基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用.pdf

《基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用.pdf（37页完成版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910277824.6 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 中国科学院过程工程研究所 地址 100190 北京市海淀区中关村北二条1 号中国科学院过程工程研究所科技开 发处 (72)发明人 张松平苏志国魏江雪李正军 杨延丽 (74)专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 11332 代理人 巩克栋 (51)Int.Cl. A61K 39/295(2006.01) A61K 39/385(2006.01) A61K 39/145(2006.01) A61P 。

2、31/16(2006.01) (54)发明名称 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及 其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种基于铁蛋白的多抗原通 用流感疫苗及其制备方法和应用， 所述基于铁蛋 白的多抗原通用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒 载体蛋白、 表面抗原和内腔抗原， 所述表面抗原 分布于铁蛋白纳米颗粒的表面， 内腔抗原分布于 铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。 本发明所述基于铁 蛋白的多抗原通用流感疫苗结构模拟了流感病 毒的天然空间构象， 呈现了多种流感病毒抗原， 能同时发挥多种流感病毒抗原的免疫原性， 激发 更全面的免疫效应， 提供更广谱的抗流感病毒的 免疫保护效果。 同时， 本发明所述铁。

3、蛋白载体在 人及哺乳动物等生物机体内广泛存在， 用作疫苗 载体理论上具有很好的安全性， 有在老人及小孩 中适用的可能性。 权利要求书3页 说明书26页 序列表5页 附图2页 CN 109966483 A 2019.07.05 CN 109966483 A 1.一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗， 其特征在于， 所述基于铁蛋白的多抗原通 用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒载体蛋白、 表面抗原和内腔抗原， 所述表面抗原分布于铁 蛋白纳米颗粒的表面， 内腔抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。 2.根据权利要求1所述的多抗原通用流感疫苗， 其特征在于， 所述铁蛋白为去铁铁蛋 白； 优选地， 所述铁蛋白纳米颗。

4、粒载体蛋白包括全长或部分截短的铁蛋白， 优选为全长铁 蛋白纳米颗粒； 优选地， 所述部分截短的铁蛋白纳米颗粒为从N端第5个氨基酸起163个氨基酸的铁蛋 白截短体。 3.根据权利要求1或2所述的多抗原通用流感疫苗， 其特征在于， 所述铁蛋白纳米颗粒 载体蛋白包括哺乳动物来源的铁蛋白、 两栖类动物来源的铁蛋白、 细菌来源的铁蛋白或植 物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合， 优选为哺乳动物来源的铁蛋白或细菌来 源的铁蛋白； 优选地， 所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、 鼠源性铁蛋白或马脾脏铁蛋 白中的任意一种或至少两种的组合； 优选地， 所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白或大肠杆。

5、菌铁蛋白； 优选地， 所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的来源包括天然提取产物、 人工合成产物或基 因工程技术产物中的任一种或至少两种的组合； 优选地， 所述铁蛋白包括突变氨基酸序列； 优选地， 所述表面抗原包括HA抗原、 M2e抗原或NA抗原中的任一种或至少两种的组合， 优选为HA抗原或M2e抗原中的任一种或两种的组合， 进一步优选为HA和M2e的组合。 4.根据权利要求1-3任一项所述的多抗原通用流感疫苗， 其特征在于， 所述内腔抗原包 括基质蛋白M1抗原、 M2e抗原或核蛋白NP抗原中的任一种或至少两种的组合， 优选为NP抗 原； 优选地， 所述表面抗原为一种或两种抗原的组合， 内腔抗原为区别于。

6、表面抗原的另一 种抗原； 优选地， 所述多抗原通用流感疫苗的表面抗原为HA抗原或M2e抗原， 内腔抗原为NP抗 原； 优选地， 所述多抗原通用流感疫苗的表面抗原为HA抗原和M2e抗原的组合， 内腔抗原为 NP抗原。 5.根据权利要求1-4任一项所述的多抗原通用流感疫苗， 其特征在于， 所述表面抗原通 过基因融合表达或化学偶联法分布于铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面； 优选地， 所述化学偶联法的化学交联剂包括琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环 己烷-1-羧酸酯(SMCC)、 磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (Sulfo-SMCC)、 琥珀酰亚胺基-马来酰亚胺多聚。

7、乙二醇(NHS-PEGn-Mal)、 N- -马来酰亚胺己 酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、 N- -马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)、 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 羧基-氨 基多聚乙二醇(COOH-PEGn-NH2)、 双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯 (Sulfo-DSS)、 磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇(NHS-PEGn-NHS)等中的任一种或至少两种 权利要求书 1/3 页 2 CN 109966483 A 2 的组合， 优选为Sulfo-SMCC或NHS-。

8、PEGn-Mal交联剂； 其中， 所述PEGn中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数， 所述聚乙二醇的分子量范围为 2k-10k。 6.根据权利要求1-5任一项所述的多抗原仿生流感疫苗， 其特征在于， 所述表面抗原包 括人源性流感病毒抗原蛋白、 禽源性流感病毒抗原蛋白或猪源性流感病毒抗原蛋白中的任 一种或至少两种的组合； 优选地， 所述内腔抗原包括人源性流感病毒抗原蛋白、 禽源性流感病毒抗原蛋白或猪 源性流感病毒抗原蛋白中的任一种或至少两种的组合； 优选地， 所述表面抗原包括突变氨基酸序列； 优选地， 所述内腔抗原包括突变氨基酸序列。 7.一种基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗的制备方法， 其特征在于。

9、， 包括以下步骤： 将 一种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的表面， 将另一种内腔抗原装载到铁蛋白纳 米颗粒的内部空腔， 得到基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗； 优选地， 所述双抗原通用流感疫苗的制备方法包括如下步骤： (1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； (2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(1)所得铁蛋白纳米颗粒载体蛋白 表面， 得基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗； 优选地， 所述双抗原通用流感疫苗的制备方法包括如下步骤： (1 )将第一种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得表面分布有 流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； (2 )将内腔抗原装载到步骤(。

10、1 )所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中， 得基于铁蛋白的 双抗原通用流感疫苗。 8.一种基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗的制备方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将 两种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 将一种内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗 粒内部空腔； 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： (A1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； (A2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(A1)所得铁蛋白纳米颗粒载体蛋 白表面； (A3)通过化学偶联法在步骤(A2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原， 得基 于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗； 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： 。

11、(B1)将第一种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得表面分布有 流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； (B2)将内腔抗原装载到步骤(B1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； (B3)在步骤(B2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原， 得基于铁蛋白的三抗 原通用流感疫苗； 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： (C1)将两种不同的表面抗原基因均融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得表面 权利要求书 2/3 页 3 CN 109966483 A 3 分布有两种流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； (C2)将内腔抗原装载到步骤(C1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中， 得基于铁蛋白的 三。

12、抗原通用流感疫苗。 9.根据权利要求7或8所述的方法， 其特征在于， 所述内腔抗原装载的方法包括加热法、 酸碱调节法或变性剂法； 优选地， 所述加热法具体包括如下步骤： 1)将待装载的内腔抗原与铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒载体蛋白 混合， 加热； 2)去除未被装载的内腔抗原， 纯化回收， 得内部空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米 颗粒； 优选地， 步骤1)所述加热的温度为25-80， 优选为25-50； 优选地， 步骤1)所述加热的时间为30-120min； 优选地， 步骤2)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、 超滤、 凝胶过滤层析、 离子交换层析、 疏水层析或超速离心中的。

13、任一种或至少两种的组合； 优选地， 所述酸碱调节法具体包括如下步骤： (a)配制1-10mg/ml的铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒溶液， 盐酸溶液 调节其pH值至2.2-2.6， 4搅拌孵育5min； (b)向步骤(a)所得铁蛋白酸性溶液中加入待装载的内腔抗原， 将混合液于4搅拌孵 育10-15min； (c)氢氧化钠溶液调节步骤(b)所得混合液pH值至7.2-7.5， 25搅拌孵育0.5-2h； (d)去除步骤(c)所得混合液中未被装载的内腔抗原， 纯化回收， 得内部空腔中装载有 内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗； 优选地， 步骤(d)所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、 超滤。

14、、 凝胶过滤层析、 离子交换层析、 疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合； 优选地， 所述变性剂法具体包括如下步骤： 1 )将铁蛋白或表面分布有表面抗原的铁蛋白纳米颗粒载体蛋白与变性剂混合得混合 液， 室温孵育； 2 )向步骤1 )所得混合液中加入待装载的内腔抗原， 将混合液室温孵育； 3 )去除步骤2 )所得混合液中的变性剂以及未被装载的内腔抗原， 纯化回收， 得内部 空腔中装载有内腔抗原的铁蛋白纳米颗粒疫苗； 优选地， 步骤1 )所述变性剂包括脲素； 优选地， 所述脲素的摩尔浓度为4-8M； 优选地， 步骤1 )所述孵育的时间为1-3h； 优选地， 步骤2 )所述孵育的时间为0.5。

15、-6h； 优选地， 步骤3 )所述去除未被装载的内腔抗原的方法包括透析、 超滤、 凝胶过滤层析、 离子交换层析、 疏水层析或超速离心中的任一种或至少两种的组合。 10.一种如权利要求1-6任一项所述的基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗用于制备预 防流感的药物中的应用。 权利要求书 3/3 页 4 CN 109966483 A 4 一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发明属于生物医药技术领域， 涉及一种流感疫苗及其制备方法和应用， 尤其涉 及一种多抗原仿生流感疫苗及其制备方法和应用， 主要涉及一种基于铁蛋白的多抗原通用 流感疫苗及其制备方法和应用， 具体涉及一。

16、种将衍生自流感病毒的抗原蛋白分别负载于铁 蛋白纳米颗粒的外表面和装载于铁蛋白纳米颗粒中空腔室内部， 模拟流感病毒天然结构的 流感疫苗及其制备方法和应用。 背景技术 0002 作为最严重的传染病之一， 流感的预防却一直是困扰人类的一大难题。 目前， 防治 流感最为有效的措施仍然是接种流感疫苗。 市场上现行的多价流感疫苗， 均是针对流感病 毒的两种表面抗原血凝集素(hemagglutinin， HA)和神经氨酸酶(neuraminidase， NA)， 具有 很好的安全性及抗原性， 但有效性却受到极大限制。 这是由于流感病毒的HA及NA抗原极易 发生抗原漂变， 使得流感病毒极易发生变异， 给每年流。

17、感流行毒株的预测和流感疫苗的研 制带来极大困难。 因此， 研发和制备具有广谱抗性的对多种不同的流行毒株均具有有效抗 性的通用流感疫苗则尤为迫切。 利用各毒株间的保守肽或优势表位， 通过强免疫原性载体 的免疫增强作用， 可诱导产生强的针对流感病毒的广谱中和抗体或广谱的细胞免疫反应， 进而保护动物或人类免受多种流感毒株的感染， 是当前通用流感疫苗研究的主要策略。 0003 在流感病毒的众多表位中， 流感病毒HA抗原免疫原性强的头部和保守的茎杆部， 基质蛋白M2(matrix protein 2)胞外部分M2e和位于病毒包膜内的M1(matrix protein 1) 抗原， 以及核蛋白NP(nuc。

18、lear protein)抗原均是目前通用流感疫苗最关注的靶点。 其中， NP和M1抗原的部分氨基酸序列在A型流感病毒间高度保守， 主要诱导宿主的细胞免疫特别 是CTL反应。 M2e抗原序列在各流感毒株间亦高度保守， 主要诱导体液免疫， 但其免疫原性 弱， 由天然感染或传统疫苗引起的抗M2e的免疫反应， 几乎可以被忽略。 HA是位于流感病毒 脂质包膜表面的同源三聚体跨膜糖蛋白， 由介导受体结合的头部和介导病毒包膜与靶细胞 膜融合的茎秆区组成； HA头部蛋白含有众多优势表位， 免疫原性强， 能诱导针对HA受体结合 区的中和抗体， 但在各流感毒株间差异大； 相反， HA茎杆部尤其是酶切位点及融合肽。

19、序列在 各流感毒株间则高度保守。 以融合表达或混合等方式制备的多抗原通用流感疫苗， 因其更 完善的免疫原性而表现出了更广谱的免疫保护效应， 是目前通用流感疫苗研究的新思路， 甚至已有多家公司的多抗原通用流感疫苗进入临床研究。 0004 当前多抗原通用流感疫苗研究的主要策略， 可以分为以下几类： (1)将多段、 同种 抗原肽融合至强免疫原性载体外部： 例如基于乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒(HBc)的3M2e- HBc疫苗， 即是将3段重复的M2e多肽序列串联融合插入至HBc载体序列中， 以达到免疫增强 的目的； (2)将多种抗原肽融合至强免疫原性载体上： 例如基于HBc载体的3M2e-NP-HBc。

20、疫 苗， 即是将3段重复的M2e多肽和一段NP多肽序列串联融合插入至HBc载体序列中， 以获得更 完善的免疫原性； 再例如Vaccitech公司的MVA-(NP+M1)疫苗， 即是基于改造的重组安卡拉 病毒(MVA)作为载体， 融合表达NP和M1抗原， 并利用MVA具有的一定的佐剂效应， 但需与传统 说明书 1/26 页 5 CN 109966483 A 5 的三价季节性流感疫苗(TVA)联合使用， 用以提高后者的免疫保护率； (3)分别将不同种抗 原融合或偶联至强免疫原性载体外表面得到多种疫苗后， 将多者混合使用： 例如基于腺病 毒载体的AdV-HA与AdV-NP的混合疫苗， 即是将AdV-。

21、HA与AdV-NP两种颗粒疫苗混合使用， 可 获得更好的免疫效果； (4)不基于强免疫原性载体的、 多种抗原串联的融合疫苗： 例如以色 列BiondVax公司所研发的Multimeric-001广谱流感疫苗， 即是将9段保守的HA、 NP或M1线性 表位串联， 经融合表达得到具有广谱免疫效果的Multimeric-001疫苗， 但其需与季节性流 感疫苗联用才能达到更理想的免疫效果； (5)不基于强免疫原性载体的、 多种抗原肽直接混 合的混合疫苗： 例如英国Imutex公司所研发的FLU-v疫苗， 则是四种保守的线性表位肽(分 别衍生自流感病毒的M1、 NP及M2表位)的混合物， 具有一定的广谱。

22、免疫效果， 但也需与季节 性流感疫苗联用才能达到更理想的免疫效果。 0005 综上所述， 会发现目前实验室或临床上的多抗原通用流感疫苗常以 “多抗原混合” 或 “多抗原串联” 的融合表达形式呈现在载体外部。 尽管呈现出一定的针对不同类型流感病 毒的广谱性， 但大多数的广谱保护效果存在一定局限性， 或者需要辅以佐剂或季节性流感 疫苗联合使用才能发挥最好的效果。 因此， 提供一种更高免疫原性及攻毒保护力的、 更安全 的广谱性流感疫苗仍然具有重要意义和广阔前景。 0006 铁蛋白(ferritin)作为一种广泛存在于生物体内的、 能自组装的球形蛋白， 其表 面每相邻两个亚单位的氨基端间距约为4.5-。

23、7.5nm， 适合在外表面负载抗原， 且表面负载抗 原后能诱发很强的体液免疫反应及细胞免疫反应， 是非常理想的载体， 也常用作抗肿瘤小 分子药物偶联载体。 铁蛋白在流感疫苗方面的应用通常是将一种或两种抗原通过融合表达 在外表面。 Kanekiyo M等人将一种1999年流感病毒HA抗原序列与ferritin进行融合表达， 发现其能中和1943年至2007年间发现的所有H1N1型病毒株。 此外， 也有研究人员将3端重复 的M2e多肽序列串联融合表达至铁蛋白载体表面， 制备得到3M2e-rHF多抗原疫苗， 但其利用 的仅是M3e这一种抗原， 在通用性上具有一定的局限性。 基于上述研究成果， 说明f。

24、erritin 作为一种在哺乳动物体内广泛存在的载体， 其在通用流感疫苗的研究中是具备可行性和广 泛前景的。 然而现有设计疫苗在效果上还存在不足。 0007 通过对Ferritin的结构进行分析， 其作为生物体内储存Fe3+的重要场所， 其中空腔 室直径约7nm， 在一定条件下ferritin发生可逆解聚并释放储存于其内部的Fe3+， 而后在一 定条件下发生重组形成不含Fe3+的apo-ferritin。 Ferritin与apo-ferritin的这种转换特 性， 使研究者们开始利用apo-ferritin用于某些小分子的运载。 Apo-ferritin具备良好的 pH耐受性和热稳定性， 因。

25、而被广泛用于肿瘤药物如cisplatin、 DOX、 photosensitizers的包 载或金属氧化物如镍、 铬的生物矿化等研究中。 然而Ferritin的结构特征是否能够在内部 装载抗原， 能够装载多大、 多少抗原， 什么条件能够装载抗原都鲜有研究。 若能同时利用生 物相容性好的铁蛋白载体外表面负载抗原和内部空腔装载小分子的优势， 仿生模拟天然流 感病毒的结构， 让不同的流感病毒抗原处于不同的空间位置并分别发挥其相应的免疫作 用， 可能获得针对不同流感毒株的更安全、 更全面、 更持久、 更强的广谱免疫保护效果。 发明内容 0008 针对现有通用流感疫苗设计和制备技术的不足及实际的需求， 。

26、本发明提供一种基 于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗及其制备方法和应用， 制备过程简单高效且模拟了流感病 说明书 2/26 页 6 CN 109966483 A 6 毒本身表位分布的空间特点， 使得所制备的流感疫苗具有更高的保护力， 并具有针对不同 毒株的广谱交叉保护力。 0009 为达此目的， 本发明采用以下技术方案： 0010 第一方面， 本发明提供一种基于铁蛋白的多抗原通用流感疫苗， 所述基于铁蛋白 的多抗原通用流感疫苗包括铁蛋白纳米颗粒载体蛋白、 表面抗原和内腔抗原， 所述表面抗 原分布于铁蛋白纳米颗粒的表面， 内腔抗原分布于铁蛋白纳米颗粒的内部空腔。 0011 本发明中， 以铁蛋白纳米颗粒。

27、作为载体， 在载体蛋白的内腔和表面均分布有抗原， 这样的疫苗组分及结构模拟了流感病毒的天然空间构象， 呈现了多种流感病毒抗原， 能同 时发挥多种流感病毒抗原的免疫原性， 激发更全面的免疫效应， 提供更广谱的抗流感病毒 的免疫保护效果。 0012 优选地， 所述铁蛋白为去铁铁蛋白。 0013 本发明中， 所述去铁铁蛋白(Apo-ferritin， 以下简称 “FRT” )的特征在于去除了天 然铁蛋白内部可能携带的铁离子， 便于内腔抗原的装载。 0014 优选地， 所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白包括全长或部分截短的铁蛋白， 优选为全 长铁蛋白纳米颗粒。 0015 优选地， 所述部分截短的铁蛋白纳米颗粒。

28、为从N端第5个氨基酸起163个氨基酸的 铁蛋白截短体， 即FRT(5-167aa)。 0016 优选地， 所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白包括哺乳动物来源的铁蛋白、 两栖类动物 来源的铁蛋白、 细菌来源的铁蛋白或植物来源的铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合， 优选为哺乳动物来源的铁蛋白或细菌来源的铁蛋白。 0017 优选地， 所述哺乳动物来源的铁蛋白包括人源性铁蛋白、 鼠源性铁蛋白或马脾脏 铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。 0018 优选地， 所述细菌来源的铁蛋白包括幽门螺杆菌铁蛋白或大肠杆菌铁蛋白。 0019 优选地， 所述铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的来源包括天然提取产物、 人工合成产物 或基因工。

29、程技术产物中的任一种或至少两种的组合。 0020 优选地， 所述铁蛋白包括突变氨基酸序列。 0021 优选地， 所述表面抗原包括HA抗原、 M2e抗原或NA抗原中的任一种或至少两种的组 合， 例如可以是HA抗原和M2e抗原的组合， M2e抗原和NA抗原的组合， HA抗原和NA抗原的组 合， 或HA抗原、 M2e抗原和NA抗原的组合， 优选为HA抗原或M2e抗原中的任一种或两种的组 合， 进一步优选为HA和M2e的组合。 0022 优选地， 所述内腔抗原包括基质蛋白M1抗原、 M2e抗原或核蛋白NP抗原中的任一种 或至少两种的组合， 例如可以是M1抗原和M2e抗原的组合， M1抗原和NP抗原的组。

30、合， M2e抗原 和NP抗原的组合， 或M1抗原、 M2e抗原或NP抗原的组合， 优选为NP抗原。 0023 本发明中， 由FRT与分布于内部空腔的抗原组成的流感疫苗， 以 “FRT+抗原” 的形式 表示， 例如FRT+NP， FRT+M2e， FRT+M1， 优选为FRT+NP疫苗。 0024 优选地， 所述表面抗原为一种或两种抗原的组合， 内腔抗原为区别于表面抗原的 另一种抗原。 0025 优选地， 所述多抗原通用流感疫苗的表面抗原为HA抗原或M2e抗原， 内腔抗原为NP 抗原。 说明书 3/26 页 7 CN 109966483 A 7 0026 进一步优选地， 所述多抗原通用流感疫苗的。

31、表面抗原为HA抗原和M2e抗原的组合， 内腔抗原为NP抗原。 0027 通过对流感结构和侵染机制的研究， 发明人发现， 流感病毒各抗原在流感结构中 的空间位置具有特定的空间分布， HA、 NA分布在流感病毒衣壳表面， M2嵌合在流感病毒衣壳 上， M1在流感衣壳内部， NP与RNA缠绕形成RNP位于流感病毒内部。 其次， 各抗原在流感病毒 侵染过程中也具有时间先后顺序， 简言之， 就是HA与唾液酸受体结合， M2离子通道激活， HA 构象发生变化， M1与RNP相互松动， RNP进入， 利用宿主复制产生子代病毒， 出芽NA裂解唾液 酸， 释放子代病毒。 因此， 如果能够让衍生自NP、 M2e和。

32、HA的抗原蛋白模拟在流感病毒上的空 间分布， 装载在铁蛋白纳米颗粒载体蛋白上， 使得疫苗不同抗原处于其应占据的位置更好 的协同， 仿生设计出多抗原的流感疫苗， 各抗原间协同增效， 使所得多抗原仿生流感疫苗获 得更高的免疫原性和攻毒保护力， 起到通用流感疫苗的作用。 0028 本发明中， 发明人发现， 在FRT纳米颗粒表面分布一种或两种不同的表面抗原， 内 部空腔装载区别于表面抗原的另一种内腔抗原可以显著增强多抗原仿生流感疫苗的广谱 性， 例如可以是 “HA抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 、“HA抗原在FRT表面， M1抗原在FRT 内腔中” 、“HA抗原在FRT表面， M2e抗原。

33、在FRT内腔中” 、“M2e抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内 腔中” 、“M2e抗原在FRT表面， M1抗原在FRT内腔中” 、“NA抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔 中” 、“NA抗原在FRT表面， M1抗原在FRT内腔中” 、“NA抗原在FRT表面， M2e抗原在FRT内腔中” 、 “HA和M2e抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 、“HA和M2e抗原在FRT表面， M1抗原在FRT内 腔中” 、“HA和NA抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 、“HA和NA抗原在FRT表面， M1抗原在 FRT内腔中” 或 “HA和NA抗原在FRT表面， M2e抗原在FR。

34、T内腔中” 的疫苗分布形式， 优选为 “HA 抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 、“M2e抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 或 “HA和 M2e抗原在FRT表面， NP抗原在FRT内腔中” 的疫苗分布形式。 优选的基于铁蛋白的多抗原通 用流感疫苗， 具备多抗原的仿生设计， 使得不同流感病毒抗原处于其应占据的位置更好的 协同， 充分发挥了多种不同流感病毒抗原的免疫原性， 具有更突出的免疫刺激能力和更广 谱的免疫保护效果， 且各抗原所激发的抗体水平较非多抗原仿生流感疫苗中相应抗原有所 增强， 各抗原间存在协同增效的作用。 0029 优选地， 所述表面抗原通过基因融合表达或化。

35、学偶联法分布于铁蛋白纳米颗粒载 体蛋白表面。 0030 优选地， 所述化学偶联法的化学交联剂包括琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲 基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、 磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯 (Sulfo-SMCC)、 琥珀酰亚胺基-马来酰亚胺多聚乙二醇(NHS-PEGn-Mal)、 N- -马来酰亚胺己 酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)、 N- -马来酰亚胺己酸磺基琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)、 1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)、 羧基-氨 基多聚乙二醇(COOH-PE。

36、Gn-NH2)、 双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)、 双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯 (Sulfo-DSS)、 磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇(NHS-PEGn-NHS)等中的任一种或至少两种 的组合， 优选为Sulfo-SMCC或NHS-PEGn-Mal交联剂。 其中， 所述PEGn中的n为聚乙二醇中乙二 醇单体的个数， 所述聚乙二醇的分子量范围为2k-10k。 0031 本发明中， 通过化学偶联的手段， 使FRT纳米颗粒与共价结合于外表面的抗原组合 成化学偶联流感疫苗， 以 “抗原 .FRT” 的形式表示， 例如HA .FRT， M2e .FRT， NA .FRT， 说明书 4/26 页 8 CN 。

37、109966483 A 8 HA.M2e.FRT， HA.NA.FRT或M2e.NA.FRT等， 优选为HA.FRT， M2e.FRT， HA.M2e.FRT疫苗； 由FRT 纳米颗粒与共价结合于外表面的抗原和分布于内部的抗原共同组成的多抗原通用流感疫 苗， 则以 “抗原(外表面) .FRT+抗原(内腔)” 的形式表示， 例如M2e.FRT+NP， HA.FRT+NP， NA.FRT+NP， HA.M2e.FRT+NP， M2e.FRT+M1， HA.FRT+M1， NA.FRT+M1， HA.M2e.FRT+M1， NA.FRT+ M2e， HA.FRT+M2e或FRT.HA.NA+M2e等。

38、， 优选为HA.FRT+NP， M2e.FRT+NP， HA.M2e.FRT+NP疫苗。 0032 本发明中， 通过融合蛋白的形式， 使FRT纳米颗粒与融合表达于外表面的抗原组成 融合流感疫苗， 以 “FRT.抗原” 的形式表示， 例如FRT.M2e， FRT.HA， FRT.NA， FRT.HA.M2e， FRT.HA.NA或FRT.M2e.NA等， 优选为FRT.M2e， FRT.HA， FRT.HA.M2e疫苗； 由FRT纳米颗粒与融 合表达于外表面的抗原和分布于内部的抗原共同组成的多抗原通用流感疫苗， 以 “FRT.抗 原(外表面)+抗原(内腔)” 的形式表示， 例如FRT .M2e+。

39、NP， FRT .HA+NP， FRT .NA+NP， FRT.HA.M2e+NP， FRT.M2e+M1， FRT.HA+M1， FRT.NA+M1， FRT.HA.M2e+M1， FRT.HA+M2e， FRT.NA+ M2e或FRT.HA.NA+M2e等， 优选为FRT.M2e+NP， FRT.HA+NP或FRT.HA.M2e+NP疫苗。 0033 优选地， 所述表面抗原包括人源性流感病毒抗原蛋白、 禽源性流感病毒抗原蛋白 或猪源性流感病毒抗原蛋白中的任一种或至少两种的组合。 0034 优选地， 所述内腔抗原包括人源性流感病毒抗原蛋白、 禽源性流感病毒抗原蛋白 或猪源性流感病毒抗原蛋白中。

40、的任一种或至少两种的组合。 0035 优选地， 所述表面抗原包括突变氨基酸序列。 0036 优选地， 所述内腔抗原包括突变氨基酸序列。 0037 本发明中所述的NA、 M1、 HA、 NP和M2e既可以是衍生自流感病毒的完整的抗原蛋白， 也可以是其中一段保守的抗原多肽片段。 其是可以通过人工合成或基因工程技术手段得到 的人源性、 禽源性、 猪源性流感病毒抗原蛋白及其突变氨基酸序列， 在不影响抗原蛋白免疫 原性的基础上， 至少一个氨基酸突变后的序列对应的抗原蛋白也在本发明的保护范围之 内。 0038 本发明还提供了将上述抗原分布到FRT纳米颗粒表面的一种方法。 通过基因工程 技术将抗原插入至FR。

41、T载体蛋白序列中， 经过合适的表达系统进行融合表达， 自我组装成表 面分布有流感病毒抗原的FRT纳米颗粒衍生物， 经常规的蛋白分离纯化手段， 方法参见例如 (Kanekiyo M,Wei CJ,Yassine HM,McTamney PM,Boyington JC,Whittle JR,et al.Self- assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies.Nature.2013； 499(7456):102-6.)(Qi M,Zhang XE,Sun X,Zhang 。

42、X,Yao Y, Liu S,et al.Intranasal Nanovaccine Confers Homo-and Hetero-Subtypic Influenza Protection.Small.2018； 14(13):e1703207.)， 最终得到高纯度的表面分布有流感病毒抗 原的FRT纳米颗粒衍生物。 0039 在其中一个实验例中， 详述了将衍生自流感病毒HA抗原的多肽序列插入至FRT载 体蛋白序列N端， 经大肠杆菌培养系统融合表达于FRT载体的表面， 经常规纯化分离手段制 备高纯度FRT.HA纳米颗粒疫苗的方法。 0040 本发明还提供了将上述抗原分布到FRT纳米颗粒的另。

43、一种方法。 通过化学偶联技 术， 将抗原通过化学键共价结合到FRT载体蛋白表面， 制备表面分布有流感病毒抗原的FRT 纳米颗粒衍生物。 0041 在另一个实验例中， 详述了将衍生自流感病毒的M2e多肽抗原通过NHS-PEGn-Mal 说明书 5/26 页 9 CN 109966483 A 9 交联剂共价结合到FRT载体蛋白表面， 制备表面分布有M2e抗原的M2e.FRT纳米颗粒疫苗的 方法。 0042 第二方面， 本发明提供一种基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗的制备方法， 包括 以下步骤： 将一种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白的表面， 将另一种内腔抗原装 载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔， 得。

44、到基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗。 0043 优选地， 所述双抗原通用流感疫苗的制备方法包括如下步骤： 0044 (1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； 0045 (2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(1)所得铁蛋白纳米颗粒载体 蛋白表面， 得基于铁蛋白的双抗原通用流感疫苗。 0046 在其中一个实验例中， 详述了先将衍生自流感病毒的NP多肽抗原装载至FRT纳米 颗粒内腔中， 而后通过NHS-PEGn-Mal交联剂将流感病毒M2e多肽抗原装共价结合到FRT+NP 颗粒表面， 制备表面分布有M2e抗原、 内腔中分布有NP抗原的M2e.FRT+NP纳米颗粒疫苗的方 法。 00。

45、47 优选地， 所述双抗原通用流感疫苗的制备方法包括如下步骤： 0048 (1 )将第一种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得表面分 布有流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； 0049 (2 )将内腔抗原装载到步骤(1 )所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中， 得基于铁蛋 白的双抗原通用流感疫苗； 0050 在另一个实验例中， 详述了先将衍生自流感病毒的HA抗原融合表达至FRT载体蛋 白外表面， 而后将流感病毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中， 制备表面分布有HA抗原、 内腔中分布有NP抗原的FRT.HA+NP纳米颗粒疫苗的方法。 0051 本发明中， 基于铁蛋白的双抗原通用流感。

46、疫苗主要采用两种制备方法， 第一种为 先装载内腔抗原， 再利用化学修饰方法装载表面抗原； 第二种方法为先通过基因融合表达 的方式将表面抗原装载到载体蛋白的表面， 再将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空 腔。 0052 第三方面， 本发明提供一种基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗的制备方法， 包括 以下步骤： 将两种表面抗原装载到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 将一种内腔抗原装载到 铁蛋白纳米颗粒内部空腔。 0053 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： 0054 (A1)将内腔抗原装载到铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； 0055 (A2)将第一种表面抗原通过化学偶联法装载至步骤(A1)所得铁蛋白纳米颗。

47、粒载 体蛋白表面； 0056 (A3)通过化学偶联法在步骤(A2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原， 得基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗。 0057 在又一个实验例中， 详述了先将衍生自流感病毒的NP多肽抗原装载至FRT纳米颗 粒内腔中， 而后通过NHS-PEGn-Mal交联剂先后将流感病毒HA抗原和M2e抗原共价结合到FRT +NP颗粒表面， 制备表面分布有HA抗原和M2e抗原、 内腔中分布有NP抗原的HA.M2e.FRT+NP纳 米颗粒疫苗的方法。 0058 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： 说明书 6/26 页 10 CN 109966483 A 10 0059 (B1)将第一。

48、种表面抗原基因融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得表面分 布有流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； 0060 (B2)将内腔抗原装载到步骤(B1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中； 0061 (B3)在步骤(B2)所得铁蛋白纳米颗粒表面修饰第二种表面抗原， 得基于铁蛋白的 三抗原通用流感疫苗。 0062 在又一个实验例中， 详述了先将衍生自流感病毒的HA抗原融合表达至FRT载体蛋 白外表面， 而后将流感病毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中， 最后通过NHS-PEGn-Mal 交联剂将流感病毒M2e抗原共价结合到FRT.HA+NP颗粒表面制备表面分布有HA抗原和M2e抗 原、 内腔中分布有。

49、NP抗原的M2e.FRT.HA+NP纳米颗粒疫苗的方法。 0063 优选地， 所述制备方法包括如下步骤： 0064 (C1)将两种不同的表面抗原基因均融合表达至铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面， 得 到表面分布有两种流感病毒抗原的铁蛋白纳米颗粒； 0065 (C2)将内腔抗原装载到步骤(C1)所得铁蛋白纳米颗粒的内部空腔中， 得基于铁蛋 白的三抗原通用流感疫苗。 0066 在另一个实验例中， 详述了先将衍生自流感病毒的HA和M2e两种抗原序列以串联 的形式插入至FRT载体蛋白序列N端， 将二者融合表达至FRT载体蛋白外表面， 而后将流感病 毒NP多肽抗原装载至FRT.HA颗粒内腔中， 制备表面分布有。

50、HA抗原和M2e抗原、 内腔中分布有 NP抗原的FRT.HA.M2e+NP纳米颗粒疫苗的方法。 0067 所选流感病毒抗原的种类、 序列长度、 结构特征等因素均会影响上述五种多抗原 通用流感疫苗制备方法的效率和难易程度， 因此可以根据所选抗原和FRT载体的特点， 选定 相对更优的制备方法。 0068 本发明中， 基于铁蛋白的三抗原通用流感疫苗主要采用三种制备方法， 第一种为 先装载内腔抗原， 再将两种表面抗原依次化学偶联到铁蛋白纳米颗粒载体蛋白表面； 第二 种为先将第一种表面抗原基因融合表达至载体蛋白的表面， 再装载内腔抗原， 最后将第二 种表面抗原化学偶联到载体蛋白的表面； 第三种为先将两种。