曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用.pdf

《曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《曲霉菌分种检测的引物探针组合、试剂盒、检测方法及其应用.pdf（26页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910375749.7 (22)申请日 2019.05.07 (71)申请人 丹娜 （天津） 生物科技有限公司 地址 300467 天津市滨海新区生态城中天 大道2018号生态科技园办公楼14号楼 （3B） 1楼101室-2 (72)发明人 王志贤阎香言盛长忠周泽奇 粟艳 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(。

2、2006.01) C12R 1/68(2006.01) C12R 1/67(2006.01) C12R 1/685(2006.01) C12R 1/66(2006.01) (54)发明名称 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、 试剂 盒、 检测方法及其应用 (57)摘要 本发明提供了一种曲霉菌分种检测的引物 探针组合、 试剂盒、 检测方法及其应用， 所述曲霉 菌分种检测的引物探针组合， 包括分别针对烟曲 霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉的特异性引物、 检测 探针以及互补探针， 所述互补探针与检测探针不 完全互补配对。 本发明的引物探针组合一次检测 确定是否为曲霉菌感染， 能够在同一荧光通道里 同时。

3、区分烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉。 权利要求书2页 说明书12页 序列表6页 附图5页 CN 109943662 A 2019.06.28 CN 109943662 A 1.一种曲霉菌分种检测的引物探针组合， 其特征在于， 包括分别针对烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉的特异性引物、 检测探针以及互补探针， 所述互补探针与检测探针不完全 互补配对。 2.根据权利要求1所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述烟曲霉的特异性引物的核苷 酸序列如SEQ ID NO.1-2所示， 所述黄曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所 示， 所述黑曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ 。

4、ID NO.5-6所示， 所述土曲霉的特异性引 物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-8所示； 优选地， 所述烟曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示， 黄曲霉的检测探针 的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示， 黑曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所 示， 土曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示； 优选地， 所述烟曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示， 黄曲霉的互补探 针的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示， 黑曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所 示， 土曲霉的互补探针的核苷酸序列如SE。

5、Q ID NO.16所示； 优选地， 所述引物探针组合还包括内参系统； 优选地， 所述内参系统包括内参引物和内参探针； 优选地， 所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示； 优选地， 所述内参探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。 3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合， 其特征在于， 所述烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉 和土曲霉的检测探针的3 端修饰有淬灭基团， 5 端修饰有荧光基团； 优选地， 所述荧光基团包括ALEX-350、 Alexa Fluor 488、 CY3、 FAM、 VIC、 TET、 CALGold540、 JOE、 HEX、 CALFluor。

6、Orange560、 TAMRA、 CALFluorRed590、 ROX、 CALFluorRed610、 TexasRed、 CALFluorRed635、 Quasar670、 CY5、 CY5.5、 LC RED640或Quasar705中的任一种或 至少两种的组合； 优选地， 所述检测探针3 端修饰的淬灭基团包括TAMRA、 DABCYL、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3或 Eclipse中的任一种或至少两种的组合； 优选地， 所述互补探针的3 端修饰有淬灭基团； 优选地， 所述互补探针3 端修饰的淬灭基团包括TAMRA、 DABCYL、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-。

7、3或 Eclipse中的任一种或至少两种的组合。 4.一种曲霉菌分种检测的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项 所述的引物探针组合。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阴性质控、 阳性质控 和辅助试剂； 优选地， 所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒， 所述拟南芥DNA片段的核苷酸序 列如SEQ ID NO.20所示； 优选地， 所述阳性质控分别为含有烟曲霉DNA片段的质粒、 含有黄曲霉DNA片段的质粒、 含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒； 优选地， 所述烟曲霉DNA片段、 黄曲霉DNA片段、 黑曲霉DNA片段和土。

8、曲霉DNA片段的核苷 酸序列分别如SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.22、 SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示； 优选地， 所述辅助试剂包括Taq酶、 dNTP、 MgCl2、 DMSO和缓冲液； 权利要求书 1/2 页 2 CN 109943662 A 2 优选地， 所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl； 优选地， 所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM； 优选地， 所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM。 6.一种利用如权利要求4或5所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测的方法， 其特征在于， 所述方法包括如下步骤： (1)提取样本DNA；。

9、 (2)向步骤(1)样本DNA中加入Taq酶、 dNTP、 MgCl2、 DMSO、 缓冲液以及如权利要求1-3任一 项所述的引物探针组合； (3)实时荧光PCR反应。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)所述DNA样本的终浓度为0.1pg- 10ng； 优选地， 步骤(2)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U； 优选地， 步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M； 优选地， 步骤(2)所述DMSO的体积百分比为1-8， 优选为5； 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的特异性引物的终浓度为50-500nM； 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的检测探针的终浓度为50-50。

10、0nM； 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的互补探针的终浓度为50-500nM。 8.根据权利要求6或7所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)所述实时荧光PCR反应的条件 为： (1 )90-98预变性， 1-2min， 1个循环； (2 )90-98变性10s， 55-60延伸35-45s， 40-50个循环； (3 )35-97升温， 1个循环。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 步骤(1 )之前还包括预热的过程： 50， 2min， 1个循环； 优选地， 步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤： (1” )50预热2min， 1个循环； (2” )95预变性10m。

11、in， 1个循环； (3” )95变性10s， 58延伸40s， 延伸时采集荧光信号， 45个循环； (4” )955s， 351min； 升温到97， 0.2/s， 连续采集荧光信号， 5次/； 优选地， 步骤(2)所述判断的标准为： (a)若检测通道的Ct值不大于35， 则为阳性结果， 若检测通道的Ct值大于35， 则为阴性 结果； (b)对阳性结果进一步分析， 通过熔解曲线分析， 比对产物与四种阳性质控的对应退火 温度Tm值， Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的曲霉菌种。 10.一种如权利要求1-3任一项所述的引物探针组合和/或如权利要求4或5所述的试剂 盒用于曲霉菌分种检测或。

12、制备曲霉菌分种检测的试剂中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 109943662 A 3 一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、 试剂盒、 检测方法及其 应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及一种曲霉菌分种检测的引物探针组合、 试剂盒、 检 测方法及其应用， 具体涉及一种烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉分种检测的引物探针组 合、 试剂盒、 检测方法及其应用。 背景技术 0002 曲霉菌属于条件致病菌， 广泛存在于生活环境中， 其可产生分生孢子随呼吸进入 机体， 主要侵染肺部、 皮肤或粘膜。 常见的病原菌有烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉、 土曲霉等。 0003 目前对于曲霉菌。

13、的检测方法主要为： (1)病原体培养鉴定， 取患处的标本做涂片或 培养， 涂片可见菌丝或曲霉菌孢子， 培养见曲霉菌生长， 曲霉菌为常见污染菌， 须反复涂片 或培养， 多次阳性且为同一菌种才有诊断价值， 培养周期长。 (2)病理组织检查， 取受损组织 或淋巴结活检， 根据真菌形态确诊， 但该方法为有创检查， 患者接受度较差。 (3)免疫学检 查， 半乳甘露聚糖为曲霉菌细胞壁中的高度特异性和保守性的多糖， 可作为检测曲霉菌的 分子标志物， 通过ELISA方法进行检测， 但该方法灵敏度不高， 不能区分菌种。 (4)实时荧光 PCR法， 通过引物和探针的组合提高检测特异性， 为临床诊断提供依据。 现有。

14、方法检测周期 长， 不利于临床诊断用药。 虽然已有多种抗真菌药物， 但针对各种曲霉菌的治疗方案相同， 无法实现针对特定菌种的精准治疗。 0004 CN108070675A公开了一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量PCR试剂 盒， 属于病原微生物体外分子检测技术领域。 该发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三 种曲霉的引物探针组合， 所述曲霉包括烟曲霉、 黄曲霉和黑曲霉。 但该发明只能检测出样本 中含有烟曲霉、 黄曲霉或黑曲霉中的任意一种或其组合， 无法检测确定具体菌种， 且该方法 无法诊断土曲霉的存在。 0005 CN106755379A公开了一种基于二聚体突变引物建立的荧光定量PC。

15、R方法定量检测 4中曲霉菌并同步进行基因分型的方法， 该检测方法包括1)提取待检测样品及4种标准菌株 中的DNA； 2)制备阳性质粒标准品； 3)运行荧光定量PCR； 4)数据分析。 该发明还提供一种烟 曲霉菌、 黑曲霉菌、 黄曲霉菌和土曲霉菌同步定量和基因分型的检测试剂盒， 该试剂盒包括 标记有荧光报告基团的上游引物、 淬灭基团标记的上游引物互补链及下游引物。 但该发明 的引物设计有荧光基团， 影响荧光定量PCR的扩增； 其次， 该产物熔解曲线温度过高， 曲霉菌 的种间退火温度差异过小， 曲霉菌分型鉴定的灵敏度和特异性不高； 最后， 仅通过普通引物 无探针配合， 且互补引物还设计有突变位点，。

16、 导致扩增非特异性产物， 方法特异性不佳。 0006 CN101038254A公开了一种试剂盒特异性扩增曲霉菌ITS I区间的基因， 产物大小 为79bp， 能快速准确地检测出常见的多种致病曲霉菌(如烟曲霉、 黄曲霉、 土曲霉、 黑曲霉和 构巢曲霉)。 但该发明无法检测曲霉菌的种间差异。 0007 CN102321738A公开了一种曲霉菌的荧光定量PCR检测通用引物， 检测探针和检测 试剂盒， 通过一对通用引物以及4条特异性探针鉴别烟曲霉、 黄曲霉、 土曲霉和黑曲霉。 虽然 说明书 1/12 页 4 CN 109943662 A 4 能检测曲霉菌的种间差异， 但该方法需要四个荧光通道进行分析，。

17、 增加实验周期和成本。 0008 因此， 提供一种特异性好、 灵敏度高、 能区分曲霉菌种的简便方法具有重要意义。 发明内容 0009 针对现有技术的不足及实际的需求， 本发明提供一种曲霉菌分种检测的引物探针 组合、 试剂盒、 检测方法及其应用， 一次检测确定是否为曲霉菌感染， 能够在同一荧光通道 里同时区分烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉。 0010 为达此目的， 本发明采用以下技术方案： 0011 第一方面， 本发明提供一种曲霉菌分种检测的引物探针组合， 包括分别针对烟曲 霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉的特异性引物、 检测探针以及互补探针， 所述互补探针与检测 探针不完全互补配对。 001。

18、2 本发明中， 采用多重PCR同时扩增侵袭性曲霉菌属中常见的烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲 霉、 土曲霉的特异靶序列， 再通过特殊设计的Taqman探针熔解曲线分析鉴定， 实现对于四种 常见的侵袭性曲霉菌多重检测， 本发明的引物探针组合特异性好， 灵敏度高， 实现曲霉菌的 菌种间分种检测。 0013 本发明中， 检测探针与互补探针不完全互补配对， 不互补的碱基位置不位于检测 引物的5 端或3 端的5个碱基序列内， 不互补的位置不能是连续的。 按照最邻近法的Tm值计 算公式计算不完全互补的检测探针和互补探针的Tm值。 公式如下： TmH*/(S*+RlnCT)， 其中H*、 S*分别为杂交反应的标准焓。

19、变和熵变， R为气体常数1.987cal/kmol、 CT为DNA分 子的摩尔浓度(当DNA分子为非对称序列时， 其摩尔浓度取CT/4)分别是， 利用该公式设计得 到设计的检测探针和互补探针的Tm值的探针， 进而设计出一系列可以通过Tm值明确区分的 互补探针和检测探针组合， 从而实现在同一荧光通道中通过不同Tm值区分不同曲霉菌。 0014 优选地， 所述烟曲霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示， 所述黄曲 霉的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示， 所述黑曲霉的特异性引物的核苷酸 序列如SEQ ID NO.5-6所示， 所述土曲霉的特异性引物的核苷酸序列。

20、如SEQ ID NO.7-8所 示。 0015 在同一反应体系中同存多对引物和探针， 检测不同目标序列， 需要平衡各种序列 之间的稳定性、 反应条件、 扩增效率， 随着检测菌种的数量递增， 引物探针组合设计的难度 显著提高， 受到多种条件的制约， 本发明中， 通过针对烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉、 土曲霉的多 重序列比对， 设计特异性引物， 使得多重引物能稳定存在于同一反应体系中， 且扩增效率一 致， 提高检测特异性与灵敏度， 避免引物间的交叉影响。 0016 优选地， 所述烟曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示， 黄曲霉的检测 探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，。

21、 黑曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.11 所示和土曲霉的检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。 0017 本发明中， 通过ClustaX比对NCBI上大量核酸序列， 比对菌种范围包括： 比对的菌 种范围包括烟曲霉AJ853744.1、 AB197939.1、 LC228654.1、 LC171332.1、 LN832990.1等264条 序列； 黄曲霉AJ853764.1、 LT594458.1、 LC133097.1、 LC133096.1、 LN832989.1等351条序列； 黑曲霉AJ853742.1、 AJ280006.1、 LC133093.1、 LN。

22、832991.1、 LM653115.1等168条序列； 土曲 霉AB661667.1、 FN645432.1、 LN832993.1、 HG964331.1、 LC317459.1等160条序列， 通过比对 说明书 2/12 页 5 CN 109943662 A 5 上述943条序列， 可以最大程度获得曲霉菌种内高保守区， 得到不同临床分离株的高保守区 和可变区， 进而指导引物设计位置， 提高对不同菌种的不同分离株的敏感性， 目标序列的选 择对引物探针组合的设计至关重要， 需要同时满足不同引物、 探针之间的稳定性、 扩增效率 一致、 检测特异性、 灵敏度， 同时还要满足反应条件的一致性， 检。

23、测的曲霉菌种数越多， 需要 考虑的因素越多， 同时设计真对四种曲霉菌种检测的引物探针组合并不等同于真对单一菌 种的引物探针的组合。 0018 本发明中， 在待测四种曲霉菌特异靶序列的区域， 优选18S rRNA、 28S rRNA序列区 域， 分别设计并制备四条Taqman探针和四条其互补序列， 以及检测探针序列外围分别设计 一对引物序列， 包括一条上游引物和一条下游引物。 用设计的引物对特异性靶点进行单重 或多重单色或多重多色实时荧光定量PCR扩增反应。 0019 优选地， 所述烟曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示， 黄曲霉的互 补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.。

24、14所示， 黑曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示和土曲霉的互补探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。 0020 本发明中， 针对四种不同曲霉菌的检测探针分别设计一条互补探针， 所述互补探 针与检测探针不完全互补配对可以形成双链探针， 使得针对不同曲霉菌种的双链探针有不 同的熔解性， 可以通过其特征熔化温度(Tm)区分四种不同曲霉菌。 0021 优选地， 所述引物探针组合还包括内参系统。 0022 优选地， 所述内参系统包括内参引物和内参探针。 0023 优选地， 所述内参引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.17-18所示。 0024 优选地， 所述内参探针的核。

25、苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。 0025 优选地， 所述烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉的检测探针的3 端修饰有淬灭基 团， 5 端修饰有荧光基团。 0026 优选地， 优选地， 所述荧光基团包括ALEX-350、 Alexa Fluor 488、 CY3、 FAM、 VIC、 TET、 CALGold540、 JOE、 HEX、 CALFluorOrange560、 TAMRA、 CALFluorRed590、 ROX、 CALFluorRed610、 TexasRed、 CALFluorRed635、 Quasar670、 CY5、 CY5.5、 LC RED640或 Quas。

26、ar705中的任一种或至少两种的组合。 0027 本发明中， 针对不同曲霉菌种的检测探针的5 端均修饰有荧光基团， 其可以为相 同的荧光基团也可以为不同的荧光基团， 当修饰有相同荧光基团时， 本发明设计的引物探 针组合可以在同一荧光检测通道中进行检测分析， 根据所述检测探针和互补探针形成的双 链探针的熔解温度不同， 在实时荧光定量PCR扩增反应后进行熔解曲线分析， 根据Taqman探 针熔点的变化来判断待检测样品中是否存在四种致病曲霉菌的一种或多种并通过Tm值-菌 种标准对照表鉴定待测样品中的曲霉菌菌种， 即进行多重单色实时荧光定量PCR反应； 当修 饰有不同荧光基团时， 也可以进行多重多色实。

27、时荧光定量PCR反应； 此外， 单独使用针对四 种曲霉菌种的某一种进行检测同样可行， 即单重单色实时荧光定量PCR反应。 0028 优选地， 所述检测探针3 端修饰的淬灭基团包括TAMRA、 DABCYL、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。 0029 针对不同的曲霉菌， 所用的荧光基团和淬灭基团可以是相同的， 也可以是不同的， 但不同的荧光基团所需要的荧光检测通道需要不同， 且所选择的不同荧光基团的激发光和 吸收光光谱范围需要避免干扰。 优选地， 检测不同曲霉菌的探针修饰的荧光基团和淬灭基 说明书 3/12 页 6 CN 109943662 A。

28、 6 团为同一组。 0030 所述荧光基团和淬灭基团的组合典型非限定地可以是荧光基团FAM和淬灭基团 TAMRA； 荧光基团HEX淬灭基团BHQ-1； 荧光基团ROX和淬灭基团BHQ-2； 荧光基团CY5和淬灭基 团BHQ-3， 优选为为荧光基团FAM和淬灭基团TAMRA。 0031 优选地， 所述互补探针的3 端修饰有淬灭基团。 0032 优选地， 所述互补探针3 端修饰的淬灭基团包括TAMRA、 DABCYL、 BHQ-1、 BHQ-2、 BHQ-3或Eclipse中的任一种或至少两种的组合。 0033 优选地， 所述互补探针和检测探针地淬灭基团相同。 探针的淬灭基团与互补序列 的淬灭基团。

29、也可不同， 但需要匹配荧光基团的光谱波段。 0034 本发明中， 所述互补探针的3 端可以选择性修饰淬灭基团。 检测探针与靶序列互 补， 检测探针设计时在5 端用荧光基团标记， 3 端标记淬灭基团。 互补探针的3 端可以设计 为包含带有淬灭基团也可以不设计带有淬灭基团。 当互补探针3 端不带有淬灭基团时， 温 度升高时， 随着检测探针和互补探针解链而荧光值减少。 这种现象的原因是溶液中的线性 单链双标记寡核苷酸为无规则卷曲： 它的两端偶尔彼此接近， 导致荧光基团的能量被淬灭 基团所吸收。 然而， 当检测探针和互补探针结合时， 标记的杂合体迫使探针的两端分开， 破 坏两个末端标记之间的相互作用，。

30、 从而引起荧光值的变化。 如果互补探针在3 端用猝灭基 团标记， 则探针间杂交降低荧光值， 并且当温度升高以使双链体变性时， 荧光值增加。 这是 因为探针杂合体的形成使淬灭基团和荧光基团紧密接近， 有效地淬灭荧光信号。 0035 第二方面， 本发明提供一种曲霉菌分种检测的试剂盒， 所述试剂盒包括如第一方 面所述的引物探针组合。 0036 优选地， 所述试剂盒还包括阴性质控、 阳性质控和辅助试剂。 0037 优选地， 所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒， 所述拟南芥DNA片段的核苷 酸序列如SEQ ID NO.20所示。 0038 优选地， 所述阳性质控分别为含有烟曲霉DNA片段的质粒、 。

31、含有黄曲霉DNA片段的 质粒、 含有黑曲霉DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒。 0039 本发明中， 阴性质控和阳性质控均采用本领域常用的质粒pMD19， 需要说明的是， 任何满足阴性质控和阳性质控质粒构建的载体均可用于替换pMD19， 此处无需特殊限定。 0040 优选地， 所述烟曲霉DNA片段、 黄曲霉DNA片段、 黑曲霉DNA片段和土曲霉DNA片段的 核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.22、 SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示。 0041 优选地， 所述辅助试剂包括Taq酶、 dNTP、 MgCl2、 DMSO和缓冲液。 004。

32、2 优选地， 所述缓冲液包括Tris-HCl和KCl。 0043 优选地， 所述Tris-HCl在缓冲液中的浓度为15-20mM， 例如可以是15mM、 16mM、 17mM、 18mM、 19mM或20mM。 0044 优选地， 所述KCl在缓冲液中的浓度为100-200mM， 例如可以是100mM、 110mM、 120mM、 130mM、 140mM、 150mM、 160mM、 170mM、 180mM、 190mM或200mM。 0045 第四方面， 本发明提供一种利用如第二方面所述的试剂盒用于曲霉菌分种检测的 方法， 所述方法包括如下步骤： 0046 (1)提取样本DNA； 004。

33、7 (2)向步骤(1)样本DNA中加入Taq酶、 dNTP、 MgCl2、 DMSO、 缓冲液、 如第一方面所述 说明书 4/12 页 7 CN 109943662 A 7 的引物探针组合； 0048 (3)实时荧光PCR反应。 0049 优选地， 步骤(2)所述DNA样本的终浓度为0.1pg-10ng， 例如可以是0.1pg、 0.5pg、 1pg、 2pg、 3pg、 4pg、 5pg、 10pg、 20pg、 30pg、 40pg、 50pg、 60pg、 70pg、 80pg、 90pg、 100pg、 200pg、 300pg、 400pg、 500pg、 600pg、 700pg、。

34、 800pg、 900pg、 1ng、 2ng、 3ng、 4ng、 5ng、 6ng、 7ng、 8ng、 9ng 或10ng。 0050 优选地， 步骤(2)所述Taq酶的终浓度为0.5-5U， 例如可以是0.5U、 0.8U、 1U、 1.2U、 1.5U、 1.8U、 2U、 2.5U、 3U、 3.5U、 4U、 4.5U或5U。 0051 优选地， 步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M， 例如可以是0.1M、 0.3M、 0.5M、 0.8M、 1M、 1.2M、 1.5M、 1.8M、 2M、 2.5M、 2.8M、 3M、 3.5M、 4M、 4.5M、 4.8M或5M。

35、。 0052 优选地， 步骤(2)所述dNTP的终浓度为0.1-5M， 例如可以是0.1M、 0.3M、 0.5M、 0.8M、 1M、 1.2M、 1.5M、 1.8M、 2M、 2.5M、 2.8M、 3M、 3.5M、 4M、 4.5M、 4.8M或5M。 0053 优选地， 步骤(2)所述DMSO的体积百分比为1-8， 例如可以是1、 2、 3、 4、 5、 6、 7或8， 优选为5。 0054 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的特异性引物的终浓度为50-500nM， 例如可以是 50nM、 60nM、 70nM、 80nM、 90nM、 100nM、 120nM、 150nM、 1。

36、80nM、 200nM、 250nM、 300nM、 350nM、 400nM、 450nM或500nM。 0055 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的检测探针的终浓度为50-500nM， 例如可以是 50nM、 60nM、 70nM、 80nM、 90nM、 100nM、 120nM、 150nM、 180nM、 200nM、 250nM、 300nM、 350nM、 400nM、 450nM或500nM。 0056 优选地， 步骤(2)所述四种曲霉菌的互补探针的终浓度为50-500nM， 例如可以是 50nM、 60nM、 70nM、 80nM、 90nM、 100nM、 120nM、 。

37、150nM、 180nM、 200nM、 250nM、 300nM、 350nM、 400nM、 450nM或500nM。 0057 本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的特异性引物终浓度一致， 按照四对引物 1:1:1:1组合配比， 所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM， 本发明的引物探针设计 满足扩增效率一致。 0058 本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的检测探针终浓度一致， 按照四种探针1: 1:1:1组合配比， 所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM。 0059 本发明PCR反应体系中针对每种曲霉菌的互补探针终浓度一致， 按照四种探针1: 1:1:1组合配比，。

38、 所述终浓度范围为所述终浓度范围为50-500nM。 0060 优选地， 步骤(3)所述实时荧光PCR反应的条件为： 0061 (1 )90-98预变性， 1-2min， 1个循环； 0062 (2 )90-98变性10s， 55-60延伸35-45s， 40-50个循环； 0063 (3 )35-97升温， 1个循环。 0064 优选地， 步骤(1 )之前还包括预热的过程： 50， 2min， 1个循环。 0065 优选地， 步骤(1)所述实时荧光PCR反应具体包括如下步骤： 0066 (1” )50预热2min， 1个循环； 0067 (2” )95预变性10min， 1个循环； 0068。

39、 (3” )95变性10s， 58延伸40s， 延伸时采集荧光信号， 45个循环； 说明书 5/12 页 8 CN 109943662 A 8 0069 (4” )955s， 351min； 升温到97， 0.2/s， 连续采集荧光信号， 5次/。 0070 优选地， 步骤(2)所述判断的标准为： 0071 (a)若检测通道的Ct值不大于35， 则为阳性结果， 若检测通道的Ct值大于35， 则为 阴性结果； 0072 (b)对阳性结果进一步分析， 通过熔解曲线分析， 比对产物与四种阳性质控的对应 退火温度Tm值， Tm值相同的即判定待测样本含有对应阳性质控的曲霉菌种。 0073 第四方面， 本。

40、发明提供一种如第一方面所述的引物探针组合和/或如第二方面所 述的试剂盒用于曲霉菌分种检测或制备曲霉菌分种检测的试剂中的应用。 0074 与现有技术相比， 本发明具有如下有益效果： 0075 (1)本发明的引物探针组合具有高特异性和灵敏度， 能同时检测烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉并区分具体菌种； 0076 (2)本发明中针对烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉设计的引物在满足普通扩增需 求的同时还满足扩增效率的一致， 使检测体系更加稳定， 检测特异性好， 避免扩增效率不同 导致菌种间的相互影响； 0077 (3)本发明的检测方法灵敏度高， 配合特定引物探针组合可以快速检测烟曲霉、 黄 曲霉、。

41、 黑曲霉和土曲霉， 可在同一荧光检测通道中同时鉴别区分不同曲霉菌种， 根据Taqman 探针熔点的变化可在同一荧光通道来区分多种曲霉菌菌种的特异靶序列； 0078 (4)寡核苷酸探针熔解曲线分析可以在实时荧光PCR扩增反应后直接进行， 无需开 管操作， 也可以在普通PCR进行扩增后转移到实时荧光PCR仪进行分析； 0079 (5)寡核苷酸探针熔解曲线分析属于非消耗性的检测， 在分析结束后， 样本保持 PCR后的状态， 并且可以多次重复分析。 附图说明 0080 图1为分别以含有烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉和土曲霉DNA片段的质粒为模板， 检测产 物的熔解曲线； 0081 图2为实施例4中不同浓度。

42、的含有烟曲霉DNA片段的标准质粒对应的扩增曲线； 0082 图3为实施例4中不同浓度的含有烟曲霉DNA片段的标准质粒对应的熔解曲线； 0083 图4为实施例5烟曲霉DNA不同浓度梯度的扩增曲线图； 0084 图5为实施例5中烟曲霉DNA不同浓度与Ct值的线性关系图。 具体实施方式 0085 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果， 以下通过具体实施方式来进 一步说明本发明的技术方案， 但本发明并非局限在实施例范围内。 0086 实施例1试剂盒的组装 0087 针对烟曲霉、 黄曲霉、 黑曲霉、 土曲霉的特异性引物、 检测探针以及互补探针的核 苷酸序列见表1. 0088 表1 0089 引物。

43、名称编号SEQ ID NO.核苷酸序列5 -3 说明书 6/12 页 9 CN 109943662 A 9 烟曲霉上游引物1GTCGTTTACGAGCAGCCTTC 烟曲霉下游引物2TTTGGCTTCCGTTCTATTGG 黄曲霉上游引物3GGAAACCGATTGCCTTCATA 黄曲霉下游引物4TGATGAACAGCACCAGAAGC 黑曲霉上游引物5CCAGCTGGCATTCCCTTT 黑曲霉下游引物6TTTTATCGGTTGGAGGCAAG 土曲霉上游引物7CTAAGGATTCCAGGGGAAGG 土曲霉下游引物8TGGTGGCACAGAACTAAGCA 烟曲霉检测探针9AAACGCTT。

44、ATTTTGCTAGTGGCCA 黄曲霉检测探针10ATACTCCGCCTTTCTTTCAAGCAAA 黑曲霉检测探针11TTTATACTCCGCCTTTCTTTCAAGCAA 土曲霉检测探针12TCACAGTAATGATCCTTCCGCAG 烟曲霉互补探针13TTTGCGAATAAAACGATCATCGG 黄曲霉互补探针14TATGACGCGCAATGAAAGTTCGTTT 黑曲霉互补探针15AATTATGAGGCGGACAGTAAGTTAGTT 土曲霉互补探针16AGTGTCATTACTAGGAAGGCGTC 内参引物上游引物17CTGTGAATGCCATTTCTC 内参引物下游引物18A。

45、CACCTCCTTTGGAATAG 内参探针19CCTAACCTACCCGCCTTGGATATT 0090 阴性质控品： 所述阴性质控为含有拟南芥DNA片段的质粒， 所述拟南芥DNA片段的 核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示， 具体序列如下： 0091 CATGATTCAGCCAACATAACCCGACCCGTACAATTCTATTACGCGTCTCCGGCGACTGACTATACTTG CCGTTCGGAGTTAGGGTTTTACTCCGAGAGAAAATTGAGTCAGCGATGAATCCGTTGACAAGGTGAAGAAGACGCA GAGCATTAACGCGAAAGAATTAGA。

46、TCTAGGGATTTACGACGAAGCATCTTGGCACGCCAAGTACAAAGATTCAGCC TACGTTTACGTCGGAGAATTACCTTACGATCTCACGGAGGGTGACCTCCTCGCCGTTTTCTCACAATATGGTGAAG TTGTTGATTTGAATCTTGTTCGAGATAAAGGAACTGGGAGATCAAAAAGATTTGCGTTTGTTGCTTATGAAGATCA GAGAAGTACTAATCTTGCTGTTGGATAATAAAAGTGGAGCATTGTGGTAAATACTTAAAGAGAGAAGAGGAAGATG AAGAGACGAAGCAGAA。

47、GAAGAGAGAAGCTCCGTGGTGTTTGCAGAGCTTTTCAGAGAAAGGAGTGTACTCGTGGAG ATTCTTGCAAATTTTCTCACGATGAAAATAGAGCTGCCAATACCGGGTGGGGTCACGAAGATCGTAGAAGTTCCAA GTGAGAGATCAAGTAAGTAAATACCATAATGATGTAGAGGATAAATAGGGATTGTTCATATTGATATCCAAGTGGT AATGCTCTACATTGAAGAATGGTTTCTAAGTTGTAGCTAGAATCTAATGGAAAATGTGATTTATTGACCATTAGCT TACACACC。

48、GGTGTTTTGCTCTGTATATGTCGATCTTATTTTCAGTGTTCACCTTTAC. 0092 阳性质控品： 含有烟曲霉DNA片段的质粒、 含有黄曲霉DNA片段的质粒、 含有黑曲霉 DNA片段的质粒和含有土曲霉DNA片段的质粒。 0093 烟曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示， 具体如下： 0094 ATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAG CTCAAATTTGAAAGCTGGCCCCTTCGGGGTCCGCGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTCGGG。

49、TGCAGCCCCCGTCTA AGTGCCCTGGAACGGGCCGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTCTGGGACGGGGTGTCTGCGTCCGTGTGAAGCTCCT TCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAATGGGTGGTAAATTTCATCTAAAGCTAAATACTGGCCGGAG 说明书 7/12 页 10 CN 109943662 A 10 ACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCACGTGAAATTGT TGAAAGGGAAGCGTTTGCGAC。

50、CAGACTCGCCCGCGGGGTTCAGCCGGCATTCGTGCCGGTGTACTTCCCCGTGGGC GGGCCAGCGTCGGTTTGGGCGGCCGGTCAAAGGCCCTCGGAATGTATCACCTCTCGGGGTGTCTTATAGCCGAGGG TGCAATGCGGCCTGCCTGGACCGAGGAACGCGCTTCGGCTCGGACGCTGGCGTAATGGTCGTAAATGAC. 0095 黄曲霉DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示， 具体如下： 0096 AAACCAACCGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTC。