的厚度内的有机污 染物的三维空间分布图， 此厚度可根据实验需要自行调整。 0013 其中， 有机污染物为容易被土壤有机质吸附的物质， 如抗生素(如环丙沙星等)、 有 机农药、 酚类、 合成洗涤剂等， 还可以为由城市污水、 污泥及施肥带来的有害微生物等， 还包 括持久性有机污染物。 0014 优选的， 所述步骤1)用土壤有机质吸附13C标记的有机污染物的具体方法如下： 配 制NaCl溶液作为吸附实验的背景溶液， 用背景溶液配制13C标记的有机污染物的吸附液； 然 后用土壤有机质吸附吸附液中13C标记的有机污染物， 震荡吸附达到平衡状态。 0015 优选的， 所述步骤2。

14、)为： 重复步骤1)的过程且吸附液为不添加步骤1)中13C标记有 机污染物的背景溶液。 0016 其中， 步骤1)在吸附过程中， 可间隔不同的时间段取出一定量的吸附13C标记的有 机污染物的土壤有机质， 冷冻保存， 动态监测环丙沙星在土壤颗粒态有机质上的吸附过程。 0017 优选的， 所述步骤3)的冷冻成形为： 将土壤有机质在-20冷冻成楔形， 更优选的， 冷冻前将土壤有机质在铝箔纸中固定形状， 放入-20， 冷冻成形， 然后剥去铝箔纸。 0018 优选的， 所述步骤4)的制作切片为： 在液氮环境中用徕卡超薄冷冻切片机将冷冻 成形的土壤有机质切成厚度为500nm的切片。 0019 优选的， 所。

15、述步骤4)为防止切片结构损伤， 每切一片， 需用睫毛笔蘸取切片， 把切 片转移到亲水性硅片上平铺， 避免有机质发生 “卷曲” ， 硅片为载物片， 然后进行TEM观察。 0020 优选的， 所述步骤7)有机质样片表面的被侵蚀厚度为15nm， 重复10次， 制备150nm 的厚度内的有机污染物的三维空间分布图。 0021 NanoSIMS(Nano-scale secondary ion mass spectrometry)技术使用的是最新 的SIMS仪器， 该技术是在SIMS(Ion mass spectrometry， 离子探针质谱仪)和TOF-SIMS(飞 行时间质谱仪)的基础上发展起来的，。

16、 可用于模拟土壤和原位土壤溶液中微生物活动可视 化的技术手段。 可以同时分析7种离子类型， 具有较高的敏感性， 分辨率能达到50nm， 因此可 以准确定位碳氮稳定同位素的空间分布。 采用同位素标记污染物的技术也有效地克服了区 分有机质和污染物中的碳分布难题。 0022 同位素分馏特征可以用来示踪土壤微生物活动以及有机质迁移、 转化等反馈过 程， 目前较多应用在土壤有机质腐殖化过程、 团聚体的形成机制等研究中。 目前用同位素示 踪研究污染物分布， 多采用放射性同位素， 放射性同位素对实验条件要求苛刻， 需要配备专 门的放射性实验室由专门培训过的实验员才能完成， 因此不适合普通实验中需要的示踪研 。

17、究。 因此， 本发明采用稳定性同位素标记有机污染物， 然后用标记的污染物在土壤有机质中 说明书 2/4 页 4 CN 109916938 A 4 进行吸附实验， 可以有效的解决当前有机污染物在有机质中分布特征研究中的困难。 0023 目前国内外做切片多使用石蜡、 树脂等包埋剂， 用包埋剂固定成型后才能切割成 片， 但是这些包埋剂中均含有有机质(碳)， 与本发明中土壤有机质和有机污染物中的碳无 法区分， 因此不适用。 为了研究有机质切片， 国外有研究者提出用硫和铟箔做包埋剂， 需高 温加热至硫粉熔化， 然后将有机质放入高温熔融态硫中， 由于部分土壤有机污染物高温易 降解(比如抗生素超过40即可降。

18、解)。 另外， 铟箔固定有机质时需要将有机质压入铟箔中， 压的过程会破坏有机质原始自然的空间结构， 综上所述， 目前国内外制作切片的方法均不 适用于本发明。 0024 鉴于此， 本发明人进行了如下改进： 0025 1、 本发明提出用水做包埋剂， 冷冻使有机质成型， 既不会破坏有机质的空间结构， 也不会引入其他有机质的干扰。 0026 2、 常规包埋剂做的切片在水中用铜网捞起即可上机分析， 有机质切片遇水融化， 且吸附的有机污染物可能会被稀释解吸， 影响后续测定结果。 故发明人设计了睫毛笔(即用 一根睫毛制作成的睫毛笔)来转移土壤有机质切片， 用睫毛笔转移切片脱离了水的影响， 而 且不会对切片造。

19、成损伤。 0027 3、 由于切片厚度只有500nm， 室温下很容易干燥， 造成有机质切片发生 “卷曲” 现 象， 无法将平整的切片转移至硅片， 因此本发明采用整个切片和转移过程在液氮环境中(低 温保证有机质切片成型)， 同时对硅片进行亲水处理(因为常规硅片上放置有机质切片， 由 于NanoSIMS实验分析前需要对样品进行干燥， 而且实验过程样品室是真空状态， 有机质切 片干燥后抽真空时容易从硅片上脱落， 对硅片进行亲水处理后， 有机质切片被冰包被， 室温 下冰溶解的过程可以使有机质很好的贴服在硅片上， 即使抽真空也不会脱落。 0028 本发明的有益效果是： 本发明的方法不仅可以有效地克服了区。

20、分土壤有机质和污 染物中的碳分布难题， 而且可以实现有机质二维空间分布特征的直观展示， 还可以对三维 空间分布进行测定， 从而为探究土壤有机质吸附有机污染物的空间分布特征提供了直接快 捷的方法， 为探讨环境中有机污染物在土壤中的危害奠定了方法基础。 附图说明 0029 图1为土壤颗粒态有机质在光学电子显微镜下的切片分布图， 图片中黑色和深棕 色的颗粒为土壤颗粒态有机质； 0030 图2为未吸附的土壤颗粒态有机质， 利用纳米离子探针技术扫描13C的NanoSIMS图； 0031 图3为吸附标记13C环丙沙星的土壤颗粒态有机质， 利用纳米离子探针技术扫描13C 的NanoSIMS图， 图中深色区域。

21、为13C标记富集区域， 橙红色富集最多； 0032 图4为吸附标记13C环丙沙星的土壤颗粒态有机质， 利用纳米离子探针技术扫描13C 的三维空间分布图。 0033 图5为铝箔纸制成的楔形方舟结构示意图， 即长方形的一端为45度斜面。 具体实施方式 0034 实施例1： 0035 1)准确配制0.01mol/L的NaCl溶液作为吸附实验的背景溶液， 取一定体积的背景 说明书 3/4 页 5 CN 109916938 A 5 溶液配制13C标记环丙沙星的浓度为40mg/kg的吸附液。 准确称取0.100g土壤颗粒态有机质 于聚四氟乙烯离心管中， 固液比为1： 10， 用土壤颗粒态有机质(活性较高)。

22、吸附13C标记的环 丙沙星， 25条件下， 震荡24h， 吸附即可达到平衡状态， 在24h之内， 可设置12次不同的取样 时间， 动态监测环丙沙星在土壤颗粒态有机质上的吸附过程， 设置取样时间分别为吸附时 间为2min、 5min、 10min、 15min、 20min、 30min、 1h、 2h、 4h、 6h、 10h、 24h的时候， 冷冻保存取样 的土壤颗粒态有机质样品； 0036 13C标记的环丙沙星购自剑桥同位素实验室(Cambridge Isotope Laboratories, Inc)； 环丙沙星的标记参数： min.99atom13C； 0037 2)做土壤颗粒态有机质。

23、空白对照， 即重复步骤1)的过程且吸附剂为不添加步骤1) 中13C标记环丙沙星的背景溶液； 0038 3)将步骤1)和步骤2)中取出的土壤颗粒态有机质样品， 分别放入铝箔纸制成的楔 形方舟(如图5)中， 固定形状， 放入-20， 冷冻成形， 然后剥去铝箔纸， 此过程无需添加其他 包埋剂， 用水做包埋剂， 低温冷冻成冰， 在低温环境中操作切片制作过程即可； 0039 4)将步骤3)中楔形的土壤颗粒态有机质制作切片， 在液氮环境中用徕卡超薄冷冻 切片机将土壤有机质切成厚度为500nm的切片， 由于土壤颗粒态有机质颗粒非常小且质地 松软， 为防止切片结构损伤， 每切一片， 需用睫毛笔蘸取切片， 把切。

24、片转移到对角线长度为 10mm的正方形(或直径为10mm的圆形)亲水性硅片上平铺， 避免有机质发生 “卷曲” ， 硅片为 载物片， 该过程在显微镜下进行， 切片制作过程中应该避免有机质样品颗粒成簇或重叠在 一起， 然后进行TEM观察， 结果如图1所示； 0040 5)将TEM观察结果选择目标有机质分布的位置， 记录目标物的坐标点； 0041 6)将样品转移至纳米离子探针仪器进样室， 样品室抽真空， 对样品进行干燥， 利用 纳米离子探针(NanoSIMS)分析仪扫描步骤5)中的目标有机质， 根据坐标点定位扫描区域， 分别获得土壤有机质的NanoSIMS图片(图2)和吸附标记13C环丙沙星的土壤有。

25、机质图片(图 3)， 吸附标记13C环丙沙星的土壤颗粒态有机质图片与未吸附的土壤颗粒态有机质对比， 有 明显的13C富集(颜色变深了， 富集13C越多， 越偏橙红色)， 则得到环丙沙星在土壤颗粒态有 机质颗粒上表面的分布图； 0042 纳米离子探针分析实验在中科院地质与地球物理研究所纳米离子探针实验室完 成。 实验初始离子源为Cs+离子， 初始离子激发能为6kev， 初始电子束为1.23.8pA， 二次离 子引出压为8kev， 横向分辨率为100200nm， 侵蚀厚度为15nm， 扫描样品覆盖范围为2020 m2。 实验过程中初始离子束电流保持恒定。 0043 NanoSIMS的电子枪可以持续。

26、产生电子束补偿电流。 所有的检测结果均以图像模式 给出， 离子图像的保留时间是15ms/像素， 二级离子图像是256256像素。 0044 7)利用纳米离子探针(NanoSIMS)重复扫描步骤5)中的目标有机质， 每扫描一次， 有机质样片表面的被侵蚀厚度为15nm， 重复10次， 即可得到150nm的厚度内的有机污染物的 三维空间分布图(如图4)。 0045 实施例2： 0046 步骤7)利用纳米离子探针(NanoSIMS)重复扫描步骤5)中的目标有机质， 每扫描一 次， 有机质样片表面的被侵蚀厚度为15nm， 重复20次， 即可得到300nm的厚度内的有机污染 物的三维空间分布图。 说明书 4/4 页 6 CN 109916938 A 6 图1 图2 说明书附图 1/3 页 7 CN 109916938 A 7 图3 图4 说明书附图 2/3 页 8 CN 109916938 A 8 图5 说明书附图 3/3 页 9 CN 109916938 A 9 。