过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其制备方法和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910213199.9 (22)申请日 2019.03.20 (71)申请人 南京师范大学 地址 210024 江苏省南京市鼓楼区宁海路 122号 (72)发明人 钱勇邵晨雯胡炯圣刘红科 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 代理人 孙斌 (51)Int.Cl. C07F 5/02(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种。

2、过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其 制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种过氧亚硝酸盐近红外荧 光探针ONP及其制备方法和应用， 该近红外荧光 探针ONP， 由硼酸酯结合亚甲蓝骨架获得， 其结构 如结构式I所示： 本发明的近红外荧光探针ONP， 可以有效地示踪 KA诱导的癫痫疾病中的内源性ONOO-信号， 该探 针ONP能够在体外和体内有效且选择性地成像 ONOO-， 可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向 脑部特征， 利用该探针的特性， 首次在体内和体 外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO-的上 调。 此外， 本发明首次公开了通过将高内涵分析 与ONP相结合， 可以筛选抗癫痫。

3、抑制剂， 这将为研 究生物系统中的ONOO-和筛选抗癫痫药物提供一 种简单有效的产品和方法。 权利要求书2页 说明书9页 附图10页 CN 109942609 A 2019.06.28 CN 109942609 A 1.一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP， 其特征在于， 由硼酸酯结合亚甲蓝骨 架获得， 其结构如结构式I所示： 2.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法， 其特征 在于， 包括如下步骤： 在惰性气体保护下， 在容器中加入亚甲基蓝、 DCM和水， 搅拌均匀， 将Na2S2O4和NaHCO3缓 慢加入到上述混合液中， 然后将混合物搅拌； 萃取水层。

4、， 分离有机层； 合并有机相， 干燥； 在 惰性气体保护下， 将干燥的有机相快速倒入含有三乙胺的容器中， 将含有三光气的DCM缓慢 加入到反应混合物中搅拌， 加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌后， 蒸发除去溶剂得到 粗产物， 纯化重结晶后得到产物， 为黄色固体即近红外荧光探针ONP； 其反应式如下所示： 3.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述将Na2S2O4和NaHCO3缓慢加入到上 述混合液中， 然后将混合物搅拌直至水相变为黄色。 4.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙 胺搅拌过夜后蒸发除去溶剂得到粗产物。 5.根据权利要求2所。

5、述的制备方法， 其特征在于， 所述纯化重结晶后得到产物为粗产物 优选用乙酸乙酯萃取并用水洗涤， 通过快速柱色谱纯化粗产物， 并从乙腈中重结晶， 得到产 物， 为黄色固体。 6.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选针对过氧亚 硝酸盐的诱导物和抑制剂中的应用。 7.根据权利要求6所示的应用， 其特征在于， 所述应用包括近红外荧光探针ONP在活细 胞中可视化示踪过氧亚硝酸盐的动态变化。 8.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选抗癫痫抑制 剂中的应用。 9.根据权利要求8所示的应用， 其特征在于， 所述应用包括近红外荧光探针ONP可以对 权利要求。

6、书 1/2 页 2 CN 109942609 A 2 活体癫痫小鼠内源性过氧亚硝酸盐水平变化进行成像。 10.一种权利要求1所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在制备筛选抗癫痫 抑制剂的成像剂中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109942609 A 3 一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物化学技术领域， 涉及一种过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP及其 制备方法和应用， 尤其是针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的设计合成及其在癫痫 中的示踪成像。 背景技术 0002 癫痫是一种慢性神经退行性疾病， 其特征是反复发作和不可。

7、预测的惊厥， 影响全 世界约0.7的人。 尽管过去二十年来抗癫痫药物越来越多， 但超过30的患者在医学上难 以治疗或对其没有有效反应。 现有的开发用于抗癫痫的这些药物仅提供基本的对症治疗， 尚未成功解决药物抗性问题和预防癫痫以及治疗癫痫发生后的持续状态。 越来越多的证据 表明， 癫痫与氧化应激密切相关， 并且氧化应激介导的神经疾病中的许多神经病理过程可 以在癫痫疾病的大脑中清楚地观察到氧/氮物种(ROS/RNS)水平的显着增加。 从这个意义上 讲， 氧化应激因素， 如反应性ROS/RNS， 应该被考虑到进一步的抗癫痫治疗策略的研究中。 因 此， 更好地理解生物体内癫痫的动态神经化学过程将有利于。

8、早期诊断和预防以及寻找新的 治疗方法。 0003 癫痫发作引起的脑损伤是一个复杂的动态过程， 与兴奋性毒性引起的线粒体功能 障碍， 细胞因子水平改变和氧化应激有关。 在癫痫的发生和发展过程中， 由于ROS的增加和 抗氧化防御能力下降， 不断产生大量的ROS， 特别是在病理条件下， 过量的ROS进一步与一氧 化氮(NO)反应生成活性氮物质(RNS)， 如过氧亚硝酸盐(ONOO-)。 随后， 这些产生的ROS/RNS 可以通过与许多生物大分子(包括蛋白质， 核酸和脂质)反应诱导氧化应激的积累， 这可以 进一步导致神经元细胞死亡。 作为活性氮物种的代表， 过氧亚硝酸盐(ONOO-)被认为是一种 重要。

9、的神经毒性因子， 在癫痫和其他神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用。 实际上， 在包括癫痫， 阿尔茨海默氏症， 帕金森病在内的多种临床疾病的进展中发现了过表达的反 应性ONOO-。 过度表达的ONOO-一直确定是这些疾病的标志性特征， 可以作为早期预测癫痫的 潜在生物标志物。 然而， ONOO-在癫痫发生和发生过度的机制中的潜在生物学作用还尚未完 全清晰。 因此， 为了探索体内ONOO-的病理生理机制并研究其在癫痫中的作用， 开发用于监 测脑中ONOO-的有效成像工具是至关重要的。 0004 在研究生物体系中的生物物种时， 荧光成像与基于反应的传感探针相结合， 因其 高灵敏度， 高选择性， 。

10、实时性和非侵入性而备受关注。 虽然已经报道了许多荧光探针用于细 胞或组织的ONOO-成像， 但仍然缺乏用于脑中ONOO-测定的体内成像方法， 包括癫痫疾病状态 下的脑成像。 此外， 可用于构建筛选平台以快速筛选抗癫痫药的成像探针也不足。 为了实现 这些目的， 存在若干挑战： (1)开发探针的主要挑战是探针是否能够有效地穿过血脑屏障 (BBB)以实现脑区域的成像； (2)具有近红外激发和发射的探针优利于获得更深的组织穿 透， 更少的光损伤和更少的背景荧光干扰； (3)在真实生理环境中有效监测ONOO-需要高选 择性和灵敏度的探针。 说明书 1/9 页 4 CN 109942609 A 4 发明内。

11、容 0005 发明目的： 针对现有技术存在的问题， 本发明提供一种针对过氧亚硝酸盐近红外 荧光探针ONP， 该近红外荧光探针ONP能够在体外和体内有效且选择性地成像ONOO-， 可以有 效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征， 可以有效地示踪KA诱导的癫痫疾病中的内源 性ONOO-信号， 首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO-的上调。 另外， 将高 内涵分析与ONP相结合， 可以为研究生物系统中的ONOO-和筛选抗癫痫药物提供一种高通量 筛选方法， 简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。 0006 本发明提供一种针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP的制备方法和应用。 即本 发。

12、明的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP可以简单高效的示踪KA诱导的癫痫疾病中的 内源性ONOO-信号， 同时亦可以应用在高通量筛选抗癫痫抑制剂中。 0007 技术方案： 为了实现上述目的， 如本发明所述一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧 光探针ONP， 由硼酸酯结合亚甲蓝骨架获得， 其结构如结构式I所示： 0008 0009 结构式I的中文名为4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)苄基3, 7-双(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪-10-羧酸酯。 0010 本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法， 包括如下步 骤： 0011 在惰性气体保护下， 在。

13、容器中加入亚甲基蓝、 DCM和水， 搅拌均匀， 将Na2S2O4和 NaHCO3缓慢加入到上述混合液中， 然后将混合物搅拌； 萃取水层， 分离有机层； 合并有机相， 干燥； 在惰性气体保护下， 将干燥的有机相快速倒入含有三乙胺的容器中， 将含有三光气的 DCM缓慢加入到反应混合物中搅拌， 加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌后， 蒸发除去溶 剂得到粗产物， 纯化重结晶后得到产物， 为黄色固体即近红外荧光探针ONP； 0012 其反应式如下所示： 0013 0014 其中， 所述将Na2S2O4和NaHCO3缓慢加入到上述混合液中， 然后将混合物搅拌直至 水相变为黄色。 说明书 2/9 页 5 。

14、CN 109942609 A 5 0015 其中， 所述加入4-羟基甲基苯基硼酸和三乙胺搅拌过夜后蒸发除去溶剂得到粗产 物。 0016 其中， 所述纯化重结晶后得到产物为粗产物用乙酸乙酯萃取并用水洗涤， 通过快 速柱色谱纯化粗产物， 并从乙腈中重结晶， 得到产物， 为黄色固体。 0017 本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选针对过氧亚硝酸盐 的诱导物和抑制剂中的应用。 0018 其中， 所述应用包括近红外荧光探针ONP在活细胞中可视化示踪过氧亚硝酸盐的 动态变化。 0019 本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在筛选抗癫痫抑制剂中的 应用。 0020 其中， 。

15、所述应用包括近红外荧光探针ONP可以对活体癫痫小鼠内源性过氧亚硝酸 盐水平变化进行成像。 0021 本发明所述的针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP在制备筛选抗癫痫抑制剂 的成像剂中的应用。 0022 荧光探针ONP的设计原理： 为了监测体内ONOO-活性， 选择合适的荧光团是成功设 计理想荧光探针的关键组成部分， 以用于复杂的生物学背景。 亚甲基蓝(MB)具有优异的药 代动力学和光物理特性被我们所关注。 它已被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于临床 治疗， 包括抗抑郁药， 解毒剂， 抗疟药和高铁血红蛋白血症治疗等。 此外， MB已被用作体内成 像研究的理想成像剂， 因为它具有在NIR区。

16、域(640nm)的吸收和发射， 可显着降低自发荧光 的干扰。 特别是， 将MB还原为无色亚甲蓝(LMB)会破坏MB荧光团骨架中的 -共轭， 从而完全 消除吸收和荧光。 因此本发明设计基于破坏MB支架可构建用于感测特定分析物ONOO-的红 色荧光的探针， 硼酸酯(用作ONOO-的选择性响应部分)被结合在还原的MB支架中得到了最 终的荧光探针ONP。 由于荧光团的 -共轭体系的阻断， 这种游离探针将表现出非常弱的吸收 和发射。 当ONP被ONOO-攻击时， 硼酸酯部分将很容易被去除， 并且新形成相应的LMB， 其将被 进一步氧化成MB， 导致在NIR成像窗口(690nm)中恢复强荧光， 这对于体内。

17、深部组织成像至 关重要(图1A)。 探针结合ONOO-前后显著变化可用于细胞内ONOO-微弱变化的监测， 并可为全 脑的NIR荧光成像提供动态信息。 0023 本发明开发了一种新的近红外(NIR)荧光探针， 可以有效地示踪KA(红藻氨酸)诱 导的癫痫疾病中的内源性ONOO-信号， 该探针ONP基于亚甲蓝的近红外荧光团设计， 能够在 体外和体内有效且选择性地成像ONOO-。 特别是， 它可以有效地穿过血脑屏障(BBB)具有靶 向脑部特征。 利用该探针的特性， 首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO- 的上调， ONP可以成为一种为成像剂， 特异性的识别ONOO-后， ONP结构中。

18、的硼酸酯被释放， 最 终氧化成亚甲蓝， 恢复荧光， 通过成像(荧光的强弱)来筛选抑制剂。 此外， 本发明首次公开 了通过将高内涵分析与ONP相结合， 构建了抗癫痫抑制剂的高通量筛选方法， 这将为研究生 物系统中的ONOO-和筛选抗癫痫药物提供一种简单有效的方法。 0024 有益效果： 与现有技术相比， 本发明具有如下优点： 0025 本发明制备的针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP对ONOO-具有特别专一的选 择性， 检测限达到94nM， 灵敏度高， 荧光强度和ONOO-浓度线性关系极佳， 反应迅速， 在15分 钟反应完全， 有助于快速监测ONOO-的存在及浓度， 生理pH下稳定性非常好， 另。

19、外ONP探针本 说明书 3/9 页 6 CN 109942609 A 6 身只有非常弱的吸收和发射， 识别到ONOO-时生成MB， 在近红外成像窗口(690nm)中恢复强 荧光， 可显着降低生物体本身自发荧光的干扰， 光损伤较少， 并且对于体内深部组织成像至 关重要， 最后探针可以通过血脑屏障(BBB)具有靶向脑部特征。 0026 本发明针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP的制备合成方法， 合成路线新颖， 简 单易行， 成本较低， 原料利用率高适合于工业化生产； 本发明制备的针对过氧亚硝酸盐近红 外荧光探针ONP可以有效地检测细胞内外源的ONOO-的存在， 示踪KA诱导的癫痫疾病中的内 源性O。

20、NOO-信号， 首次在体内和体外直接观察到在KA诱导的癫痫期间ONOO-的上调。 本发明的 针对过氧亚硝酸盐近红外荧光探针ONP可以应用在在制备筛选抗癫痫抑制剂的成像剂中， 另外， 将高内涵分析与ONP相结合， 可以为研究生物系统中的ONOO-和筛选抗癫痫药物提供 一种高通量筛选产品和方法， 简单有效筛选出抗癫痫药物的抑制剂。 附图说明 0027 图1A为本发明所列ONP对ONOO-响应机制， ONP与ONOO-结合促进了MB的形成示意图； 0028 图1B为本发明所列ONP与ONOO-响应前后的紫外吸收光谱图； 0029 图1C为本发明所列ONP与ONOO-响应前后的激发和发射光谱图， MB。

21、为标准参照； 0030 图1D为本发明所列ONP与ONOO-相应不同时间的HPLC分析示意图； 0031 图1E为本发明所列ONP与不同浓度ONOO-响应后的HPLC分析示意图； 0032 图2为本发明所列ONP与ONOO-在不同的PH下响应前后荧光光谱强度变化示意图； 0033 图3A为本发明所列ONP与ONOO-响应不同时间的荧光光谱强度变化示意图； 0034 图3B为本发明所列ONP与不同浓度ONOO-响应后的荧光光谱强度变化示意图； 0035 图3C为本发明所列ONP与ONOO-及其他小分子化合物响应后的荧光光谱强度变化 示意图； 0036 图4为本发明所列ONP与不同ONOO-浓度(。

22、0-4 M)之间的荧光发射强度的线性相关 性示意图； 0037 图5为本发明所列ONP与ONOO-响应不同时间的紫外吸收光谱图； 0038 图6A为本发明所列ONP与不同浓度的ONOO-孵育15分钟可见光下拍摄的照片； 0039 图6B为本发明所列ONP与各种ROS下孵育15分钟可见光下拍摄的照片； 0040 图6C为本发明所列含有ONP的测试条与各种ROS处理15分钟可见光下拍摄的照片； 0041 图7A为本发明所列ONP在活SH-SY5Y人成神经细胞中与内外源刺激下ONOO-含量动 态变化的成像研究示意图； 0042 图7B为图7A的定量分析数据示意图； 0043 图7C为本发明所列ONP。

23、在活SH-SY5Y人成神经细胞中与内源刺激下ONOO-含量变化 的成像研究示意图； 0044 图7D为图7C的定量分析数据示意图； 0045 图8为本发明所列ONP与商用染料共定位的研究示意图； 0046 图9A为本发明所列ONP与不同天然产物处理活细胞后利用高通量快速筛选出促进 ONOO-形成的潜在诱导剂的成像研究示意图； 0047 图9B为图9A的定量分析数据示意图； 0048 图9C为本发明所列ONP与不同多酚类天然产物处理活细胞后利用高通量快速筛选 说明书 4/9 页 7 CN 109942609 A 7 出减少ONOO-形成的潜在抑制剂的成像研究示意图； 0049 图9D为图9C的定。

24、量分析数据示意图； 0050 图10A为本发明所列ONP对活小鼠的脑中ONOO-的动态变化成像研究示意图； 0051 图10B为本发明所列ONP对离体小鼠的脑部ONOO-的成像研究示意图； 0052 图10C为图10B的定量分析数据示意图； 0053 图11A为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠癫痫期间ONOO-的含量变化的成像研究示 意图； 0054 图11B为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠癫痫期间ONOO-的含量变化的定量分析数 据折线图； 0055 图11C为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部的ONOO-的成像研究示意图； 0056 图11D为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑。

25、部冰冻切片的ONOO-的成像研究示 意图； 0057 图11E为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部的ONOO-的含量定量分析数据示 意图； 0058 图11F为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部冰冻切片的ONOO-的含量定量分 析数据示意图； 0059 图12A为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片的 ONOO-的成像研究示意图； 0060 图12B为本发明所列ONP对KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片的 ONOO-的含量荧光强度的定量分析数据示意图； 0061 图12C为本KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片HE染色的活细胞含 量。

26、的定量分析数据示意图； 0062 图12D为KA诱导的小鼠离体脑部海马最大横截面的石蜡切片HE染色的成像研究示 意图； 0063 图13为本发明实施例1制备的ONP的氢谱图； 0064 图14为本发明实施例1制备的ONP的碳谱图。 具体实施方式 0065 下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。 0066 实施例1 0067 一种针对过氧亚硝酸盐的近红外荧光探针ONP的制备方法， 其制备过程如下： 0068 0069 在氩气保护下， 在50mL圆底烧瓶中加入亚甲基蓝(374mg， 1mmol)， 10mLDCM和10mL 说明书 5/9 页 8 CN 109942609 A 8 水， 。

27、搅拌均匀。 将Na2S2O4(525mg， 1.5mmol)和NaHCO3(168mg， 2mmol)缓慢加入到上述混合液 中。 然后将混合物搅拌20分钟直至水相变为黄色。 水层用二氯甲烷(25mL)萃取水相， 分离 有机层。 合并有机相， 用无水硫酸钠干燥。 在氩气保护下， 将干燥的有机相快速倒入含有三 乙胺(TEA， 170 L， 1.2mmol)的圆底烧瓶中。 将含有三光气(TPG， 120mg， 0.32mmol)的1mL DCM 缓慢加入到反应混合物中。 滴加完成后， 将反应物在室温下再搅拌0.5小时。 向溶液中加入 4-羟基甲基苯基硼酸(234mg， 1.0mmol)和三乙胺(14。

28、0 L， 1.0mmol)， 搅拌过夜后， 蒸发溶剂， 粗产物用乙酸乙酯(320mL)萃取并用水洗涤。 通过快速柱色谱(硅胶/氯仿-乙酸乙酯)纯 化粗产物， 并从乙腈中重结晶， 得到产物， 为黄色固体(53.8mg， 10)。 0070 1H NMR(400MHz,DMSO-d6) 7.91(d,J9.3Hz,2H),7.68(d,J7.8Hz,2H),7.56 7.42(m,4H),7.38(d,J7.8Hz,2H),5.16(s,2H),3.36(s,12H),1.29(s,12H).(图13)； 13C NMR(101MHz,DMSO-d6) 154.28,139.29,138.26,1。

29、35.41,135.04,133.96,127.68,119.49, 107.25,84.20,69.08,41.54,25.13.ESI-MScalculated for C30H37BN3O4S+M+H+,546.5； found,546.3(图14). 0071 实施例2 0072 ONP的合成及初步评价 0073 实施例1制备的近红外荧光探针ONP的最终结构通过1H和13C NMR光谱和质谱完全 确认。 然后， 在PBS缓冲液(pH7.4， 5MeCN)中进行了初步的体外试验。 单独的ONP表现出非 常弱的紫外吸收和荧光， 因为MB(亚甲基蓝)的荧光被锁定在被打断的LMB形式中(图1B。

30、和 C)， 然而， 它提供了显着的NIR激发(640nm)和发射(650-850nm， 最大值为692nm)。 相对应的， 将ONP(10 M， PBS缓冲液(pH7.4， 5MeCN)与ONOO-(100 M， 水溶液)在37温育30分钟后， 观察到分别在665nm和692nm处有显著的吸收和荧光强度的增加。 为了研究ONP对不同pH条 件的稳定性和可靠性， 测量了在不同pH值范围(3-11)的PBS缓冲液中的荧光变化。 发现ONP 在生理条件下相当稳定， 并且表现出相对较宽的pH应用范围。 这对于最小化外部干扰和提 高测定的保真度很重要(次)。 为了进一步阐述其反应机制， 将ONP(10 。

31、M)与ONOO-在PBS缓冲 液中孵育， 并通过HPLC分析监测反应产物， 如图1D中所示， 在ONP(10 M)与ONOO-(10 M)温育 后， 在与对照MB相同的保留时间处， 随着孵育时间的增加， 可以清楚地观察到产物峰的增 加， 伴随着逐渐减少消耗的ONP峰。 在逐渐增加ONOO-浓度处理后， 观察到类似的趋势， 并且 最终反应混合物的Ex/Em光谱与MB的一致， 进一步证实反应产物是MB， 并且通过与ONOO-反 应确实促进了它的形成(图1E)。 此外， 在辛醇/水体系中， ONP的logP为2.19， 以MB为参照， 量 子产率()为0.007。 这些结果表明ONP可作为ONOO-。

32、检测的理想候选探针。 0074 实施例3 0075 ONP光谱性质和选择性 0076 为了更详细地研究ONP对ONOO-的响应， 通过记录692nm处荧光强度的变化来评估 其在ONOO-存在下的时间依赖性荧光响应。 发现ONP和ONOO-之间的反应很快， 将10 M的ONP与 100 M的ONOO-在含5CH3CN的PBS体系中共同孵育1分钟后在692nm处可清楚地利用荧光分 光光度计检测到到荧光强度的明显增强， 并且反应在15分钟内完成， ONOO-活化后ONP被有 效转化为MB(图3A)。 此外， 当10 M ONP与浓度增加的ONOO-(0-100 M)一起孵育时， 观察到浓 度依赖性荧。

33、光增强(图3B)， 表明ONP不仅对ONOO-快速响应， 对低浓度的ONOO-也高度敏感， 并 且692nm处的荧光强度与0至4 M范围内的ONOO-浓度之间存在优异的线性关系(R20.9979) 说明书 6/9 页 9 CN 109942609 A 9 (图4)。 另外ONP的检测限(LOD)可达到94nM(S/N3)。 0077 与荧光 “开启” 响应一致， 用100 M ONOO-处理10 M ONP也可以引起其UV-vis吸收 曲线的显着变化。 在没有ONOO-的情况下， 仅观察到以650nm为中心的非常弱的吸收带， 而用 ONOO-处理665nm处的吸光度显着增强， 且具有时间依赖性。

34、模式(图5)。 这些发现表明ONP对 ONOO-活化具有高度响应性。 此外， 为了确定ONP是否能够特异性地监测ONOO-， 通过记录 692nm处的荧光强度来检查各种活性氧(ROS)， 金属离子， 生物硫醇和生物系统中常见的其 他比较物种的选择性响应。 将ONP(10 M)与这些活性物质一起孵育， 例如叔丁基氢过氧化物 (tBuOOH)， 过氧化氢(H2O2)， 次氯酸盐(ClO-)， 超氧化物(O2-)， 羟基自由基(OH)， 超氧阴离 子自由基(O2-)， 通过跟踪MB形成来监测相应的荧光响应。 在这些分析物中， ONP显示对 ONOO-的最强响应， 其他测试的分析物仅诱导最小的荧光变化。

35、， 表明ONP对ONOO-的高度特异 性(图3C)。 由于硼酸酯取代的苯环可能在生理条件下被酪氨酸激酶催化反应激活， 还通过 将ONP与人酪氨酸激酶(150U/mL)一起温育来检测其在酪氨酸激酶存在下的稳定性， 孵育后 未观察到荧光变化。 总之， 这些结果表明ONP对ONOO-活化具有高度选择性， 并且其他常见细 胞物种不会触发其活化。 另外， 将10 MONP与不同浓度的ONOO-(0、 10、 20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、 90和100 M)在含5CH3CN的PBS中37下孵育15分钟能够肉眼直接观察到颜色的改变， 且具有浓度依赖性(图6A)， 与100 M各种活。

36、性氧物种在含5CH3CN的PBS中37下孵育15分 钟， 将含有200 M ONP的试纸条与1mM的各种活性氧物种在37下孵育15分钟,可见光下拍 摄照片,两者均可以肉眼观察到ONP能够特异性地监测ONOO-(图6B和6C)。 0078 实施例4 0079 通过活细胞中的ONP可视化示踪ONOO-的动态变化 0080 在确认ONOO-触发荧光开启响应的效率之后， 接下来继续研究其动态示踪细胞内 ONOO-生成的可行性。 使用ONP和共聚焦荧光显微镜跟踪活SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中 的ONOO-。 如图7A所示， 将活细胞与或不与SIN-1(100 M， ONOO-供体)一起预孵育1小时。

37、， 然后 在成像前用ONP(10 M)再处理30分钟。 在不存在SIN-1的情况下， 在负载ONP的细胞中观察到 弱荧光信号， 然而， 在SIN-1处理的细胞中可以检测到显著的荧光增强。 相应的， 通过用 ONOO-的分解催化剂FeTMPyP(50 M)处理可以有效地抑制增加的荧光。 此外， 与对照组相比， 在用NO供体NOC-18(1mM， 1小时)预处理的细胞中未观察到荧光信号的可检测变化(图7B)。 另外， 通过与ONP和不同的商业细胞器靶向剂(包括MitoTracker， LysoTracker和 ERTracker)共染色来研究细胞内ONOO-的亚细胞分布(图8)， 结果表明ONOO。

38、-可以在整个细胞 的不同部位广泛且无特别地分布， 这也与其跨膜分散特征一致。 这些实验表明ONP适用于外 源供体产生的ONOO-的活细胞成像。 为了进一步研究ONP监测内源性ONOO-的能力， 将活细胞 与H2O2(0.5mM， 1小时)或细菌内毒素脂多糖(LPS， 1 g/mL， 12小时)预孵育以刺激产生内源 ONOO-(图7C)， 发现在与ONP孵育之前用LPS/H2O2预刺激的细胞中具有显着的荧光增强， 用抗 氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC， 1mM)(半胱氨酸的前药)预处理的活细胞表现出降低的荧光信 号。 类似地， 加入一氧化氮合酶(NOS)抑制剂， 氨基胍(0.5mM， 0.5小时。

39、)可减少细胞内ONOO-， 因为氨基胍对细胞ONOO-的生物合成具有抑制作用(图7D)， 可以观察到下降的荧光信号。 这 些结果证明了ONP的选择性可视化生物系统中内源ONOO-的动态变化的可行性。 0081 实施例5 0082 利用ONP筛选针对ONOO-形成的诱导物和抑制剂 说明书 7/9 页 10 CN 109942609 A 10 0083 为了评估ONP是否是用于筛选针对ONOO-形成的诱导物和抑制剂的有效鉴定工具， 通过将ONP与高通量分析(HCA)组合来构建快速验证生物活性分子的基于荧光的筛选方法。 首先建立了一个化学库， 其中含有不同种类的天然产物， 顺铂、 青蒿琥酯、 双氢青。

40、蒿素、 鬼臼 毒素、 盐酸多柔比星、 姜黄素、 10-羟基喜树碱、 白杨素、 紫苏醇和大黄酸， 均有潜在的抗癌活 性。 用20 M天然产物预处理活SH-SY5Y细胞12小时， 将细胞与ONP(10 M)在新鲜培养基中再 孵育30分钟， 通过高含量筛选分析进行图像和定量分析。 如图9A和图9B所示， 将天然产物的 不同处理中的ONP的荧光信号与阴性对照组的荧光信号进行比较， 以筛选促进ONOO形成的 潜在诱导物。 发现这些报道的抗癌剂可以潜在地诱导内源性ONOO-的过量产生， 这表明在这 些化合物处理的细胞中抑制ONOO-过度积累可能是抗癌机制之一。 进一步为了研究该方法 的筛选能力以鉴定抗ON。

41、OO-形成的潜在抑制剂， 进一步建立了含有不同抗氧化剂的化合物 库， 例如多酚和不饱和化合物， 姜黄素、 白杨素， 芹菜素， 木犀草素， 染料木素， 刺芒柄花素， 大豆苷元， 原儿茶醛， 原儿茶酸和柚皮素(图9C和图9D)。 然后通过使用HCA分析比较ONP的荧 光强度来筛选这些化合物对ONOO-形成的抑制效率， 表明这些化合物除原儿茶酸和柚皮素 外的大多数可用于抑制ONOO-的产生。 重要的是， 观察到姜黄素， 一种先前报道的抗癫痫药， 可有效控制内源性ONOO-形成。 总之， 可以通过使用与ONP组合的高通量分析在这些试剂的 存在下表现出的NIR荧光信号的变化来简单地筛选和鉴定针对ONOO。

42、-形成的诱导物和抑制 剂。 0084 实施例6 0085 ONP用于在活鼠中检测ONOO- 0086 为了研究ONP是否可以用于监测体内ONOO-浓度的动态变化， 使用一组5周龄BALB/ c裸鼠， 通过腹膜内(i.p.)注射不同药剂(SIN-1， 3,4-二羟基苯甲醛， 姜黄素， Rhein)来诱导 内源性ONOO-变化； 然后通过尾静脉内(i.v.)注射ONP(浓度50 M， 200 L生理盐水)后在不同 时间点捕获图像(图10)。 发现ONP可以有效地穿透血脑屏障(BBB)， 发现只注射ONP的健康的 对照组小鼠脑也有一定浓度的ONOO-。 用3,4-二羟基苯甲醛(60mg/Kg， 20。

43、0 L生理盐水)和姜 黄素(60mg/Kg， 200 L生理盐水)腹腔注射预处理， 脑内NIR荧光信号在静脉注射ONP后5， 15， 30， 45和60分钟显著低于对照组(对照组均为只注射ONP的健康小鼠)， 表明抗氧化剂3,4-二 羟基苯甲醛和姜黄素可用于有效清除脑中内源性ONOO-水平。 SIN-1(500 M， 200 L生理盐 水)腹腔注射处理的小鼠中明显的NIR荧光信号主要位于腹部并且高于健康对照组， 是因为 i.p.注入SIN-1后ONOO-可以迅速释放， SIN-1本身可能不能有效地穿过BBB。 相应的， 可以观 察到Rhein(60mg/Kg， 200 L生理盐水)腹腔注射处理。

44、的小鼠和对照小鼠在早期时间点之间 的差异， 这伴随着用大黄酸处理的小鼠脑中稍高的NIR荧光信号。 这些发现表明， ONP是一种 特异性探针， 可进行体内成像监测外源性刺激过程中ONOO-含量的动态变化， 表明ONP可以 作为一种成像剂， 重要的是， ONP可用于成像脑中内源性ONOO-水平的变化。 0087 实施例7 0088 ONP用于对活体癫痫小鼠内源性ONOO水平变化进行成像 0089 在癫痫的发展过程中发现过表达的ONOO-。 为了研究ONP是否可用于成像癫痫脑中 内源性ONOO-水平的变化， 使用了红藻氨酸(KA)诱导的BALB/c小鼠模型， 这是一种广泛使用 的癫痫小鼠模型。 在静。

45、脉注射ONP(浓度50 M,200 L生理盐水)后的不同时间点比较癫痫大 脑和健康对照组大脑中ONOO-的相对水平， 发现在静脉注射ONP后5,15,30,45和60分钟， KA 说明书 8/9 页 11 CN 109942609 A 11 诱导的癫痫脑中的NIR荧光信号显着高于对照组(对照组均为只注射ONP的健康小鼠)。 在 i.p.注射KA(浓度6mg/Kg,200 L生理盐水)后， 12小时内脑中ONOO-的浓度与24小时组相比 显着增加。 在ONP注射后60分钟内， 癫痫大脑和WT脑之间的相对差异R(癫痫)/R(WT)F(癫 痫)/F(WT)从1.4倍降低至1.2倍(图11A和B)。 。

46、重要的是， 用抗氧化剂姜黄素(60mg/Kg， 3天) 预处理小鼠可以成功地防止由KA诱导的ONOO-的过量产生。 同时， 还发现与非治疗组相比， 姜黄素的后处理可以有效地清除KA诱导的小鼠中过量积累的ONOO-， 表明姜黄素可能是减 少ONOO-的优良抗癫痫药， 用于预防癫痫的损害和预防性干预。 此外， 离体NIR荧光图像显示 KA诱导的脑的NIR荧光强度远高于对照组， 并且用姜黄素治疗前/后可以减少癫痫脑中的荧 光信号， 表明ONOO-水平下降， 通过姜黄素治疗可以有效清除癫痫大脑中过量的ONOO-(图11C 和E)。 为了进一步研究ONOO-在组织中的亚细胞分布， 分离出脑组织并切成切片。

47、以在不同深 度进行荧光成像分析(图11D和F)。 与对照组相比， KA给药组以时间依赖性方式显示出明显 的NIR荧光， 姜黄素处理组表现出较低的荧光。 组织中荧光强度的这些显着变化与癫痫大脑 中的荧光强度高度一致， 进一步证实了KA诱导的癫痫期间内源性ONOO-上调。 总之， 这些结 果表明ONP可用于体内成像癫痫脑中的内源性ONOO-通量， 并且提供了潜在的方法用于监测 活体小鼠中抗氧化药物治疗期间内源性ONOO-形成的动态变化， 说明针对过氧亚硝酸盐的 近红外荧光探针ONP可以筛选抗癫痫抑制剂。 0090 实施例8 0091 监测海马区域ONOO-水平的变化 0092 癫痫通常与海马的严重。

48、组织学损伤有关。 为确定ONOO-在KA诱导的癫痫发作中的 潜在作用， 通过将实施例7中的小鼠的离体脑部进行多聚甲醛固定， 石蜡切片脱蜡至水后进 行ONP荧光扫描， 然后采用苏木素染色， 伊红染色对切片进行HE染色， 脱水封片后进行明场 扫描， 对KA暴露后CA1， CA3和齿状回(DG)亚区的荧光强度和海马神经元死亡进行了细致的 研究(图12)。 在正常对照组即只腹腔注射ONP的正常小鼠脑切片中， 在所有海马区域仅观察 到弱荧光信号， 伴随着明显的分层结构， 整齐排列的神经细胞， 完整的细胞膜， 均匀的细胞 质染色和明显的核仁。 相反， 清楚地观察到癫痫脑切片中的显著的荧光增强， 特别是在C。

49、A1 和CA3区域， 这可归因于癫痫大脑中较高的ONOO-水平。 值得注意的是， 由刺激应激产生的过 量ONOO-可导致严重的神经元死亡， 包括神经元丢失和海马区域的排列紊乱， 这也与先前报 道癫痫中的保护性超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的显着减少一致。 重要的是， 发现姜黄素治疗前后的ONOO-水平发生了显着变化。 姜黄素给药可以抑制或消除 所有海马亚区中过度增加的ONOO-， 进一步有效地保护或减少癫痫病症中的神经元损伤， 这 些观察结果表明， 高浓度的ONOO-可能导致严重的神经元损伤和癫痫发生， 有效抑制过度表 达的ONOO-是癫痫的潜在治疗方法。 说明书 。

50、9/9 页 12 CN 109942609 A 12 图1 说明书附图 1/10 页 13 CN 109942609 A 13 图2 说明书附图 2/10 页 14 CN 109942609 A 14 图3 说明书附图 3/10 页 15 CN 109942609 A 15 图4 图5 说明书附图 4/10 页 16 CN 109942609 A 16 图6 图7 说明书附图 5/10 页 17 CN 109942609 A 17 图8 说明书附图 6/10 页 18 CN 109942609 A 18 图9 说明书附图 7/10 页 19 CN 109942609 A 19 图10 图11 。