从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910139339.2 (22)申请日 2019.02.25 (71)申请人 湖南农业大学 地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1 号 (72)发明人 黎娟郑重谊黎鹏刘智炫 周清明 (74)专利代理机构 长沙和雅知识产权代理事务 所(普通合伙) 43238 代理人 林传贵 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法 (57)摘要 本申请公开了一种从水稻种子中筛选降镉 菌的筛选方法。 包括以下步。

2、骤： 表面消毒： 筛选颗 粒饱满的水稻种子， 先用有效氯含量为1的 NaCLO漂洗， 漂洗后收集种子， 再用无菌水清洗； 分离纯化： 在培养基中培养内生细菌， 采用30 恒温培养箱培养， 不定期观察出菌情况； 挑选不 同外观形态的单菌落， 进行保存； 鉴定： 对所有分 离出来的种子内生菌进行生物学特性分析： 产铁 载体功能定性检测、 分泌IAA功能检测、 溶磷功能 检测、 固氮功能和耐Cd性检测； 同时对其进行分 子生物学鉴定； 筛选： 通过对所有菌株的生物学 特性检测的结果， 选择其中综合生理功能优势的 菌株作为优势菌进行保存。 本方法能够从水稻种 子中全面地筛选出降镉菌。 权利要求书1页 。

3、说明书4页 附图1页 CN 109943500 A 2019.06.28 CN 109943500 A 1.一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 表面消毒： 筛选颗粒饱满的水稻种子， 先用有效氯含量为1的NaCLO漂洗10分钟， 漂洗 后收集种子， 再用无菌水清洗5次， 每次1分钟； 种子研磨： 根据研磨罐的容量， 加入适量的水稻种子， 研磨1-2分钟， 得到种子研磨液； 分离纯化： 将所述种子研磨液涂布在培养基中， 在所述培养基中培养水稻种子的内生 细菌， 采用30恒温培养箱培养， 不定期观察出菌情况； 挑选不同外观形态的单菌落， 进行 保存； 鉴定： 对所有。

4、分离出来的种子内生菌进行生物学特性分析： 产铁载体功能定性检测、 分 泌IAA功能检测、 溶磷功能检测、 固氮功能检测、 耐Cd性检测和降镉功能检测； 同时对其进行 分子生物学鉴定； 筛选： 通过对所有菌株的生物学特性检测的结果， 选择其中综合生理功能合格的具有 降镉功能的菌株作为优势菌进行保存。 2.根据权利要求1所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 所述 步骤分离纯化中， 采用R2A、 1/2LB和1/2PDA三种种培养基培养内生细菌， 将种子研磨液涂布 在R2A、 1/2LB和1/2PDA三种平板培养基上。 3.根据权利要求1所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方。

5、法， 其特征在于， 所述 步骤鉴定中， 所述产铁载体功能定性检测过程为： 将分离纯化后的种子内生细菌接种到具 有CAS检测液的检测平板上， 在28的培养箱中培养46个小时， 观察平板中菌落周围橙黄色 晕圈的形成和大小。 4.根据权利要求1所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 所述 步骤鉴定中， 所述分泌IAA功能检测过程为： 将分离纯化后的种子内生细菌接种于含有 100mg/L的L-色氨酸的液体培养基中， 在30和180r/min条件下进行摇床培养1天后， 取50 L菌悬液滴于白色陶瓷板上， 同时加入比色液， 将白色陶瓷板于室温避光放置30分钟后观 察， 颜色变红者为阳性。

6、， 表示能够分泌IAA。 5.根据权利要求1所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 所述 步骤鉴定中， 所述溶磷功能检测过程为： 将斜面菌种用0.8的生理盐水洗脱， 并且于40 活化48h后， 再把溶磷细菌稀释涂布于平板上， 40培养5d， 每天定时测量溶磷圈直径与菌 落直径， 计算两者比值， 初步定性该菌溶磷能力大小， 比值越大， 说明溶磷能力越强。 6.根据权利要求4所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 所述 步骤鉴定中， 所述分泌IAA功能检测过程中的比色液为体积50ml含有35的HCLO4的液体和 体积1ml含有0.5mol/L的FeCL3液体。

7、的混合液。 7.根据权利要求1所述的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 其特征在于， 所述 步骤鉴定中， 所述降镉功能检测过程为： 将降镉菌添加在水稻水培液中， 在水稻生长的过程 中观察并检测水稻的镉含量， 检测结果无镉含量， 判定为具有降镉功能的降镉菌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109943500 A 2 一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法 技术领域 0001 本申请涉及细菌筛选技术领域， 具体的说是一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选 方法。 背景技术 0002 水稻种子是内生细菌的重要载体， 水稻植株不同部位中的内生细菌大部分都是通 过种子遗传而来， 对于水稻的生命活动起到了。

8、重要作用。 相比于其他传统的微生物， 与水稻 植株有着先天性的紧密联系， 能够 “和谐联合” 的共生， 因此水稻种子是研究内生细菌抑制 水稻镉吸收能力的理想对象。 0003 其次， 分析水稻种子中具有潜在抑制水稻镉吸收能力的内生细菌多样性能够起到 有效指导作用， 有助于筛选出更加高效的功能菌株。 0004 最后， 之前关于水稻镉吸收能力的研究大多关注微生物的直接作用效果， 或是微 生物的使用方法。 但是由于微生物对环境条件敏感， 定殖能力差， 作用效果不稳定， 所以在 实际应用中不能很好的发挥效果。 外加微生物和水稻内生菌群落作为一个相互作用的体 系， 关于系统中微生物群落的变化却鲜有报道。 。

9、本研究将探究水稻内生细菌群落多样性和 组成的变化， 联系水稻镉吸收能力的变化， 揭示内生细菌的作用机制， 对于实际的农业应用 有着重要的指导意义。 0005 在细菌的筛选方法中， 根据细菌体积大小来离心分离细菌， 可以快速筛选出所需 细菌， 但很多细菌分离装置只有一个离心网， 离心网的孔径大小不变， 不能进行调节， 每个 细菌分离装置也只能筛选出同一种颗粒大小的细菌， 细菌分离装置不能对细菌进行多级分 离， 不能满足对多种大小不同细菌的分离的要求， 满足不了实验的需求， 不利于对细菌多样 化的实验研究。 0006 鉴于此， 本发明所述的一种降镉菌的筛选方法， 有用选择培养基对细菌进行筛选， 有。

10、通过细菌体积大小对细菌进行筛选， 用三种培养基对细菌进行筛选， 可以更加全面的保 留种子里面的内生菌， 采用多种标准进行鉴定， 保证了筛选的高精度。 发明内容 0007 本申请提供了一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 采用三种培养基进行降 镉菌筛选， 同时采用多种筛选指标进行鉴定， 提高了筛选精度， 同时能够保证筛选细菌的全 面性。 0008 本发明提供一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 包括以下步骤： 0009 表面消毒： 筛选颗粒饱满的水稻种子， 先用有效氯含量为1的NaCLO漂洗10分钟， 漂洗后收集种子， 再用无菌水清洗5次， 每次1分钟； 0010 种子研磨： 根据研磨罐的容。

11、量， 加入适量的水稻种子， 将研磨罐放入适配器中， 设 置参数， 启动研磨仪， 研磨1-2分钟； 0011 分离纯化： 将所述种子研磨液涂布在培养基中， 在培养基中培养内生细菌， 采用30 说明书 1/4 页 3 CN 109943500 A 3 恒温培养箱培养， 不定期观察出菌情况； 挑选不同外观形态的单菌落， 进行保存； 0012 鉴定： 对所有分离出来的种子内生菌进行生物学特性分析： 产铁载体功能定性检 测、 分泌IAA功能检测、 溶磷功能检测、 固氮功能、 耐Cd性检测和降镉功能检测； 同时对其进 行分子生物学鉴定； 0013 筛选： 通过对所有菌株的生物学特性检测的结果， 选择其中综。

12、合生理功能合格的 具有降镉功能的菌株作为优势菌进行保存。 0014 进一步地， 所述步骤分离纯化中， 采用R2A、 1/2LB和1/2PDA三种种培养基培养内生 细菌， 将种子研磨液涂布在R2A、 1/2LB和1/2PDA三种平板培养基上。 0015 进一步地， 所述步骤鉴定中， 所述产铁载体功能定性检测过程为： 将分离纯化后的 种子内生细菌接种到具有CAS检测液的检测平板上， 在28的培养箱中培养46个小时， 观察 平板中菌落周围橙黄色晕圈的形成和大小。 0016 进一步地， 所述步骤鉴定中， 所述分泌IAA功能检测过程为： 将分离纯化后的种子 内生细菌接种于含有100mg/L的L-色氨酸的。

13、液体培养基中， 在30和180r/min条件下进行 摇床培养1天后， 取50 L菌悬液滴于白色陶瓷板上， 同时加入比色液， 将白色陶瓷板于室温 避光放置30分钟后观察， 颜色变红者为阳性， 表示能够分泌IAA。 0017 进一步地， 所述步骤鉴定中， 所述溶磷功能检测过程为： 将斜面菌种用0.8的生 理盐水洗脱， 并且于40活化48h后， 再把溶磷细菌稀释涂布于平板上， 40培养5d， 每天定 时测量溶磷圈直径与菌落直径， 计算两者比值， 初步定性该菌溶磷能力大小， 比值越大， 说 明溶磷能力越强。 0018 进一步地， 所述步骤鉴定中， 所述比色液为体积50ml含有35的HCLO4的液体和体。

14、 积1ml含有0.5mol/L的FeCL3液体的混合液。 0019 进一步地， 所述降镉功能检测过程为： 将降镉菌添加在水稻水培液中， 在水稻生长 的过程中观察并检测水稻的镉含量， 检测结果无镉含量， 判定为具有降镉功能的降镉菌。 0020 本发明的有益效果在于： (1)采用三种培养基可以更全面的保留种子的内生菌； (2)本发明方法中通过添加三种培养基为下层平板， 使得透明圈清晰可见， 方便测量； (3)在 本发明方法设计的鉴定方法中采用多种功能性的鉴定， 提高了筛选优生菌的准确程度； 降 镉菌筛选平板法测得的透明圈大小相关性较好， 筛选结果准确度高。 0021 应当理解的是， 以上的一般描述。

15、和后文的细节描述仅是示例性的， 并不能限制本 申请。 附图说明 0022 图1为本申请实施例所提供的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法流程图； 0023 此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分， 并与说明书一起用于解释 本申请的原理。 具体实施方式 0024 下面通过具体的实施例并结合附图对本申请做进一步的详细描述。 0025 如图1所示， 本发明提供一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 包括以下步 骤： 说明书 2/4 页 4 CN 109943500 A 4 0026 表面消毒： 筛选颗粒饱满的水稻种子， 先用有效氯含量为1的NaCLO漂洗10分钟， 漂洗后收集种子， 再用无菌。

16、水清洗5次， 每次1分钟； 0027 种子研磨： 根据研磨罐的容量， 加入适量的水稻种子， 将研磨罐放入适配器中， 设 置参数， 启动研磨仪， 研磨1-2分钟； 0028 分离纯化： 将所述种子研磨液涂布在培养基中， 在培养基中培养内生细菌， 采用30 恒温培养箱培养， 不定期观察出菌情况； 挑选不同外观形态的单菌落， 进行保存； 0029 鉴定： 对所有分离出来的种子内生菌进行生物学特性分析： 产铁载体功能定性检 测、 分泌IAA功能检测、 溶磷功能检测、 固氮功能、 耐Cd性检测以及降镉功能检测； 同时对其 进行分子生物学鉴定； 0030 筛选： 通过对所有菌株的生物学特性检测的结果， 选。

17、择其中综合生理功能优势的 菌株作为优势菌进行保存。 0031 从水稻种子中筛选出具有降镉功能的内生菌的具体步骤为： 首先筛选颗粒饱满的 水稻种子进行表面消毒， 先用有效氯含量为1的NaCLO漂洗10分钟， 漂洗后收集种子， 再用 无菌水清洗5次， 每次1分钟； 将消毒后的水稻种子进行研磨： 根据研磨罐的容量， 加入适量 的水稻种子， 将研磨罐放入适配器中， 设置参数， 启动研磨仪， 研磨1-2分钟； 0032 分离纯化： 将种子研磨液涂布在R2A、 1/2LB和1/2PDA三种平板培养基中培养内生 细菌， 采用30恒温培养箱培养， 不定期观察出菌情况； 挑选不同外观形态的单菌落， 进行 保存。。

18、 0033 鉴定： 对所有分离出来的水稻种子内生菌进行生物学特性分析： 包括产铁载体功 能定性检测、 分泌IAA功能检测、 溶磷功能检测、 固氮功能、 耐Cd性检测和降镉功能检测； 同 时对其进行分子生物学鉴定； 0034 产铁载体功能定性检测过程为： 将分离纯化后的种子内生细菌接种到具有CAS检 测液的检测平板上， 在28的培养箱中培养46个小时， 观察平板中菌落周围橙黄色晕圈的 形成和大小。 黄色晕圈说明菌株具有产铁载体的能力， 黄色晕圈与菌落圈大小的比值越大， 说明其产铁载体能力越强。 选择具有黄色晕圈的菌株作为合格的具有产铁载体的水稻种子 内生菌的菌株。 0035 将筛选合格的具有产铁。

19、载体的水稻种子内生菌进行分泌IAA功能检测， 检测过程 为： 将分离纯化后的种子内生细菌接种于含有100mg/L的L-色氨酸的液体培养基中， 在30 和180r/min条件下进行摇床培养1天后， 取50 L菌悬液滴于白色陶瓷板上， 同时加入比色 液， 比色液为体积50ml含有35的HCLO4的液体和体积1ml含有0.5mol/L的FeCL3液体的混合 液， 然后将白色陶瓷板于室温避光放置30分钟后观察， 颜色变红者为阳性， 表示能够分泌 IAA。 阳性的颜色为粉紫色， 与阳性对照， 为粉紫色的作为合格的具有分泌IAA功能的菌株。 0036 进一步将合格的具有分泌IAA功能的水稻种子内生菌进行溶。

20、磷功能检测， 检测过 程为： 将斜面菌种用0.8的生理盐水洗脱， 并且于40活化48h后， 再把溶磷细菌稀释涂布 于平板上， 40培养5d， 每天定时测量溶磷圈直径与菌落直径， 计算两者比值， 初步定性该 菌溶磷能力大小， 比值越大， 说明溶磷能力越强。 选择具有透明晕圈的菌株作为合格的具有 溶磷能力的菌株。 0037 最后将合格的具有溶磷能力的水稻种子内生菌进行降镉功能检测， 检测过程为： 将降镉菌添加在水稻水培液中， 在水稻生长的过程中观察并检测水稻的镉含量， 检测结果 说明书 3/4 页 5 CN 109943500 A 5 无镉含量， 判定为合格的具有降镉功能的降镉菌。 0038 通过。

21、对所有菌株的生物学特性检测的结果， 选择其中综合生理功能合格的水稻种 子内生菌作为合格的降镉菌进行保存。 0039 本申请所提供的一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法， 与现有技术相比， 用 三种培养基对细菌进行筛选， 可以更加全面的保留种子里面的具有降镉功能的内生菌， 采 用产铁载体能力、 分泌IAA能力、 溶磷能力以及降镉能力等多种标准进行检测鉴定， 保证了 筛选的高精度。 0040 以上所述仅为本申请的优选实施例而已， 并不用于限制本申请， 对于本领域的技 术人员来说， 本申请可以有各种更改和变化。 凡在本申请的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本申请的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 109943500 A 6 图1 说明书附图 1/1 页 7 CN 109943500 A 7 。