微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用和疫苗.pdf

《微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用和疫苗.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用和疫苗.pdf（16页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910266528.6 (22)申请日 2019.04.03 (71)申请人 周口师范学院 地址 466001 河南省周口市川汇区文昌路 东段 (72)发明人 樊淑华王永立杨蟠刘晓萌 吴常景朱文帅李俐俐陈龙 (74)专利代理机构 重庆鼎慧峰合知识产权代理 事务所(普通合伙) 50236 代理人 周维锋 (51)Int.Cl. C07K 14/44(2006.01) C12N 15/30(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 33/02(2006。

2、.01) (54)发明名称 一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用 和疫苗 (57)摘要 本发明涉及一种微小隐孢子虫的CTL表位多 肽， 该多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。 还 提供码所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽的核 酸， 所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。 本发明微小隐孢子虫的CTL表位多肽P1， 与H-2Kb 分子或HLA-A*0201分子分别有很好的亲和力， 说 明具有相应的免疫学功能。 为制备微小隐孢子虫 疫苗提供一种新的方向， 且该多肽在C57BL/6N小 鼠脾细胞中多肽特异性CTL免疫反应中展现出优 异的刺激性反应， 在微小隐孢子虫特异性免疫治 疗领域有。

3、着巨大的开发应用潜力。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图4页 CN 109942693 A 2019.06.28 CN 109942693 A 1.一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽， 其特征在于， 该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.编码权利要求1所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽的核酸。 3.根据权利要求2所述的核酸， 其特征在于， 所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所 示。 4.含有权利要求2或3所述核酸的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组 病毒载体。 5.权利要求1所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽、 权利要求2或3所述核酸、 权利。

4、要求4所 述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体在制备微小隐孢子虫疫苗 中的应用。 6.一种微小隐孢子虫疫苗， 其特征在于， 所述微小隐孢子虫疫苗的活性成分为如下物 质中的至少一种： a.微小隐孢子虫的CTL表位多肽， 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示； b.编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示微小隐孢子虫的CTL表位多肽的核酸； c.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸； d.权利要求4所述的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体。 7.权利要求6所述的微小隐孢子虫疫苗， 其特征在于， 所述疫苗还包括一种或多种疫苗 佐剂。。

5、 8.权利要求1所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽、 权利要求2或3所述核酸、 权利要求4所 述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体在制备CD8+T淋巴细胞增 殖剂中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109942693 A 2 一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用和疫苗 技术领域 0001 本发明属于生物分子技术领域， 涉及一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用 和疫苗。 背景技术 0002 微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)隶属于顶复门(PhylumApicomplexa)的 孢子虫纲(ClassSporozoa)， 于191。

6、2年首次由Tyzzer报道并命名， 是一种重要的人畜共患性 原虫。 在已报道的31个人兽共患隐孢子虫种类中， 能感染人和大多数哺乳动物的是微小隐 孢子虫， 且微小隐孢子虫宿主最为广泛， 主要包括人、 牛科、 各种啮齿类哺乳动物、 骆驼科、 马科、 犬科、 非人灵长类和海洋哺乳动物及鱼。 据不完全统计， 自2004-2010年间， 世界多个 国家因水传或食物传播而引起的暴发性和散发性隐孢子虫病例已达数百起。 微小隐孢子虫 能够在环境中长期存活， 且一般的污水处理方法如过滤和次氯酸消毒等均不能有效杀死水 中的卵囊， 其卵囊在水环境中的稳定性和低感染剂量(少于10个卵囊)是水源隐孢子虫传染 的两个重。

7、要原因。 微小隐孢子虫感染是导致人和动物腹泻性疾病的重要病原之一， 每年大 约有800万五岁以下儿童死于由隐孢子虫感染导致的腹泻。 临床和流行病学调查结果显示， 微小隐孢子虫已成为艾滋病人常见的继发感染寄生性原虫之一， 长期的严重腹泻， 也是导 致营养不良和免疫功能不全的艾滋病病人死亡的重要因素之一。 另外， 微小隐孢子虫在家 畜中感染也很普遍,如微小隐孢子虫在断奶前犊牛中感染率高达19.5， 造成畜禽增长缓 慢、 免疫力减弱、 继发其他病原感染， 从而危害幼龄畜禽生命。 因此， 微小隐孢子虫的防控已 成为畜牧业、 公共卫生等领域的突出问题， 目前尚无防治隐孢子虫病的特效药物及疫苗。 0003。

8、 细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes， CTL)介导的特异性细胞免疫应 答在机体抗胞内微生物感染的过程中起着关键作用。 微小隐孢子虫卵囊感染细胞后， 其表 面GP15/40、 CP15、 CP23等蛋白在被感染细胞内经过一系列酶解过程， 降解为8-11个氨基酸 的多肽， 再与相应的主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex， MHC)I 类分子抗原多肽结合槽结合， 形成MHC I-抗原肽复合体， 并呈递于感染细胞表面。 MHC I-抗 原肽复合体(pMHCI)被表达于T细胞表面的受体(T cell receptor， 。

9、TCR)识别并与之结合。 细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可通过释放穿孔素或颗粒酶溶解胃肠道内感染细胞， 释放未成熟 的胞囊， 切断隐孢子虫在细胞内的繁殖， 从而有效控制了隐孢子虫的感染。 研究表明， 与体 液免疫应答相比， 细胞免疫应答在抗隐孢子虫感染中具有更重要的作用， 且CD4+T细胞和CD8 +T细胞在抗微小隐孢子虫(C.parvum)免疫中均具有重要作用。 如Pantenburg等在对人CD8+T 细胞清除肠上皮细胞内微小隐孢子虫感染的功能研究中发现， 人HLA 分子可通过呈递隐孢 子GP15蛋白的免疫优势表位， 激活CD8+T细胞免疫应答。 0004 在隐孢子虫的感染免疫过程中， 其表。

10、面蛋白GP15/40、 CP15和CP23蛋白都具有诱导 细胞免疫应答的能力， 其中CP15、 CP23蛋白在微小隐孢子虫(C.parvum)和人隐孢子虫 (C.hominis)基因型之间同源性高达95以上， 其序列相对保守， 可作为筛选保守T细胞表 位的靶蛋白。 另外,环子孢子样糖蛋白CSL(circumsporozoite-like glycoprotein)、 热休 说明书 1/7 页 3 CN 109942693 A 3 克蛋白HSP70及表面糖蛋白GP900作为隐孢子虫粘附和侵入宿主机体的重要蛋白， 也极有可 能成为预防和治疗隐孢子虫病的潜在靶标位点。 通过对微小隐孢子虫CTL表位的。

11、鉴定， 筛选 出相对保守的CTL表位， 为多肽疫苗的研究提供重要数据。 目前， 关于微小隐孢子虫CTL表位 研究最多的是人HLA-B和HLA-C基因型， 而对人的其他基因型如在人群中广泛表达的HLA-A* 0201分子和动物的MHC分子的研究均较少， 阻碍了关于微小隐孢子虫表位疫苗的研究和应 用。 发明内容 0005 有鉴于此， 本发明的目的之一在于提供一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽。 0006 为达到上述目的， 本发明提供如下技术方案： 0007 1.一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽， 该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0008 2.本发明还提供一种编码氨基酸序列如SEQ 。

12、ID NO.1所示微小隐孢子虫的CTL表 位多肽的核酸。 0009 进一步， 所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0010 3.本发明的目的之三在于提供含有核酸的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体， 所述核酸能编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示微小隐孢子虫的 CTL表位多肽。 0011 进一步， 所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0012 本发明的核酸可以是RNA形式(例如mRNA、 hnRNA、 tRNA或任意其它形式)， 也可以是 DNA形式(包括但不限于通过克隆或合成产生， 或其任意组合而产生的cDNA和基因组DNA)。

13、。 DNA可以是三链、 双链或单链， 或其任意组合。 DNA或RNA的至少一条链的任意部分可以是编 码链， 也称作有义链， 或可以是非编码链， 也称作反义链。 0013 4.技术方案1所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽、 技术方案2所述核酸、 技术方案3 所述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载体在制备微小隐孢子虫疫 苗中的应用。 0014 5.一种微小隐孢子虫疫苗， 所述微小隐孢子虫疫苗的活性成分为如下物质中的至 少一种： 0015 a.微小隐孢子虫的CTL表位多肽， 氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示； 0016 b.编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示微小。

14、隐孢子虫的CTL表位多肽的核酸； 0017 c.核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的核酸； 0018 d.技术方案3所述的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系、 重组菌或重组病毒载 体。 0019 进一步， 所述疫苗还包括一种或多种疫苗佐剂。 0020 本发明的微小隐孢子虫疫苗可通过注射、 喷射、 滴鼻、 滴眼、 渗透、 吸收、 物理或化 学介导的方法导入机体如肌肉、 皮内、 皮下、 静脉、 粘膜组织； 或是被其他物质混合或包裹后 导入机体。 0021 6.本发明还提供技术方案1所述微小隐孢子虫的CTL表位多肽、 技术方案2所述核 酸、 技术方案3所述重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞。

15、系、 重组菌或重组病毒载体在制备 CD8+T淋巴细胞增殖剂中的应用。 说明书 2/7 页 4 CN 109942693 A 4 0022 本发明的有益效果在于： 提供一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽P1， 该多肽与H- 2Kb分子或HLA-A*0201分子分别有很好的亲和力， 说明具有相应的免疫学功能。 为制备微小 隐孢子虫疫苗提供一种新的方向， 该多肽在C57BL/6N小鼠脾细胞中多肽特异性CTL免疫反 应中展现出优异的刺激性反应， 其所诱导CD8+T cell产生的IFN-gamma于各种阴性对照比 较， P0.001， 具有极显著性差异， 说明微小隐孢子虫的CTL表位多肽P1作为疫苗活性。

16、物质 能有效刺激机体反应， 并特异性分泌出IFN-gamma， 进一步对微小隐孢子虫有杀伤作用， 在 微小隐孢子虫特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。 附图说明 0023 为了使本发明的目的、 技术方案和有益效果更加清楚， 本发明提供如下附图进行 说明： 0024 图1为H-2Kb蛋白小量诱导表达的SDS-PAGE鉴定图； 0025 图2为m 2m蛋白小量诱导表达的SDS-PAGE鉴定图； 0026 图3为H-2Kb、 m 2m与多肽P1复性后分子筛层析结果及电泳； 0027 图4为HLA-A*0201、 m 2m与多肽P1复性后分子筛层析结果及电泳； 0028 图5为C57BL/6N小。

17、鼠脾细胞中各用8条多肽特异性CTL免疫反应的ELISPOT检测结 果； 0029 图6为C57BL/6N小鼠脾细胞中P1多肽特异性CTL免疫反应的ELISPOT检测结果， 另 外设置四个对照组： 无关多肽组， 还有佐剂组、 DMSO组， 阴性对照组。 具体实施方式 0030 以下结合附图对本发明的原理、 特征和优选实施例进行详细的描述， 所举实例只 用于解释本发明， 并非用于限定本发明的范围。 实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常 按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说 明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三。

18、次重复实 验， 结果取平均值。 0031 实施例1 0032 微小隐孢子虫Gp15蛋白CTL表位多肽的选择与合成。 0033 对微小隐孢子虫的主要致病蛋白和表面蛋白GP15、 GP40、 CSL、 GP900、 HSP70、 CP15 和CP23进行扫描， 选取氨基酸序列如SEQ ID No.1的多肽， 命名为P1， 其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No.2所示， 进行研究。 多肽P1来源于GP15蛋白， 采用固相多肽合成法(Fmoc/tBu 策略)合成多肽P1， 合成后用HPLC纯化， 其纯度为98。 0034 本发明首先应用生物信息学分析方法预测了H-2Kb、 H-2Db限制性多肽，。

19、 并从这些 表位中筛选了大量的多肽进行试验， 最后筛选出8条预测亲和力较强的8条多肽(peptide1- peptide8， peptide2为氨基酸序列如SEQ ID No.1的多肽， 命名为P1)， 合成后用HPLC纯化。 0035 实施例2 0036 用蛋白的折叠复性实验检测微小隐孢子虫CTL表位多肽与小鼠H-2kb和人HLA-A* 0201分子的结合能力 0037 一、 小鼠MHC I类分子(H-2Kb)和轻链 2m(mouse 2m， m 2m)包涵体蛋白的制备 说明书 3/7 页 5 CN 109942693 A 5 0038 将编码小鼠MHC I类分子重链(H-2kb)(C57B。

20、L/6N， GenBank No.XM_017317259.1) 胞外区氨基酸(氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示)的DNA分子(核苷酸序列如序列表 中SEQ ID No.4所示)插入到原核表达质粒pET-21a(+)酶切位点Nde I和Xho I之间， 得到重 组表达质粒， 命名为pET-21a(+)/H-2kb。 0039 将构建的pET-21a(+)/H-2Kb重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(ED3)感受态细胞， 37培养过夜， 利用氨苄青霉素(Amp)抗性筛选重组转化体。 分别挑取阳性重组菌(命名为 BL21(ED3)/H-2Kb)的单菌落， 接种于100mL含Amp的L。

21、B培养基中。 37震荡培养后， 0040 按照1:100稀释接种于含有2L新鲜LB培养基的三角瓶中， 37、 200rpm振摇培养至 对数生长期(OD6000.40.6)。 取出1mL菌悬液， 4000rpm离心3min， 弃去上清， 用50 L上样 缓冲液重悬细菌沉淀， -20冻存备用。 然后在培养基中加入IPTG至终浓度为1mmol/L， 诱导 培养4个小时后取出1mL， 4000rpm离心3min收集菌体， 弃上清后加入5SDS上样缓冲液， 与 诱导前采集的培养样品(对照)同时煮沸5min， 用12的聚丙烯酰胺凝胶电泳检查表达情 况。 结果证实， 含重组表达质粒的表达菌BL21(ED3)。

22、/H-2Kb经诱导后可表达SEQ ID No.3所 示的蛋白， 将其命名为H-2Kb。 H-2Kb蛋白小量诱导表达SDS-PAGE电泳图如图1所示。 0041 二、 将经上述12的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的BL21(ED3)/H-2Kb的菌液， 继续培 养， 将培养好的菌液移入300mL的离心管中， 45000rpm离心10min弃上清。 收集菌体加适量 PBS缓冲液重悬菌体， 超声破碎细胞， 超声6sec， 间隔10sec， 共99次， 功率200400之间。 超 声裂解完转入50mL离心管， 11000rpm离心30min， 用玻棒轻轻划去上层的细胞碎片(沉淀上 层密度较低的都是细胞碎片)，。

23、 然后倒掉上清液。 洗涤缓冲液重悬， 量不定， 视包涵体多少而 定， 一般35mL， 超声4sec， 间隔10s， 30次， 重复上述步骤2次。 重悬缓冲液重悬混匀， 11000rpm 离心30min， 吹去沉淀上的碎片。 所得的小鼠MHC I类分子重链H-2Kb包涵体蛋白， 溶解于盐 酸胍溶液中， 其浓度为30mg/ml。 0042 采用与获得小鼠MHC I类分子H-2kb包涵体蛋白相同的方法得到包含小鼠MHC I类 分子轻链 2m(mouse 2m， m 2m)， 将其成熟肽基因的1-98位氨基酸(氨基酸序列如序列表中 SEQ ID No.5所示)的DNA(核苷酸序列如序列表中SEQ ID。

24、 No.6所示)插入到原核表达质粒 pET-21a(+)酶切位点Nde I和Xho I之间， 得到重组表达质粒， 命名为pET-21a(+)/m 2m。 含 重组表达质粒的表达菌BL21(ED3)/pET-21a(+)/m 2m经诱导后可表达SEQ ID No.5所示的 蛋白， 将其命名为m 2m。 最后得到包涵体蛋白溶解于盐酸胍溶液中， 将其命名为m 2m， 其包 涵体浓度为30mg/ml。 m 2m蛋白小量诱导表达SDS-PAGE电泳图如图2所示。 0043 三、 H-2kb、 m 2m和肽的折叠复性 0044 将小鼠MHC I类分子重链(H-2Kb)和轻链(m 2m)的包涵体蛋白以及多肽。

25、P1按照摩 尔比1:1:3的比例加入包涵体复性试剂(Refolding Buffer)中。 具体过程如下所述： 0045 (1)将包涵体复性试剂(一般500ml体系， 具体视复性效果而定)置于4冰箱(或冷 库中)预冷。 复性过程均在4条件下进行(4冰箱或冷库)。 (2)将盛有包涵体复性试剂的 烧杯置于磁力搅拌器上， 加入磁力转子， 设置合适的搅拌速度(60rpm为宜)。 (3)取1mL盐酸 胍溶解后的m 2m包涵体(30mg/ml)加入注射器内， 使之缓慢滴入包涵体复性试剂内， 慢慢搅 拌6-8h。 (4)将5mg多肽P1溶解在200 L DMSO中， 然后用移液器直接加入到包涵体复性试剂 中。

26、。 (5)慢慢搅拌30min后， 于注射器内加入3mL H-2kb包涵体(30mg/ml)， 慢慢搅拌8-12h。 可 适当延长作用时间。 说明书 4/7 页 6 CN 109942693 A 6 0046 四、 复合物蛋白的浓缩 0047 复性结束后， 在4冰箱或冷库中小心将复性液移至压力搅拌式浓缩杯中， 采用氮 气提供压力， 在10kDa超滤膜上的浓缩溶液至体积约为30mL时加入120mL预冷的分子筛缓冲 液。 最后浓缩至30mL左右时将溶液转移至50mL离心管中， 4， 12000rpm离心15min除去沉 淀， 将上清转移至10KD蛋白浓缩管中， 4， 2400rpm进一步浓缩至2-5。

27、ml。 如果复性后复性液 变得浑浊， 可低温离心去除沉淀后， 再用压力搅拌式浓缩杯浓缩。 0048 五、 复合物蛋白的分子筛层析 0049 用分子筛缓冲液平衡Superdex 200 16/60HiLoad凝胶层析柱。 平衡好后(一般 1ml/min， 需2h)， 将浓缩并换液完毕之后的复合物蛋白样品离心除去沉淀(4， 12000rpm， 10min)， 用分子筛缓冲液洗涤快速蛋白液相色谱仪(FPLC)的上样泵后， 取上清注入。 在层析 柱上以适当的流速运行(一般1ml/min)， 根据分子筛层析的结果检测复性效果， 将相应分子 量的蛋白峰收集， 并经SDS-PAGE鉴定。 0050 结果如图。

28、3所示， 图3为H-2Kb、 m 2m与多肽P1(H-Kb分子量约32KD， m 2m 10KD左右， P1只是一个短肽， 可忽略不计)复性后分子筛层析结果。 其中， A1为H-2Kb、 m 2m与多肽P1复 性后分子筛层析图； A2为分子筛层析后收集的蛋白峰SDS-PAGE鉴定结果， 标号与峰标号相 对应； 蛋白层析在280nm的紫外吸收条件下共出现2个主峰， 收集峰值处的蛋白用15SDS- PAGE电泳分析， 结果显示在82mL洗脱体积处的峰1为H-2kb/P1/m 2m复合体单体， 蛋白分子 量约为42kDa； 第二个主峰(峰2)在105mL洗脱体积左右， 为m 2m蛋白。 0051 采。

29、用相同的方法将人MHC I类分子重链(HLA-A*0201)和轻链(m 2m)的包涵体蛋白 以及多肽P1按照摩尔比1:1:3的比例加入包涵体复性试剂(Refolding Buffer)中， 经复性、 浓缩、 分子筛层析鉴定， 证明HLA-A*0201也能与P1多肽结合(结果见如图4)。 图4为HLA-A* 0201、 m 2m与多肽P1复性后分子筛层析结果。 其中， A1为HLA-A*0201、 m 2m与多肽P1复性后 分子筛层析图； A2为分子筛层析后收集的蛋白峰SDS-PAGE鉴定结果标号与峰标号相对应； 蛋白层析在280nm的紫外吸收条件下共出现2个主峰， 收集峰值处的蛋白用15SDS。

30、-PAGE电 泳分析， 结果显示在82mL洗脱体积处的峰1为HLA-A*020/P1/m 2m复合体单体， 蛋白分子量 约为42kDa； 第二个主峰(峰2)在105mL洗脱体积左右， 为m 2m蛋白(约10KDa)。 0052 由分子筛层析结果可表明H-2Kb分子、 HLA-A*0201分子分别与多肽P1有很好的亲 和力， 具有相应的免疫学功能。 0053 实施例3 0054 用ELISPOT方法检测微小隐孢子虫CTL表位多肽免疫小鼠后的特异性CTL免疫应 答。 0055 MHC I/抗原肽复合体是激活特异性CTL免疫应答的关键因素。 C57BL/6N小鼠MHC遗 传背景清晰， 可作为研究微小。

31、隐孢子虫细胞免疫应答的实验动物模型。 Rasmussen等研究表 明， C57BL/6N小鼠(其MHC基因型为： H-2Kb,H-2Db)在接种106个微小隐孢子虫卵囊后， 在整 个实验期间均保持感染状态， 说明该品系小鼠与隐孢子虫的抗性和易感性有关。 且H-2Kb限 制性表位与在人群中广泛表达的HLA-A*0201分子的表位具有相似的锚定残基。 因此， 以 C57BL/6N小鼠为宿主筛选禽流感病毒CTL表位， 则会为抗人微小隐孢子虫多肽疫苗的研究 提供可靠依据。 0056 一、 实验动物免疫 说明书 5/7 页 7 CN 109942693 A 7 0057 用实施例1制备的多肽P1(使用弗。

32、氏完全佐剂乳化)免疫四周龄C57BL/6N小鼠。 共 免疫3次， 第一次免疫后7天进行第二次免疫， 初次免疫使用弗氏完全佐剂， 第二次和第三次 免疫使用弗氏不完全佐剂。 每次的免疫剂量均为100ug多肽P1/只， 免疫组小鼠初次免疫前 灌胃2*106个微小隐孢子虫卵囊。 第三次免疫后一周分离小鼠脾脏淋巴细胞， 并进行细胞计 数。 0058 二、 小鼠脾脏细胞的分离 0059 颈椎脱臼法处死小鼠， 放入75酒精中， 备用； 分离脾脏， 用镊子慢慢剥离脾脏； 将 分离的脾脏加入RPMI-1640培养基中， 用注射器头， 采用40um的细胞筛进行研磨； 将研磨液 慢慢吸入离心管中， 1500rpm(。

33、350-400g)/min， 4离心5min， 离心后弃上清， 用食指轻弹剩 余液体4-5次， 将细胞悬起； 加入细胞裂解液10ml， 室温裂解10min， 1500rpm离心5min； 用 RPMI-1640培养基洗涤细胞1-2次， 去除红细胞和结缔组织； 离心后将上清小心移至新的 15ml离心管中， 取10ul细胞计数(显微镜下观察成亮的圆形白点)。 0060 三、 小鼠CD4和CD8细胞的分离 0061 磁珠分离试剂如下: 0062 MojoSort Mouse CD4T Cell Isolation Kit,厂家:Biolegend货号:480006。 0063 MojoSort Mo。

34、use CD8T Cell Isolation Kit,厂家:Biolegend货号:480008。 0064 用Molosort Buffer重悬细胞， 300g离心5min； 将100ul细胞悬液(107cells)与 10ul Biotin-Antibody Cocktail混匀， 至冰上孵育15min(流式管中)； 重悬细胞加入10ul Streptavidin Nanobeads混匀至冰上15min； 加入2.5ml mojosort Buffer； 将流式管置于 磁铁中5min； 将目标细胞倒入新的15ml管中， 离心并进行细胞计数。 0065 四、 小鼠H-2b特异性CTL免疫应。

35、答检测 0066 ELISPOT筛选用的是Mouse IFN-gamma ELISpotPLUS(HRP),厂家:MabTech,货号 3321-4HPT-2。 0067 取制备好的淋巴细胞和分离的CD4和CD8的淋巴细胞(约106cells)， 铺板于处理好 的ELISPOT板中， 加入多肽刺激物(10ug/ml)， 并分别设阳性对照(ConA)、 阴性对照(不加多 肽)和空白对照(空白培养基)； 置于37CO2培养基中培养12-48h， 在培养期间不能移动 ELISPOR平板； 培养结束后， 弃掉细胞， 用PBS洗涤5遍， 每孔加入200ul； 加入生物素化抗体 (1ug/ml),37孵育。

36、2h； PBS洗涤5次， 加入HRP-Streptavidin后于37孵育1h， PBS洗涤5次 后加入底物显色； 室温晾干后于ELISpot读数机上读数， 结果见图5和图6。 0068 图5为间接体内ELISPOT鉴定隐孢子虫表位的结果。 其中， 横坐标为8条多肽(本发 明所述的多肽P1和另外一起实验的7条多肽， peptide1-peptide8)和阴性对照(未加入多肽 刺激的细胞， control without peptide)、 Native小鼠脾细胞对照(即没有灌胃微小隐孢子 虫卵囊的小鼠脾细胞， Nagative control)和空白对照(空白培养基， blank contro。

37、l)， 纵坐 标为斑点形成细胞数量， 以斑点形成细胞(spot forming cells)SFC/106表示。 0069 图6再次将图5中免疫应答效果最好的多肽P1多肽进行了小鼠体内免疫， 进一步通 过直接体内ELISPOT鉴定隐孢子虫表位。 动物多肽免疫后， 分离脾细胞， 使用MojoSort Mouse CD8+T cell Isolation kit磁珠分选CD8+T细胞， 实验分5个组进行， 包括多肽P1组， 无关多肽组(irrelevant peptide control， 无关多肽用的是选自H1N1型流感病毒蛋白的 表位多肽)， 佐剂组(adjuvant control)， DM。

38、SO组(DMSO group control)， 阴性对照组 说明书 6/7 页 8 CN 109942693 A 8 (Nagative control， 小鼠仅灌胃隐孢子虫卵囊， 没有免疫过程)。 横坐标代表5个组别， 纵坐 标为斑点形成细胞数量， 以斑点形成细胞(spot forming cells)SFC/106表示。 0070 从图5、 图6可以看出， 多肽P1能刺激CD8+T细胞产生很良好的免疫应答反应， 各对 照组几乎没有或少量特异性IFN-分泌， 实验组多肽P1能引起很强的特异性IFN-分泌， 同各种阴性或其他多肽相比， *代表P0.001(P0.05认为为差异具有统计学意义，。

39、 P 0.001表示具有极显著差异)， 说明具有5显著性差异。 说明多肽P1可以在体内激起较强的特 异性T细胞免疫反应， 可以对微小隐孢子虫产生杀伤作用。 0071 本发明的微小隐孢子虫的CTL表位多肽P1可以作为活性成分， 和药学上可接受的 载体组成组合物， 或者， 与其它具有药理活性的提取物和/或合成药物和药学上可接受的载 体组成组合物， 再按照药学领域的常规方法制成多肽P1表达阳性微小隐孢子虫的防疫性或 治疗性多肽疫苗， 在微小隐孢子虫特异性免疫治疗领域有着巨大的开发应用潜力。 0072 最后说明的是， 以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通 过上述优选实施例已经对本。

40、发明进行了详细的描述， 但本领域技术人员应当理解， 可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。 说明书 7/7 页 9 CN 109942693 A 9 序列表 周口师范学院 一种微小隐孢子虫的CTL表位多肽及其应用和疫苗 6 SIPOSequenceListing 1.0 1 10 PRT 人工序列(Artificial Sequence) 1 Ser Val Phe Ala Ile Phe Ala Ala Ile Phe 1 5 10 2 30 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 tcggtattcg cgagattc。

41、gc cgcaatcttt 30 3 275 PRT 小鼠(Mus musculus) 3 Gly Pro His Ser Leu Arg Tyr Phe Val Thr Ala Val Ser Arg Pro Gly 1 5 10 15 Leu Gly Glu Pro Arg Tyr Met Glu Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Glu 20 25 30 Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Glu Asn Pro Arg Tyr Glu Pro Arg 35 40 45 Ala Arg Trp Met Glu Gln Glu Gly Pr。

42、o Glu Tyr Trp Glu Arg Glu Thr 50 55 60 Gln Lys Ala Lys Gly Asn Glu Gln Ser Phe Arg Val Asp Leu Arg Thr 65 70 75 80 Leu Leu Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Lys Gly Gly Ser His Thr Ile Gln 85 90 95 Val Ile Ser Gly Cys Glu Val Gly Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly 100 105 110 Tyr Gln Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Cys 。

43、Asp Tyr Ile Ala Leu Asn Glu 序列表 1/3 页 10 CN 109942693 A 10 115 120 125 Asp Leu Lys Thr Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Leu Ile Thr Lys 130 135 140 His Lys Trp Glu Gln Ala Gly Glu Ala Glu Arg Leu Arg Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Lys Asn Gly Asn 165 170 1。

44、75 Ala Thr Leu Leu Arg Thr Asp Ser Pro Lys Ala His Val Thr His His 180 185 190 Ser Arg Pro Glu Asp Lys Val Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe 195 200 205 Tyr Pro Ala Asp Ile Thr Leu Thr Trp Gln Leu Asn Gly Glu Glu Leu 210 215 220 Ile Gln Asp Met Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr 225 2。

45、30 235 240 Phe Gln Lys Trp Ala Ser Val Val Val Pro Leu Gly Lys Glu Gln Tyr 245 250 255 Tyr Thr Cys His Val Tyr His His Gly Leu Pro Glu Pro Leu Thr Leu 260 265 270 Arg Trp Glu 275 4 840 DNA 小鼠(Mus musculus) 4 catatgggcc cacactcgct gaggtatttc gtcaccgccg tgtcccggcc cggcctcggg 60 gagccccggt acatggaagt c。

46、ggctacgtg gacgacacgg agttcgtgcg cttcgacagc 120 gacgcggaga atccgagata tgagccgcgg gcgcggtgga tggagcagga ggggcccgag 180 tattgggagc gggagacaca gaaagccaag ggcaatgagc agagtttccg agtggacctg 240 aggaccctgc tcggctacta caaccagagc aagggcggct ctcacactat tcaggtgatc 300 tctggctgtg aagtggggtc cgacgggcga ctcctccgcg。

47、 ggtaccagca gtacgcctac 360 gacggctgcg attacatcgc cctgaacgaa gacctgaaaa cgtggacggc ggcggacatg 420 gcggcgctga tcaccaaaca caagtgggag caggctggtg aagcagagag actcagggcc 480 tacctggagg gcacgtgcgt ggagtggctc cgcagatacc tgaagaacgg gaacgcgacg 540 ctgctgcgca cagattcccc aaaggcccat gtgacccatc acagcagacc tgaagata。

48、aa 600 gtcaccctga ggtgctgggc cctgggcttc taccctgctg acatcaccct gacctggcag 660 ttgaatgggg aggagctgat ccaggacatg gagcttgtgg agaccaggcc tgcaggggat 720 ggaaccttcc agaagtgggc atctgtggtg gtgcctcttg ggaaggagca gtattacaca 780 序列表 2/3 页 11 CN 109942693 A 11 tgccatgtgt accatcacgg gctgcctgag cccctcaccc tgagatgg。

49、ga gtaactcgag 840 5 99 PRT 小鼠(Mus musculus) 5 Met Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro 1 5 10 15 Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr Gln Phe His 20 25 30 Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro 35 40 45 Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Ph。

50、e Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr 50 55 60 Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala 65 70 75 80 Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp 85 90 95 Asp Arg Asp 6 306 DNA 小鼠(Mus musculus) 6 catatgatcc agaaaacccc tcaaattcaa gtatactcac gccacccacc ggagaatggg 60 aa。