鉴定核桃乳的DNA条形码基因及核桃真伪性的分子鉴定方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910270663.8 (22)申请日 2019.04.04 (71)申请人 中国计量大学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区 学源街258号 (72)发明人 朱诚丁艳菲姜广泽陈成统 孙骏威王飞娟江琼 (74)专利代理机构 杭州恒翌专利代理事务所 (特殊普通合伙) 33298 代理人 王从友 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2。

2、006.01) (54)发明名称 鉴定核桃乳的DNA条形码基因及核桃真伪性 的分子鉴定方法 (57)摘要 本发明筛选得到了psba-trnH作为鉴定核桃 乳的最适DNA条形码。 基于此， 设计了针对核桃的 特异性引物对， 制备了相关试剂盒， 并利用它们 对核桃乳的真伪性进行鉴定。 本发明的鉴定方法 准确快速， 应用范围广， 具有良好市场应用前景。 权利要求书1页 说明书13页 序列表3页 附图4页 CN 109943657 A 2019.06.28 CN 109943657 A 1.一种鉴定核桃乳的DNA条形码基因， 其特征在于， 该基因的序列如SEQ ID NO:13所 示。 2.一种鉴定核。

3、桃乳的DNA条形码基因， 其特征在于， 该基因的序列如SEQ ID NO:14所 示。 3.用于扩增权利要求1的鉴定核桃乳的DNA条形码基因的引物对， 其特征在于， 所述引 物对为SEQ ID NO:7和8所示。 4.用于扩增权利要求2的鉴定核桃乳的DNA条形码基因的引物对， 其特征在于， 所述引 物对为SEQ ID NO:11和12所示。 5.一种用于鉴定核桃乳真伪性的试剂盒， 其特征在于， 其中含有权利要求3或4的引物 对， 或者含有权利要求3和4的引物对。 6.权利要求1或2的基因， 权利要求3或4的引物对， 或权利要求5的试剂盒在鉴定核桃乳 真伪性中的应用。 7.一种鉴定核桃乳真伪性的。

4、PCR分子鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： （1） 从待鉴定核桃乳样本中分离提取DNA； （2） 以步骤 （1） 所得DNA为模板， 采用权利要求4的引物对进行PCR扩增； （3） 将步骤 （2） 所得扩增产物用电泳进行分离， 如果能特异性扩增出129bp左右的条带， 则将扩增产物进行测序分析， 所得序列与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的同源性在99 以上， 即可判断核桃乳目的种源成分存在核桃。 8.权利要求7的方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中PCR扩增的反应条件为： 95预变性5 min， 95变性30 s、 58退火30 s、 72延伸30 s， 共35个循环； 最。

5、后72总延伸10 min。 9.权利要求7的方法， 其进一步包括以下步骤： （4） 以步骤 （1） 所得DNA为模板， 采用权利要求3的引物对进行PCR扩增； （5） 将步骤 （4） 所得扩增产物用电泳进行分离， 扩增序列与NCBI 数据库比对， 如果与非 目的种源物种的比对相似度大于99%， 则判定核桃乳掺假。 10.权利要求9的方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中PCR扩增的反应条件为： 95变性30 s、 64退火30 s、 72延伸30 s， 共35个循环； 最后72总延伸10 min。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109943657 A 2 鉴定核桃乳的DNA条形码基因及核桃。

6、真伪性的分子鉴定方法 技术领域 0001 本发明涉及领域分子鉴定领域， 尤其涉及鉴定核桃乳的DNA条形码基因及核桃真 伪性的分子鉴定方法。 背景技术 0002 核桃乳不仅具有纯天然的植物蛋白原材料、 不失核桃仁原有营养成份和增强大脑 记忆功能的特点， 还是蛋白质、 维生素B、 尼克酸以及多种微量元素的良好来源， 在我国一直 属于畅销产品1-2。 然而， 核桃乳掺杂使假现象层出不穷， 手段和方式不断翻新， 检测和鉴 定困难重重， 因过敏源成分不明对消费者的人身健康构成威胁， 影响了食品安全和贸易秩 序。 0003 目前食品真伪性的鉴定主要依赖于蛋白质和DNA序列分析3-4。 核桃乳作为深加 工食。

7、品， 经高温等流程， DNA破坏严重， 不适合蛋白质分析5。 DNA条形码技术是利用一段或 几段标准DNA序列实现动物、 植物和真菌物种快速鉴定的方法， 以一对通用引物扩増标准序 列， 通过序列内碱基的多样性可以对己知和未知成分进行识别， 具有范围广、 特异性好、 灵 敏度高、 操作简便的优点6-8。 常用于植物DNA条形码的基因有ITS、 rbcl、 trnl、 paba- trnH， 它们被认为是潜在的优秀的植物DNA条形码候选序列。 目前， DNA条形码技术已广泛应 用于食品鉴定领域9-13。 0004 近年来DNA条形码， 克服了传统形态学分类存在的缺陷， 被广泛应用于物种鉴定及 食品。

8、安全领域。 Maralita等利用DNA条形码鉴定了菲律宾市场上的渔类产品， 发现金枪鱼与 标签不符17。 Jaakola等通过DNA条形码和HRM分析技术， 对来自不同野生浆果品种且在市 场上易混淆的欧洲越橘进行鉴定18。 Bruni等使用DNA条形码技术鉴定了3个集合植物样 本， 证明DNA条形码技术是一种有效的有毒植物鉴定工具19。 0005 我国植物蛋白饮料市场日益增大， 原成分造假现象较为严重。 目前DNA条形码技术 也应用于植物蛋白饮料的鉴定领域。 韩晴等16研究发现ITS2-2和trnH-psbA-1可作为鉴 别杏仁露中花生源性成分的植物DNA条形码组合， 为植物蛋白饮料的检测提。

9、供了新思路。 核 桃乳的加工工艺复杂， 从而使得其DNA难以提取。 发明内容 0006 为了解决上述问题， 本发明中分别用ITS1、 ITS2、 rbcL、 psbA-trnH、 trnL 5种DNA条 形码基因对10种核桃乳DNA进行PCR扩增检测及产物送测序， 通过对比扩增效率及测序结 果， 筛选得到核桃乳最适mini条形码psbA-trnH。 本发明基于DNA条形码技术， 结合HRM荧光 定量PCR， 对市售10种核桃乳目的种源成分(核桃)与非目的种源成分进行真伪性检测。 对10 种核桃乳采用了荧光定量PCR和HRM分析技术， 发现一款掺假核桃乳产品， 其可作为非测序 的快速核桃乳真伪鉴。

10、定有效方法。 因此， DNA条形码技术还可以与荧光定量PCR、 基因芯片技 术等技术相结合达到对食品更准确、 更快速的鉴别， 成为食品物种来源鉴定的重要工具。 0007 本发明的一个目的是提供一种鉴定核桃乳的DNA条形码基因， 其特征在于， 该基因 说明书 1/13 页 3 CN 109943657 A 3 的序列如SEQ ID NO:13所示。 0008 本发明的另一个目的是提供一种鉴定核桃乳的DNA条形码基因， 其特征在于， 该基 因的序列如SEQ ID NO:14所示。 0009 本发明的另一个目的是提供用于扩增鉴定核桃乳的DNA条形码基因的引物对， 其 特征在于， 所述引物对为SEQ 。

11、ID NO:7和8所示。 0010 本发明的另一个目的是提供用于扩增鉴定核桃乳的DNA条形码基因的引物对， 其 特征在于， 所述引物对为SEQ ID NO:11和12所示。 0011 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定核桃乳真伪性的试剂盒， 其特征在于， 其中含有SEQ ID NO:7和8的引物对， 或者含有SEQ ID NO:11和12的引物对， 或者含有SEQ ID NO:7、 8； 以及11和12的引物对。 0012 本发明的另一个目的是提供上述基因、 引物对或试剂盒在鉴定核桃乳真伪性中的 应用。 0013 本发明的另一个目的是提供一种鉴定核桃乳真伪性的PCR分子鉴定方法， 其特征 在。

12、于， 包括以下步骤： 0014 (1)从待鉴定核桃乳样本中分离提取DNA； 0015 (2)以步骤(1)所得DNA为模板， 采用SEQ ID NO:11和12的引物对进行PCR扩增； 0016 (3)将步骤(2)所得扩增产物用电泳进行分离， 如果能特异性扩增出129bp左右的 条带， 则将扩增产物进行测序分析， 所得序列与SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列的同源性 在99以上， 即可判断核桃乳目的种源成分存在核桃。 0017 优选地， 其中步骤(2)中PCR扩增的反应条件为： 95预变性5min， 95变性30s、 58 退火30s、 72延伸30s， 共35个循环； 最后72总延伸10。

13、min。 0018 优选地， 其进一步包括以下步骤： 0019 (4)以步骤(1)所得DNA为模板， 采用SEQ ID NO:7和8的引物对进行PCR扩增； 0020 (5)将步骤(4)所得扩增产物用电泳进行分离， 扩增序列与NCBI数据库比对， 如果 与非目的种源物种的比对相似度大于99， 则判定核桃乳掺假。 0021 优选地， 其中步骤(4)中PCR扩增的反应条件为： 95变性30s、 64退火30s、 72 延伸30s， 共35个循环； 最后72总延伸10min。 0022 本发明的另一个目的是提供一种鉴定核桃乳真伪性的PCR-HRM分子鉴定方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： 002。

14、3 (1)从待鉴定核桃乳样本中分离提取DNA； 0024 (2)以步骤(1)所得DNA和标准品核桃DNA为模板， 采用SEQ ID NOs:7和8的引物对 进行荧光定量PCR扩增； 0025 (3)对荧光定量PCR的扩增曲线图进行高分辨率熔解曲线(HRM)分析， 单一物种扩 增后的熔解曲线为单峰， 而掺假样品会出现不同熔解温度的明显双峰。 0026 进一步地， 上述方法包括如下步骤： 0027 (4)荧光定量PCR扩增产物进一步用凝胶电泳验证判断， 单一条带的是核桃乳纯样 本； 两条条带恰好也对应熔解曲线双峰的样本， 是掺假样本。 0028 本发明的另一个目的是提供一种鉴定核桃乳真伪性的PCR。

15、-HRM分子鉴定方法， 其 特征在于， 包括以下步骤： 说明书 2/13 页 4 CN 109943657 A 4 0029 (1)从待鉴定核桃乳样本中分离提取DNA； 0030 (2)以步骤(1)所得DNA和标准品核桃DNA为模板， 采用SEQ ID NOs:7和8的引物对 进行荧光定量PCR扩增； 0031 (3)扩增后连续进行HRM分析， 比较核桃乳DNA曲线与目的种源成分核桃以及非目 的种源成分的熔解曲线的异同， 判定是否存在掺假， 并确定掺假物种。 0032 优选， 其中步骤(2)中的PCR扩增反应条件为： Holding： 9530s、 cycle： 40； 二步 法： 955s，。

16、 6030s。 20 L的扩增体系中依次加入10 L SYBR(zx)、 0.4 L rox、 0.8 L引物、 2 L DNA模板、 6 L无菌去离子水。 0033 优选， 其中PCR扩增体系为： 20 L的扩增体系中依次加入10 L SYBR(zx)、 0.4 L rox、 0.8 L引物、 2 L DNA模板、 6 L无菌去离子水。 0034 优选， 其中高分辨率熔解曲线反应条件： 紧密遵循高分辨率熔化， 从75到95， 温度增量为每2秒0.1。 0035 本发明的有益效果如下： 基于DNA条形码技术， 利用特异性PCR方法或者荧光定量 PCR结合HRM， 可对核桃乳目的种源成分(核桃)。

17、与非目的种源成分进行真伪性鉴定， 该鉴定 方法检测快速、 结果准确。 附图说明 0036 图1是10种核桃乳的5种DNA条形码基因PCR扩增电泳图。 A ITS2.B psba-trnH.C rbcL D trnL.E ITS1基因扩增条带 0037 注： M： 500bp ladder DNA maker； N： 阴性对照； 1-3： 鹤乡果； 4-6： 伊利； 7-9： 六个核 桃； 10-12： 詹氏； 13-15： 智慧核桃； 16-18： 信友； 19-21： 祥核； 22-24： 赫之林； 25-27： 汾州金； 28-30： 洱宝。 0038 图2是利用特异性引物psbA-trn。

18、H-wal对10种坚果(A)以及10种核桃乳(B)样品的 PCR扩增结果。 0039 图3是利用psbA-trnH基因对10种核桃乳DNA样本进行荧光定量PCR检测结果。 A 10 种核桃乳扩增曲线B 10种核桃乳HRM结果图C为单一物种核桃乳样品HRM曲线图D为掺假核 桃乳样品HRM曲线。 0040 图4是标准品核桃DNA荧光定量PCR扩增熔解曲线图。 0041 图5是核桃乳DNA荧光定量PCR扩增熔解曲线双峰图。 0042 图6是核桃乳DNA荧光定量PCR扩增熔解曲线双峰图。 0043 图7是荧光定量PCR扩增产物电泳图。 注： M： 500bp DNA maker； N： 阴性对照； 1。

19、： 鹤乡 果； 2： 伊利； 3： 六个核桃； 4： 汾州金； 5： 智慧核桃； 6： 信友； 7： 祥核； 8： 詹氏； 9： 赫之林:； 10： 洱 宝。 两条条带对应熔解曲线双峰的， 可判定存在掺假。 0044 图8是目的种源物种核桃及非目的种源物种花生的高分辨率熔解曲线(HRM)曲线 图， 核桃、 花生标准品分别有3个重复。 0045 图9是核桃、 花生以及核桃乳HRM曲线图， 图9中存在1种核桃乳产品与花生曲线高 度相似， 其余核桃乳曲线均有核桃曲线相似。 0046 图10是以花生为标准的曲线分析图， 图中呈现峰值凸起的为核桃乳及核桃曲线， 在0轴附近的为花生曲线图， 可见有一条核桃。

20、乳和花生曲线相同。 说明书 3/13 页 5 CN 109943657 A 5 具体实施方式 0047 以下结合具体实施方式详细描述本发明， 不能将其解释为限制本发明的范围。 0048 实施例1 0049 1材料与方法 0050 1.1材料与试剂 0051 10种坚果： 核桃、 腰果、 巴旦木、 夏威夷果、 碧根果、 榛子、 杏仁、 大豆、 花生、 松子； 10 种核桃乳： 贵州赫之林核桃乳、 云南洱宝核桃乳、 养元六个核桃(无糖型)、 信友核桃乳、 摩尔 农庄祥核(无糖型)、 鹤乡果核桃乳、 伊利核桃乳、 智慧核桃原味核桃乳、 汾州金核桃、 詹氏核 桃乳。 以上由国内市场购得。 0052 D。

21、NA提取试剂盒购自康为世纪公司； 核酸染料goldview购自庄盟公司； 低电渗琼脂 糖购自上海生工公司； 普通PCR试剂盒ExTaq、 DNA marker及实时定量PCR试剂盒购自日本 TAKARA公司。 引物由上海生工公司合成。 0053 1.2仪器 0054 快速PCR仪(AnalytikJenaAG德国耶拿SpeedCycler2)； 电泳仪及凝胶成像系统(上 海天能， EPS300， 5200Multi)； 冷冻离心机(美国BeckmanCoulter， Microfuge20R)； 真空冻干 仪(美国LABCONCO FreeZone2.5Plus)； 微量核酸蛋白测定仪(杭州奥。

22、盛仪器， Nanodrop- 100)； 荧光定量PCR仪(Thermo fisher 7300plus)； 均质仪(杭州奥盛仪器Bioprep-24)。 0055 1.3实验方法 0056 1.3.1坚果及核桃乳DNA的提取 0057 核桃等坚果经液氮研磨成粉末后取0.1g， 采用CTAB沉淀法提取DNA。 核桃乳作为深 加工食品， 加工制作时经高温灭菌等众多流程， 使核桃乳DNA破坏严重， 难以提取。 称取0.1g 抽真空冻干的核桃乳样本， 液氮研磨， 加入100 LCTAB裂解液水浴温和裂解， 使用康为试剂 盒优化方法提取DNA。 0058 1.3.2引物筛选及设计 0059 查阅文献筛。

23、选出ITS1、 ITS2、 trnL、 rbcL、 psbA-trnH 5种植物通用条形码基因引 物14-16， 并通过对10种市售坚果PCR扩增， 证实引物的质量及通用性。 引物序列SEQ ID NOs:1-12见表1。 0060 表1基因引物序列 说明书 4/13 页 6 CN 109943657 A 6 0061 0062 0063 1.3.3PCR扩增及产物测序 0064 PCR采用25 L扩增体系， 包括12.5 L Premix Taq、 0.5 L引物、 1 L DNA模板、 10.5 L蒸馏水。 反应程序为95预变性5min， 95变性30s、 退火30s(退火温度见表1)、 。

24、72延伸 30s， 共35个循环； 最后72总延伸10min。 待PCR反应完成后取6 L PCR扩增产物用琼脂糖凝 胶进行电泳检测。 PCR产物送上海生工公司进行双向测序。 将测序结果在NCBI上进行BLAST 比对， 同时结合BOLD数据库(http:/www.boldsystems.org)对样品序列进行鉴定分析。 0065 1.3.4荧光定量PCRHRM检测 0066 利用筛选所得核桃乳最适DNA条形码psbA-trnH基因与核桃乳各样本进行荧光定 量PCR扩增， 20 L的扩增体系中依次加入10 L SYBR(zx)、 0.4 L rox、 0.8 L引物、 2 L DNA模 板、 。

25、6 L蒸馏水。 反应程序为Holding： 9530s、 cycle： 40； 二步法： 955s， 6030s。 PCR扩增 结束后跑高分辨率熔解曲线HRM。 高分辨率熔解曲线(HRM)反应条件： 紧密遵循高分辨率熔 化， 从75到95， 温度增量为每2秒0.1。 0067 实施例2 0068 2结果与分析 0069 2.1核桃乳DNA的提取 0070 利用康为试剂盒优化方法提取10种核桃乳品牌DNA， 由表2可见提取到DNA的OD260/ 说明书 5/13 页 7 CN 109943657 A 7 OD280值均在1.7-1.9内， 说明DNA纯度好， DNA浓度也较高， 该方法提取效果较。

26、好。 0071 核桃乳是深加工产品， DNA片段严重破坏降解， 片段很小， 采用文献报道的植物CP- 03基因检测各品牌核桃乳DNA的提取质量， 扩增条带鲜明， 说明所提取的DNA质量较好。 0072 表2 10种品牌核桃乳DNA提取结果(n3， 0.05) 0073 0074 2.2核桃乳最适DNA条形码筛选结果 0075 分别用ITS1、 ITS2、 rbcL、 psbA-trnH、 trnL 5种DNA条形码基因对10种核桃乳DNA进 行PCR扩增检测及产物送测序(图1)。 psbA-trnH扩增效率为100， 测序成功率为96.67， 比对成功率为89.66； rbcL扩增效率为100。

27、， 测序成功率为90， 比对成功率为73.33； trnl扩增效率为96.67， 测序成功率为86.2， 比对成功率为63.33； ITS2扩增效率为 93.33， 测序成功率为89.28， 比对成功率88， ITS1扩增效率为83.33， 扩增出的DNA 片段太短， 测序后无法进行序列比对。 通过以上分析， 选取扩增效率及测序、 比对成功率均 较高的psbA-trnH基因作为鉴定核桃乳的最适DNA条形码。 0076 鉴定核桃乳的最适DNA条形码psbA-trnH基因(313bp)， 其序列为SEQ ID NO:13： 0077 TCGTACACACACAAGTACTGTACGACTGTGCC。

28、GTCGTTTTACAAACAAATGGATAAGACTTCAGTCTTA GTATATACGAGTTATTGAAAATAAAGGAGCAATAATCAACTTCTTGTTCTATCAAGAGGATTGGTATTGCTCCTTTA TTTTGTGTATCTTATCTTAGAGAAGAAAGGTAAATCTGATGAATAGAATAGTAGAAATTTAAATCTCCATGTAATTT GTACTACATGGAGTATAGGGGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAGGCAGTGGATTGTGAATCCACCATGCGCGGTCAT AGCTGTTTCCTGA 0078 2.3核桃乳DNA。

29、特异性引物设计及检测 0079 根据2.2的结果， 筛选出鉴定核桃乳的最适DNA条形码基因是psbA-trnH基因， 10种 坚果均能扩增出全长313bp的条带， 经过2.4实验测序与NCBI数据库BLAST对比判定核桃乳 有无非目的种源物种成分。 0080 在该psbA-trnH基因的基础上， 设计针对核桃的psbA-trnH基因特异性引物(表1中 的SEQ ID NOs:11和12)， 扩增长度是129bp(SEQ ID NO:14， 见下)。 对核桃乳DNA扩增， 存在 扩增条带， 判定存在核桃成分； 即通过有无条带就可以判断是否有核桃成分， 方便明了。 并 进一步结合如下表3的测序结果。

30、， 证实存在核桃成分。 0081 ATCAAGAGGATTGGTATTGCTCCTTTATTTTGTGTATCTTATCTTAGAGAAGAAAGGTAAATCTGATG AATAGAATAGTAGAAATTTAAATCTCCATGTAATTTGTACTACATGGAGTATAGGGGCGGA(SEQ ID NO:14) 说明书 6/13 页 8 CN 109943657 A 8 0082 上述313bp扩增序列结合测序结果也可以判定核桃乳有无非目的种源物种成分。 另外在313bp的基础上设计129bp片段引物， 也可以判定核桃乳有无非目的种源物种成分， 其中的129bp片段更方便有效。 00。

31、83 依据上述psbA-trnH基因， 设计针对核桃的特异性引物psbA-trnH-wal(表1， SEQ ID NOs:11-12)。 利用该引物对10种坚果DNA进行PCR扩增， 检测引物的目的种源成分特异 性。 结果表明只在核桃的三组DNA样本中有扩增条带， 说明引物特异性良好； 10种不同品牌 核桃乳的30个DNA样品中均有扩增条带， 证明均含有核桃成分。 0084 经2.2中扩增效率及比对成功率比较， 筛选得到鉴定核桃乳的最适DNA条形码基因 psba-trnH， 继而与目的种源物种核桃标准品DNA进行扩增， 经过测序， 得到核桃DNA条形码 序列， 序列与NCBI数据库进行比对， 。

32、相似度100， 认为是核桃， 在所得条形码序列中设计核 桃特异性引物， 与10种坚果DNA扩增来证实引物特异性， 并与所提核桃乳DNA进行扩增， 通过 2.3扩增条带， 判定核桃乳中有无目的种源物种核桃(图2)。 选取每种核桃乳3个重复中扩增 条带最佳的psba-trnH基因特异性引物扩增产物进行测序， 所得序列与psbA-trnH基因条形 码序列比对， 相似度99以上判定为核桃， 或者说核桃乳中存在核桃种源成分。 比对结果见 表3。 结合特异性引物扩增电泳图条带和测序序列比对结果， 判定核桃乳产品有无目的种源 核桃成分。 0085 表3基于psba-trnH基因特异性扩增序列与DNA条形码(。

33、313bp)比对结果 0086 0087 2.4核桃乳测序比对结果 0088 DNA条形码psba-trnH基因通用引物扩增核桃乳DNA， 测序所得序列通过与NCBI数 据库比对， 相似度99以上判定为对应物种， 通过此种方法可判定核桃乳有无其他非目的 种源成分存在。 结果与2.3所得结论相对照。 比对结果见表3-5。 通过2.3与2.4两部分结合， 可判定核桃乳中有无核桃及其他掺假成分。 0089 根据10种不同品牌核桃乳的psbA-trnH扩增测序序列， 与NCBI数据库进行BLAST分 析， 结果显示其中汾州金核桃乳品牌的3个DNA PCR扩增样品比对结果为花生， 相似度为 100， 相。

34、似序号为GU396719.1。 存在产品与标签不符行为， 认为是掺假产品。 0090 表4基于psba-trnH基因通用引物扩增序列NCBI比对结果 说明书 7/13 页 9 CN 109943657 A 9 0091 0092 0093 表5基于ITS2基因通用引物扩增序列NCBI比对结果 说明书 8/13 页 10 CN 109943657 A 10 0094 0095 表6基于trnL基因通用引物扩增序列NCBI比对结果 说明书 9/13 页 11 CN 109943657 A 11 0096 0097 2.5荧光定量PCRHRM检测结果 0098 此方法是非测序快速检测方法， 通过HR。

35、M熔解曲线峰图判定有无掺假。 利用核桃乳 最适DNA条形码psbA-trnH基因， 对10种核桃乳DNA样本进行荧光定量PCR扩增， 从扩增图(图 3A)可以看出， 样品均有扩增曲线， 起跳点合适。 在扩增曲线基础上进行高分辨率熔解曲线 HRM分析， 结果显示， 其他未掺假样品熔解曲线为单峰(图3C)， 而汾州金品牌核桃乳的熔解 曲线为双峰(图3D)， 并且主峰值不同， 与该品牌测序比对结果为花生的结果相符。 0099 本发明的鉴定核桃乳真伪性的PCR-HRM的方法， 具体包括如下步骤： 0100 (1)从待鉴定核桃乳样本中分离提取DNA； 0101 (2)分别以步骤(1)所得DNA和标准品核。

36、桃DNA为模板， 采用引物表中的SEQ ID NO: 7和8这对引物进行荧光定量PCR扩增； 20 L的扩增体系中依次加入10 L SYBR(zx)、 0.4 L rox、 0.8 L引物、 2 L DNA模板、 6 L无菌去离子水。 反应程序为Holding： 9530s、 cycle： 40； 二步法： 955s， 6050s。 0102 (3)对荧光定量PCR的扩增曲线图(图3A)进行分析， 样品均有扩增曲线， 起跳点合 适。 在扩增曲线基础上进行熔解曲线分析， 以标准样品核桃DNA扩增产物的熔解曲线如图4， 主峰单一， 且熔解温度为74.71， 扩增中存在两种双峰现象， 图5中存在明显。

37、双峰， 主峰的 形状、 峰值及熔解温度均与图4核桃标准峰相似， 但在熔解温度81处存在杂峰， 与标准峰 差异明显； 在另外一个样品双峰图图6中， 可明显看到主峰熔解温度为80.91， 与标准核桃 样品熔解温度差异明显。 说明书 10/13 页 12 CN 109943657 A 12 0103 综合判断， 单一物种扩增后的熔解曲线为单峰， 掺假样品会出现不同熔解温度的 明显双峰， 说明样本不纯。 并且， 荧光定量PCR扩增产物可进一步用凝胶电泳验证判断(见图 4)。 可以看出， 单一条带的是核桃乳纯样本。 两条条带恰好也对应熔解曲线双峰的样本， 是 掺假样本。 因此， 通过有无双峰和电泳条带可。

38、综合判定核桃乳是否存在掺假。 但是掺假物种 不能明确。 0104 (4)荧光定量PCR扩增后连续进行高分辨率熔解曲线(HRM)， 反应体系采用TianGen Biotech HRM试剂盒， 20 L体系中， 2xHRM Analysis PreMix 10 L、 正反引物各0.6 L、 DNA模 板(100ng)1 L、 补Rnase-Free ddH2O至20 L。 0105 通过HRM分析， 比较核桃乳DNA曲线与目的种源成分核桃以及非目的种源成分(花 生、 大豆等)熔解曲线的异同， 判定存不存在掺假， 并确定掺假物种。 0106 HRM分析图： 0107 图8为目的种源物种核桃及非目的种。

39、源物种花生的高分辨率熔解曲线(HRM)曲线 图， 核桃、 花生标准品分别有3个重复。 0108 图8中可以看出两种样品HRM曲线存在明显差异， 红色为空白对照。 0109 图9为去掉空白的分析图， 核桃、 花生以及核桃乳HRM曲线图， 图9中存在1种核桃乳 产品与花生曲线高度相似， 其余核桃乳曲线均有核桃曲线相似。 0110 图10以花生为标准的曲线分析图， 图中呈现峰值凸起的为核桃乳及核桃曲线， 在0 轴附近的为花生曲线图， 可见有一条核桃乳和花生曲线相同。 0111 图10以核桃为标准的曲线分析图， 图中在正数区间呈现峰值凸起的为核桃乳曲 线， 在0轴附近的为核桃标准品曲线， 在负数区间为。

40、花生曲线， 可见有一条核桃乳和花生曲 线相同， 为掺假样本， 掺假的是花生。 0112 综上所述， 步骤(1)(2)(3)方法为荧光定量PCR扩增， 通过熔解曲线有无双峰和电 泳条带可综合判定核桃乳是否存在掺假， 但是掺假物种不能明确。 步骤(1)(2)(4)方法为 HRM分析， 通过高分辨率熔解曲线(HRM)曲线， 可以判定核桃乳是否存在掺假， 且能明确掺假 的是什么非目的种源成分。 0113 参考文献： 0114 1顾成鹏， 徐霞， 潘科， 魏高歌。 核桃仁的功能特性及其药理研究进展J农产品 加工,2009,(09):53-54 0115 2Haider S， Batool Z， Taba。

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