利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910266772.2 (22)申请日 2019.04.03 (71)申请人 山东理工大学 地址 255049 山东省淄博市张店区新村西 路266号 (72)发明人 蒋伶活 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 林娟 (51)Int.Cl. C12N 1/19(2006.01) C12N 15/31(2006.01) C12P 7/06(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一种利用调控细胞周。

2、期转录因子提高发酵 乙醇产率的方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用调控细胞周期转录 因子提高发酵乙醇产率的方法， 属于生物能源技 术开发技术领域。 本发明通过敲除调控细胞周期 的转录因子基因MBP1， SWI4或者SWI6， 为提高乙 醇发酵的生产效率提供了新的方法， 本发明构建 的高产乙醇的优良酿酒酵母工程菌株， 经过52小 时发酵， 相比于野生型菌株(WT)， 酒精发酵产率， 提高了27.351.0。 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 CN 109913381 A 2019.06.21 CN 109913381 A 1.一种提高酿酒酵母乙醇发酵得率的方法， 其特征在于， 敲除调控细。

3、胞周期的转录因 子基因MBP1， SWI4或者SWI6。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述基因MBP1的核苷酸序列如NCBI编号 为:NM_001180115.1所示。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述基因SWI4的核苷酸序列如NCBI编号 为:NM_001179001.1所示。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述基因SWI6的核苷酸序列如NCBI编号 为:NM_001182069.1所示。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述酿酒酵母是MBP1缺失的酿酒酵母， 购 自Invotrogen公司， 编号为Sc04106576_s1。

4、； 所述酿酒酵母是SWI6缺失的酿酒酵母， 购自 Invotrogen公司， 编号为Sc04147446_s1； 所述酿酒酵母是SWI4缺失的酿酒酵母， 购自 Invotrogen公司， 编号为Sc04118768_s1。 6.一种生产乙醇的方法， 其特征在于， 将缺失MBP1、 SWI6或SWI4的菌株接种于发酵培养 基中发酵3660h。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 发酵前810h在160220rpm培养， 之后静 置培养。 8.根据权利要求6或7所述的方法， 其特征在于， 用于发酵的培养基成分按g/L计， 含有： 葡萄糖80120， 硫酸铵68， 磷酸二氢钾24， 七水硫。

5、酸镁0.51， 酵母提取物0.10.3， 组氨酸0.010.03， 尿嘧啶0.010.03， 亮氨酸0.050.15。 9.根据权利要求68任一所述的方法， 其特征在于， 发酵前将菌株在YPD培养基中活 化。 10.核苷酸序列如NCBI编号为:NM_001180115.1、 NM_001179001.1、 NM_001182069.1所 示的基因MBP1， SWI4和SWI6在提高酿酒酵母菌的乙醇发酵生产效率方面的作用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109913381 A 2 一种利用调控细胞周期转录因子提高发酵乙醇产率的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用调控细胞周期转录因子提。

6、高发酵乙醇产率的方法， 属于生物 能源技术开发技术领域。 背景技术 0002 酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是目前燃料乙醇生产工艺中主要的发 酵微生物。 国内外利用玉米淀粉作为原料， 通过酿酒酵母菌发酵生产燃料乙醇的技术已经 非常成熟。 自然筛选和诱变育种是传统的酿酒酵母菌种选育手段， 但是通过它们提高菌株 的乙醇发酵产量， 已经基本到了极限。 近年来， 随着基因工程技术的快速发展， 为提高酿酒 酵母菌株的乙醇发酵水平提供了可能。 通过转录因子基因的改造， 可以同时改变受它调控 的许多靶标基因的表达水平， 从而获得来自多个基因改变造成的性状改变， 有可能获得潜 。

7、在的高产乙醇性状， 这是通过单个基因的改变所不能达到的。 0003 Mbp1是一种DNA结合蛋白(转录因子)， 与Swi6形成MBF复合物， 构成Mlu1细胞周期 盒结合因子。 MBF是在细胞周期的G1/S转变过程中调节基因表达的序列特异性转录因子。 被 MBF调控的基因涉及DNA合成和DNA修复以及G1周期蛋白基因。 此外， 转录因子Swi4页可以与 Swi6形成类似的SBF复合物， 构成Swi4/6细胞周期盒结合因子。 全基因组分析已经发现MBF 和SBF复合物有100多个共同的靶标基因。 然而， MBF和SBF复合物基因对于提高乙醇产率的 功能尚未见报道。 发明内容 0004 本发明通过。

8、功能基因组学技术筛选， 发现3个调控细胞周期的转录因子基因MBP1， SWI4或者SWI6的缺失， 能够提高酿酒酵母菌发酵的乙醇得率。 0005 本发明的第一个目的是提供一种提高酿酒酵母乙醇发酵得率的方法， 所述方法是 敲除调控细胞周期的转录因子基因MBP1， SWI4或者SWI6。 0006 在本发明的一种实施方式中， 所述基因MBP1的核苷酸序列如NCBI编号为:NM_ 001180115.1所示。 0007 在本发明的一种实施方式中， 所述基因SWI4的核苷酸序列如NCBI编号为:NM_ 001179001.1所示。 0008 在本发明的一种实施方式中， 所述基因SWI6的核苷酸序列如N。

9、CBI编号为:NM_ 001182069.1所示。 0009 在本发明的一种实施方式中， 所述酿酒酵母是MBP1缺失的酿酒酵母， 购自 Invotrogen公司， 编号为Sc04106576_s1。 0010 在本发明的一种实施方式中， 所述酿酒酵母是SWI6缺失的酿酒酵母， 购自 Invotrogen公司， 编号为Sc04147446_s1。 0011 在本发明的一种实施方式中， 所述酿酒酵母是SWI4缺失的酿酒酵母， 购自 Invotrogen公司， 编号为Sc04118768_s1。 说明书 1/3 页 3 CN 109913381 A 3 0012 本发明的第二个目的是提供一种生产乙醇。

10、的方法， 所述方法将缺失MBP1、 SWI6或 SWI4的菌株在发酵培养基中发酵3660h。 0013 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵的前810h在160220rpm培养， 之后静置 培养。 0014 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基成分按g/L计， 含有： 葡萄糖100， 硫 酸铵7.5， 磷酸二氢钾3.5， 七水硫酸镁0.75， 酵母提取物0.2， 组氨酸0.02， 尿嘧啶0.02， 亮氨 酸0.1。 0015 在本发明的一种实施方式中， 发酵前将菌株在YPD培养基中活化。 0016 本发明还要求保护调控细胞周期的转录因子基因MBP1， SWI4和SWI6在提高酿酒酵 母菌。

11、的乙醇发酵生产效率方面的作用。 0017 有益效果： 本发明为提高乙醇发酵的生产效率提供了新的方法， 本发明构建的高 产乙醇的优良酿酒酵母工程菌株， 经过52小时发酵， 相比于野生型菌株(WT)， 酒精发酵产 率， 提高了27.351.0。 附图说明 0018 图1为三个调控细胞周期的转录因子基因MBP1， SWI4或者SWI6的缺失菌株和野生 型酿酒酵母菌株(WT)在发酵培养基中培养32小时(32h)和52小时(52h)后的产率(乙醇产 量/菌体干重比)。 *号表示每个基因缺失菌株和野生型菌株分别在32小时和52小时时间点 的比较存在显著性差异。 具体实施方式 0019 种子培养基按m/v计。

12、， 含葡萄糖2， 酵母提取物1， 蛋白胨2， 去离子水容， pH7.0。 发酵培养基中各种成分的含量(g/L)为： 葡萄糖100， 硫酸铵7.5， 磷酸二氢钾3.5， 七 水硫酸镁0.75， 酵母提取物0.2， 组氨酸0.02， 尿嘧啶0.02， 亮氨酸0.1， pH7.0。 两种培养基均 通过高压灭菌(115， 20min)。 0020 乙醇含量的测定方法： 用高效液相色谱仪(HPLC)检测发酵液中乙醇的含量， 利用 示差折光检测器进行检测。 所用色谱柱是BIO-RAD有机酸柱， 柱温为35， 流动相是 0.0275(v/v)稀硫酸， 流速为0.6mL/min。 每个样品进样量为20 L， 。

13、检测时间是25min。 0021 乙醇对菌体得率按如下的公式计算： 0022式中y为乙醇产率， p为乙醇浓度， x为OD值。 0023 实施例1酿酒酵母菌的乙醇发酵 0024 在YPD平板上划线活化实验菌株， 30培养2天。 每个菌株取一个单菌落接种30mL 的YPD液体培养基， 30， 220r/min摇床培养16小时以上至饱和。 按10的比例把种子菌液 接种到100mL的发酵培养基中， 30， 220r/min进行摇床培养8小时， 然后转为静置培养发 酵。 0025 在接种后32小时和52小时两个发酵时间点， 取1mL的菌体发酵液， 测定菌体干重。 另外取1mL的菌体发酵液， 12000r。

14、pm离心5分钟， 上清液取出用于液相测定其中的乙醇浓度。 收集数据， 并作出菌体干重、 乙醇产量、 乙醇产率图， 如图1所示。 经过52小时发酵， 相比于野 说明书 2/3 页 4 CN 109913381 A 4 生型菌株(WT)， SWI4、 SWI6和MBP1三个单基因缺失酿酒酵母菌株的酒精发酵产率， 分别提高 了51.0、 36.4和27.3。 0026 对比例1： 0027 DOT6缺失的酿酒酵母购自Invotrogen公司， 编号为Sc04118417_s1。 0028 按照实施例1相同的方法对敲除DOT6基因的酿酒酵母缺失菌进行培养、 发酵。 结果 显示和野生型菌株(WT)相比， 它的酒精发酵产率没有显著变化(图1)。 0029 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 3/3 页 5 CN 109913381 A 5 图1 说明书附图 1/1 页 6 CN 109913381 A 6 。