数字PCR检测装置与检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910165741.8 (22)申请日 2019.03.05 (71)申请人 东南大学 地址 211102 江苏省南京市江宁区东南大 学路2号 (72)发明人 赵祥伟葛芹玉朱纪军 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 代理人 柏尚春 (51)Int.Cl. C12M 1/34(2006.01) C12M 1/00(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) G06K 9/00(2006.01) (54)发明名称 一种数字PC。

2、R检测装置与检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种数字PCR检测装置与检测 方法， 所述检测装置包括检测腔、 图像传感器、 PCB板和耦合器； 检测腔位于图像传感器的表面； 图像传感器和PCB板相连， 检测腔上有分别用于 数字PCR微液滴导入和导出的入口和出口。 所述 检测方法具体为： 将数字PCR体系封装成为微液 滴阵列， 进行扩增反应； 反应完成后， 将微液滴阵 列注入检测腔； 待微液滴充满检测腔并成单层排 列的时候， 激发光源通过耦合器导入平面波导 板， 发出的荧光通过滤色片， 被图像传感器收集 成像； 在平面波导板上方对照明； 计算机比对分 析两次图像， 得到模板DNA的数量。 本发。

3、明采用无 透镜成像设计， 检测装置的体积大大缩小， 方便 室外或者便携式应用。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 109929747 A 2019.06.25 CN 109929747 A 1.一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 包括检测腔(1)、 图像传感器(2)、 PCB板(3)和耦 合器(9)； 所述检测腔(1)位于图像传感器(2)的表面； 所述图像传感器(2)和PCB板(3)相连， 所述检测腔(1)上有入口(6)和出口(7)， 所述检测腔(1)的上表面为平面波导板(4)， 下表面 为滤色片(5)， 内部有PCR扩增产物的微液滴(8)； 所述耦合器(9)用于将激发光源导入平。

4、面 波导板(4)中。 2.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述微液滴(8)的粒径在 2200微米。 3.根据权利要求1或2所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述微液滴(8)在检 测腔(1)内呈单层排列。 4.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述PCB板(3)与计算机 相连， 所述PCB板(3)包含ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块。 5.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述平面波导板(4)为透 明玻璃板或者聚合物板。 6.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述图像传。

5、感器(2)为 CCD或者CMOS图像传感器(2)。 7.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述图像传感器(2)的像 素尺寸小于微液滴(8)粒径的一半。 8.根据权利要求1所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述检测腔(1)的下表面 为超薄玻璃片或者聚合物片， 所述检测腔(1)的下表面与表面含有滤色片(5)的图像传感器 贴合。 9.根据权利要求1或8所述的一种数字PCR检测装置， 其特征在于： 所述滤色片(5)的数 量为一个或多个。 10.一种如权利要求19任一所述的数字PCR检测装置的检测方法， 其特征在于包含以 下步骤： (a)用微流控液滴发生器将数字PC。

6、R体系封装成为2200微米的微液滴(8)阵列， 然后 在PCR检测装置内进行扩增反应； (b)反应完成后， 通过检测腔(1)的入口(6)将微液滴(8)阵列注入检测腔(1)， 保持检测 腔(1)的出口(7)与空气联通， 以维持检测腔(1)内的压力平衡； (c)待微液滴(8)充满检测腔(1)并成微液滴(8)阵列的时候， 激发光源通过耦合器(9) 导入平面波导板(4)， 发出的荧光通过滤色片(5)， 被图像传感器(2)收集成像； (d)在平面波导板(4)上方直接对微液滴(8)阵列进行照明， 使微液滴(8)在图像传感器 (2)的表面成像； (e)计算机把通过数据采集PCB板(3)采集的两次图像进行比对。

7、分析， 计算得到模板DNA 的数量。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109929747 A 2 一种数字PCR检测装置与检测方法 技术领域 0001 本发明涉及聚合酶链反应检测， 具体为一种数字PCR检测装置与检测方法。 背景技术 0002 数字PCR(digital PCR， dPCR)是将一个样本分成几十到几万份， 分配到不同的反 应单元， 每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)， 在每个反应单元中分别对目 标分子进行PCR扩增， 扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。 与定量PCR 不同的是， 数字PCR不依赖于CT值， 因此不受扩增效率影响， 扩增结束后通过。

8、直接计数或泊 松分布公式来计算样品的原始浓度或者含量。 由于数字PCR能够将误差控制在5以内， 因 此， 可以不需要对照标准样品和标准曲线来实现绝对定量分析。 数字PCR的提出至今虽然只 有20年时间， 但是由于其独特的技术优势和应用前景， 使得其产业化发展相当迅速。 迄今为 止， 基于分液方式的不同， 数字PCR技术主要有三类： 微反应室/孔板、 大规模集成微流控芯 片和液滴数字PCR系统。 分别通过微孔板、 微流体芯片或微液滴实现分液， 分隔开的每个微 小区域都可进行单独的PCR反应。 已有包括Thermo、 Fluidigm和Bio-Rad等几家公司相继推 出了数字PCR产品， 并已经应。

9、用于基因拷贝数变异、 感染检测、 基因测序、 基因突变检测等研 究领域。 0003 PCR的定量检测依靠空的微液滴或者微反应室占比来实现， 因此尽可能的提高分 液数量可以降低采样误差和分液误差， 从而提高检测精度， 但是提高分液数量对检测设备 造成了一定的困难。 现有的PCR检测装置一般依赖图像检测， 也有液滴数字PCR系统利用流 式细胞仪进行检测的方式。 在成像检测中， 传统的成像光学通过透镜进行成像， 加上还需要 荧光成像， 所以不可以避免的要使用滤色片和二向色镜组成的滤色块， 以及镜头和CCD/ CMOS。 这导致检测装置的体积较大， 且成像范围有限， 一般需要对数字PCR芯片进行扫描或。

10、 者多次成像拼接， 成像速度和成本较高。 采用流式细胞仪对液滴进行一个一个计数的话的 检测成本仍然很高。 并且仪器体积一般较大， 这对实验室空间要求较高， 也不适合野外、 即 时检测等便携式或者小型化应用需求。 。 发明内容 0004 发明目的： 为了克服现有技术中存在的不足， 本发明目的是提供一种基于图像传 感器的无透镜小型化的数字PCR检测装置， 本发明的另一目的是提供一种成本低、 无需透 镜、 检测面积大的数字PCR检测装置的检测方法。 0005 技术方案： 本发明所述的一种数字PCR检测装置， 包括检测腔、 图像传感器、 PCB板 和耦合器； 检测腔位于图像传感器的表面； 图像传感器和。

11、PCB板相连， 检测腔上有分别用于 数字PCR微液滴导入和导出的入口和出口， 出口在微液滴导入过程中开口于空气， 以保持检 测腔内的气压平衡， 检测腔的上表面为平面波导板， 下表面为滤色片， 内部有PCR扩增产物 的微液滴； 耦合器用于将激发光源导入平面波导板中。 0006 微液滴的粒径在2200微米。 微液滴在检测腔内呈单层排列。 微液滴可以在反应 说明书 1/4 页 3 CN 109929747 A 3 完毕后利用注射器通过入口导入检测腔， 也可以经由与入口连接的管道通过出口的负压吸 入检测腔。 0007 PCB板与计算机相连， PCB板包含ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块， P。

12、CB板用于 收集图像传感器的信号。 0008 平面波导板为高折射率的透明玻璃板或者聚合物板。 0009 图像传感器为CCD或者CMOS图像传感器。 图像传感器的像素尺寸小于微液滴粒径 的一半， 以利于提高成像分辨率。 0010 检测腔的下表面为超薄玻璃片或者聚合物片， 检测腔的下表面与表面含有滤色片 的图像传感器贴合。 滤色片的数量为一个或多个， 分别用于一种荧光染料或者多种荧光染 料的检测。 0011 上述数字PCR检测装置的检测方法， 包含以下步骤： 0012 a、 用微流控液滴发生器将数字PCR体系封装成为2200微米的微液滴阵列， 然后 在PCR检测装置内进行扩增反应； 0013 b、。

13、 反应完成后， 通过检测腔的入口将微液滴阵列注入检测腔， 保持检测腔的出口 与空气联通， 以维持检测腔内的压力平衡； 0014 c、 待微液滴充满检测腔并成微液滴阵列的时候， 激发光源通过耦合器导入平面波 导板， 发出的荧光通过滤色片， 被图像传感器收集成像， 激发光为LED光源、 激光光源或汞灯 光源； 0015 d、 在平面波导板上方直接对微液滴阵列进行照明， 使微液滴在图像传感器的表面 成像； 0016 e、 计算机把通过数据采集PCB板采集的两次图像进行比对分析， 计算得到模板DNA 的数量。 0017 工作原理： 激发光通过耦合器进入平面波导板内， 包含有PCR反应产物的微液滴与 平。

14、面波导板接触， 当微液滴大小大于或者等于检测腔腔体高度的时候， 波导板内激发光的 消逝波将会进入微液滴内部， 从而激发反应产物的荧光分子发出荧光。 由于发光的微液滴 与图像传感器的距离非常近， 在微米级别， 同时微液滴的表面为弯曲表面， 具有光聚焦功 能， 因此发光液滴可以在图像传感器表面直接形成一个亮点。 当微液滴与检测腔上表面不 接触的时候， 激发光可以垂直穿过平面波导片直接激发微液滴内的荧光分子发出荧光， 由 于微液滴具有透镜的作用， 所以可以直接在图像传感器表面形成图像。 通过以上两种方式， 检测腔内的微液滴可以被成像在图像传感器上。 0018 有益效果： 本发明和现有技术相比， 具有。

15、如下显著性特点： 0019 1、 采用无透镜成像设计， 因此检测装置的体积大大缩小， 可以做成便携式装置， 方 便室外或者便携式应用； 0020 2、 空间带宽积可以不受传统透镜成像的限制， 能够成大面高分辨率的图像， 对于 数字PCR微米尺寸的微液滴进行大面积成像， 大大降低了传统透镜的扫描成像成本； 0021 3、 采用大靶面图像传感器， 可以对几百万甚至几千万和上亿的微液滴进行成像分 析， 高的分液数量可以降低采样误差和分液误差， 从而进一步提高检测精度。 说明书 2/4 页 4 CN 109929747 A 4 附图说明 0022 图1是本发明实施例1的主视图； 0023 图2是本发明。

16、实施例1的俯视图； 0024 图3是本发明实施例2的主视图。 具体实施方式 0025 实施例1 0026 如图12， 检测腔1的腔高度为15微米， 检测腔1上有入口6和出口7， 检测腔1的上 表面， 即平面波导板4为高折射率的透明玻璃板， 下表面为滤色片5， 厚度为1微米。 滤色片5 贴合于图像传感器2的表面， 图像传感器2为1.2英寸黑白CMOS， 像素数为2048(H)x2048(V)， 像素尺寸6.5x6.5( m)。 用于收集图像传感器2信号的PCB板3与计算机相连， PCB板3包含 ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块。 0027 采用微流控液滴发生器将含有SYBR Green。

17、 I荧光探针的常规数字PCR体系封装成 为15微米的微液滴8阵列， 然后在PCR仪内进行扩增反应。 反应完成后， 通过检测腔1入口6将 微液滴8阵列注入检测腔1， 保持检测腔1的出口7与空气联通， 以维持检测腔1内的压力平 衡。 待微液滴8充满检测腔1并成单层排列的时候， 采用波长为497nm的LED激发光源， 通过耦 合器9导入平面波导板4， 由于平面波导板4与微液滴8接触， 所以激发光的消逝场会耦合进 入微液滴8， 激发微液滴8内的荧光染料， 发出的荧光通过510nm的一个带通滤色片5， 被CMOS 图像传感器2收集成像。 然后， 通过1.2英寸白光LED面板在平面波导板4上方直接对微液滴。

18、8 阵列进行照明， 使微液滴8在CMOS图像传感器2的表面成像。 计算机把通过数据采集PCB板3 采集的两次图像进行比对分析， 得到无荧光空白液滴所占总液滴数目的比例从而计算得到 模板DNA的数量。 0028 实施例2 0029 如图3， 检测腔1的腔高度为8微米， 检测腔1上有入口6和出口7， 检测腔1的上表面， 即平面波导板4为高折射率的聚合物板， 下表面为聚合物板， 厚度为1微米。 检测腔1的下表 面与表面含有滤色片5的图像传感器2贴合。 图像传感器2为2/3英寸黑白CCD， 像素数为2580 (H)1944(V)， 像素尺寸3.4x3.4( m)。 用于收集图像传感器2信号的PCB板3。

19、与计算机相连， PCB板3包含ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块。 0030 采用微流控液滴发生器将含有SYBR Green I荧光探针的常规数字PCR体系封装成 为8微米的微液滴8阵列， 然后在PCR仪内进行扩增反应。 反应完成后， 通过检测腔1入口6将 微液滴8阵列注入检测腔1， 保持检测腔1的出口7与空气联通， 以维持检测腔1内的压力平 衡。 待微液滴8充满检测腔1并成单层排列的时候， 采用波长为497nm的2/3英寸LED面板作为 激发光源， 激发微液滴阵列中的SYBR Green I荧光染料， 其发出的荧光通过510nm的带通滤 色片5， 被CMOS图像传感器2收集成像。 然。

20、后， 通过白光2/3英寸的LED面板在平面波导板4上 方直接对微液滴8阵列进行照明， 使微液滴8在CMOS图像传感器2的表面成像。 计算机把通过 数据采集PCB板3采集的两次图像进行比对分析， 得到无荧光空白液滴所占总液滴数目的比 例从而计算得到模板DNA的数量。 0031 实施例3 0032 检测腔1的腔高度为2微米， 检测腔1上有入口6和出口7， 检测腔1的上表面， 即平面 说明书 3/4 页 5 CN 109929747 A 5 波导板4为高折射率的透明玻璃板， 下表面为滤色片5， 厚度为1微米。 滤色片5贴合于图像传 感器2的表面， 图像传感器2为1.2英寸黑白CMOS， 像素数为20。

21、48(H)x2048(V)， 像素尺寸 6.5x6.5( m)。 用于收集图像传感器2信号的PCB板3与计算机相连， PCB板3包含ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块。 0033 采用微流控液滴发生器将含有SYBR Green I荧光探针的常规数字PCR体系封装成 为2微米的微液滴8阵列， 然后在PCR仪内进行扩增反应。 反应完成后， 通过检测腔1入口6将 微液滴8阵列注入检测腔1， 保持检测腔1的出口7与空气联通， 以维持检测腔1内的压力平 衡。 待微液滴8充满检测腔1并成单层排列的时候， 采用汞灯光源为激发光源， 通过耦合器9 导入平面波导板4， 由于平面波导板4与微液滴8接触， 。

22、所以激发光的消逝场会耦合进入微液 滴8， 激发微液滴8内的荧光染料， 发出的荧光通过510nm的一个带通滤色片5， 被CMOS图像传 感器2收集成像。 然后， 通过1.2英寸白光LED面板在平面波导板4上方直接对微液滴8阵列进 行照明， 使微液滴8在CMOS图像传感器2的表面成像。 计算机把通过数据采集PCB板3采集的 两次图像进行比对分析， 得到无荧光空白液滴所占总液滴数目的比例从而计算得到模板 DNA的数量。 0034 实施例4 0035 检测腔1的腔高度为200微米， 检测腔1上有入口6和出口7， 检测腔1的上表面， 即平 面波导板4为高折射率的聚合物板， 下表面为超薄玻璃片， 厚度为1。

23、微米。 检测腔1的下表面 与表面含有滤色片5的图像传感器2贴合。 图像传感器2为2/3英寸黑白CCD， 像素数为2580 (H)1944(V)， 像素尺寸3.4x3.4( m)。 用于收集图像传感器2信号的PCB板3与计算机相连， PCB板3包含ADDA模块、 FPGA模块和电压控制模块。 0036 采用微流控液滴发生器将含有SYBR Green I荧光探针的常规数字PCR体系封装成 为200微米的微液滴8阵列， 然后在PCR仪内进行扩增反应。 反应完成后， 通过检测腔1入口6 将微液滴8阵列注入检测腔1， 保持检测腔1的出口7与空气联通， 以维持检测腔1内的压力平 衡。 待微液滴8充满检测腔1并成单层排列的时候， 采用激光光源作为激发光源， 激发微液滴 阵列中的SYBR Green I荧光染料， 其发出的荧光通过510nm的带通滤色片5， 被CMOS图像传 感器2收集成像。 然后， 通过白光2/3英寸的LED面板在平面波导板4上方直接对微液滴8阵列 进行照明， 使微液滴8在CMOS图像传感器2的表面成像。 计算机把通过数据采集PCB板3采集 的两次图像进行比对分析， 得到无荧光空白液滴所占总液滴数目的比例从而计算得到模板 DNA的数量。 说明书 4/4 页 6 CN 109929747 A 6 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 7 CN 109929747 A 7 。