IL23单域抗体的VHH链、IL23单域抗体、核苷酸序列及试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910297965.4 (22)申请日 2019.04.12 (71)申请人 深圳普瑞金生物药业有限公司 地址 518000 广东省深圳市坪山区坑梓街 道金辉路14号深圳生物医药创新产业 园1号楼402 (72)发明人 李胜华李莹莹包朝乐萌 许莎莎余祥刘文涛 (74)专利代理机构 深圳市世纪恒程知识产权代 理事务所 44287 代理人 胡海国 (51)Int.Cl. C07K 16/24(2006.01) C12N 15/13(2006.01) (54)发明名称 IL23单。

2、域抗体的VHH链、 IL23单域抗体、 核苷 酸序列及试剂盒 (57)摘要 本发明公开IL23单域抗体的VHH链、 IL23单 域抗体、 核苷酸序列及试剂盒， 其中， IL23单域抗 体的VHH链的氨基酸序列为SEQIDNO： 1所述的 氨基酸序列。 本发明技术方案得到一种特异性结 合IL23蛋白的单域抗体， 该抗体特异性结合IL23 蛋白的活性高， 表达量高， 成本低， 易改造。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 109970855 A 2019.07.05 CN 109970855 A 1.一种IL23单域抗体的VHH链， 其特征在于， 所述VHH链的氨基酸序列为SE。

3、Q ID NO： 1所 述的氨基酸序列。 2.一种IL23单域抗体， 其特征在于， 所述IL23单域抗体包含如权利要求1所述的SEQ ID NO： 1氨基酸序列。 3.一种核苷酸序列， 其特征在于， 所述核苷酸序列编码如权利要求1所述所述的IL23单 域抗体。 4.如权利要求3所述的核苷酸序列， 其特征在于， 所述核苷酸序列如下： CAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTACAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCC TCTGGATGGAACCTTGGTAATTATGCCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAG。

4、CGTGAGTTTGTAGCAG CTATCGACTGGCGTCATAGTTCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACACCAA GAACATGGTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACTTGAGGACACGCGCCTTTATTACTGTGCAGCATCAAGCCTA TTCCCTAGTAGTGCTCCCCGTCAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。 5.一种试剂盒， 其特征在于， 包括如权利要求1所述的IL23单域抗体的VHH链， 或者包含 权利要求2所述的IL23单域。

5、抗体， 或者包含如权利要求3或4所述的核苷酸序列。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109970855 A 2 IL23单域抗体的VHH链、 IL23单域抗体、 核苷酸序列及试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 特别涉及一种IL23单域抗体的VHH链、 IL23单域抗 体、 核苷酸序列及试剂盒。 背景技术 0002 IL-23是一种异二聚体细胞因子,是IL-12家族成员。 IL-23主要由活化的树突细胞 和巨噬细胞分泌,能促进T细胞的增殖及IFN-的产生,具有较强的抗肿瘤活性和抗感染免 疫保护功能。 研究表明IL-23高表达可引起多种自身免疫性疾病， 如银屑病、 类风湿关。

6、节炎、 系统性红斑狼疮、 炎症性肠病、 多发性硬化、 中枢神经系统性自身免疫性炎症等。 0003 IL23拮抗剂(包括例如靶向例如IL23的p19亚基的抗IL23抗体或其抗原结合片段) 可以有效降低IL-23水平， 缓解因IL23过高而导致的免疫紊乱症状。 例如延迟或预防IL23介 导的疾病或病症的发作， 减少IL23介导的疾病或病症的发生。 0004 然而， 现有技术中的IL-23抗体活性较低， 表达量也很低。 发明内容 0005 本发明的主要目的是提供一种多肽序列， 旨在解决提高IL23单域抗体的活性。 0006 为实现上述目的， 本发明提供一种IL23单域抗体的VHH链， 所述VHH链的。

7、氨基酸序 列为SEQ ID NO： 1所述的氨基酸序列。 0007 本发明还提供一种IL23单域抗体， 所述IL23单域抗体包含SEQ ID NO： 1所述氨基 酸序列。 0008 本发明还提供一种核苷酸序列， 其特征在于， 所述核苷酸序列编码SEQ ID NO： 1所 述的氨基酸序列。 0009 在一实施例中， 所述核苷酸序列如下： 0010 CAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTACAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGC AGCCTCTGGATGGAACCTTGGTAATTATGCCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGG。

8、GAAGGAGCGTGAGTTTGTA GCAGCTATCGACTGGCGTCATAGTTCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACA CCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACTTGAGGACACGCGCCTTTATTACTGTGCAGCATCAAG CCTATTCCCTAGTAGTGCTCCCCGTCAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。 0011 本发明还提供一种试剂盒， 所述试剂盒包括IL23单域抗体的VHH链， 或者包含核苷 酸序列； 所述。

9、VHH链的氨基酸序列为SEQ ID NO： 1所述的氨基酸序列； 所述核苷酸序列为： C AGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTACAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGG ATGGAACCTTGGTAATTATGCCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTAGCAGCTATC GACTGGCGTCATAGTTCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACACCAAGAACA TGGTGTATCTGCAAATGAGCAGCC。

10、TGAAACTTGAGGACACGCGCCTTTATTACTGTGCAGCATCAAGCCTATTCCC TAGTAGTGCTCCCCGTCAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。 0012 本发明技术方案通过结合基因工程的方法得到一种特异性结合IL23蛋白的单域 说明书 1/7 页 3 CN 109970855 A 3 抗体， 该抗体特异性结合IL23蛋白的活性高， 表达量高， 成本低， 易改造。 附图说明 0013 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。 0014。

11、 图1为本发明第一轮PCR单域抗体基因电泳图； 0015 图2为图1中1道中750bp-500bp， 2道和3道DNA回收后进行第二轮PCR单域抗体基因 电泳图； 0016 图3为蛋白表达纯化图； 0017 图4为本发明IL23单域抗体与IL23抗原结合活性图。 0018 图5为本发明IL23单域抗体亲和力检测过程图； 0019 图6为本发明IL23单域抗体亲和力检测过程与线性拟合对比图。 0020 本发明目的的实现、 功能特点及优点将结合实施例， 参照附图做进一步说明。 具体实施方式 0021 下面将结合本发明实施例中的附图， 对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完 整地描述， 显然， 所。

12、描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基 于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其 他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0022 本发明实提出了一种IL23单域抗体、 核苷酸序列及试剂盒。 下述内容将针对所述 多肽及其筛选过程作详细介绍。 0023 首先， 本发明的多肽具有三个框架区和两个可变区： 0024 FR1： Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tr。

13、p Asn Leu Gly； 0025 CDR1： Asn Tyr Ala Leu Gly； 0026 FR2： Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala； 0027 CDR2： Ala Ile Asp Trp Arg His Ser Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys； 0028 FR3： Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Leu Glu Asp Thr 。

14、Arg Leu Tyr Tyr Cys Ala； 0029 CDR3： Ala Ser Ser Leu Phe Pro Ser Ser Ala Pro Arg Gln Tyr Asp； 0030 FR4： Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser。 0031 针对该IL23单域抗体， 本发明构建方式分为抗体库的构建、 特异性噬菌体的筛选、 特异性阳性单克隆的筛选、 IL23单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、 纯化。 下述内容将针对每 一步进行详细阐述。 0032 一、 抗体库的构建 0033 IL23抗原： 厂家北京义翘神州， 货号CT048-。

15、H08H。 0034 使用2mg上述抗原与等体积福氏佐剂混合。 选择成年健康的羊驼， 注射该抗原， 分9 次免疫， 第4次免疫后， 采取羊驼血清， 通过酶联免疫的方法， 测定抗原免疫效价。 0035 a0:分离淋巴细胞。 当免疫效价达到1万倍以上时， 采全血150ml， 使用QIAGEN试剂 说明书 2/7 页 4 CN 109970855 A 4 盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit(50)， 货号， 52304)将淋巴细胞分离。 0036 b0:裂解。 将分离后的淋巴细胞裂解， 得到CDNA， 使用QIAGEN试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit(5。

16、0)， 货号， 52304)， 测定得到CDNA浓度。 0037 c0： 巢式PCR扩增。 用cDNA合成试剂盒(MiniBESTAgarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0， TAKARA公司)， 采用巢式PCR方法， 进行两轮PCR扩增抗体重链可变区VHH基因片段； 0038 第一轮PCR扩增， 可得到大于800bp的普通抗体基因片段， 800bp500bp之间的为 缺失轻链的重链抗体基因片段， 以及500bp的重链抗体可变区片段VHH.通过电泳， 筛选出 800bp500bp的基因片段和500bp的基因片段。 0039 d0： 切胶回收， 将步骤c0中800。

17、bp500bp的基因片段切胶回收。 具体请参阅图1， 1 号带为普通抗体DNA和重链抗体DNA， 能够看到其中的两条亮带， 有大于800bp的(普通抗体 DNA)， 也有在500bp750bp之间的(重链抗体DNA)， 将该图中位于750bp500bp的条带切胶 回收； 2号带为重链抗体可变区片段VHH， 大小在500bp； 将2号带目的条带也进行回收。 0040 e0： VHH目的基因扩增。 以回收的完整重链抗体及其重链可变区的基因片段为模 板， 用VHH特异性引物经第二轮PCR扩增， 得到VHH目的基因(500bp)。 请参阅图2， 可以看到一 条亮带， VHH目的基因大约为500bp， 。

18、也就是该亮带中混杂有多种500bp左右的VHH目的基因。 0041 上述第一轮PCR引物包括SEQ ID NO： 1、 SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3核苷酸序列。 0042 其中SEQ ID NO： 1和SEQ ID NO： 2配对使用， 扩增得到图1中1道所示的两个条带； SEQ ID NO： 2和SEQ ID NO： 3配对使用， 扩增得到图1中2道所示的一条条带。 0043 第二轮PCR引物包括SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5核苷酸序列。 SEQ ID NO： 4和SEQ ID NO： 5配对使用， 得到图2所示的500bp目的基因。 0044 基因。

19、序列名称引物序列 SEQ ID NO： 1CGCCATCAAGGTACCAGTTGA SEQ ID NO： 2CGGGATCCCAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG SEQ ID NO： 3CCGCTCGAGTACTTCATTCGTTCCTGAGGAGACGGT SEQ ID NO： 4CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCT GG SEQ ID NO： 5CGGGATCCGAGGTACAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG 0045 f0： VHH片段转入TG1感受态细胞。 将上述得到的VHH片段连接到pHEN6噬菌体展示 载体质粒(通过BamHI,XhoI。

20、双酶切)， 之后将VHH片段及pHEN6载体(ZL20111028003.1)经连 接酶连接， 电转化至TG1感受态细胞中， 然后将感受态细胞涂布平板， 经菌落PCR验证VHH基 因插入率。 0046 当验证VHH基因插入成功后， 对重组基因进行克隆效率检测： 取电转化菌液涂布 LB/Amp平板上， 32， 过夜培养， 次日用菌落PCR的方法验证抗体的连接效率。 0047 其中， 菌落PCR的方法如下： 1、 用高压灭菌的牙签或枪头挑取单个菌落， 先在抗性 平板上点单克隆保存(标记)， 然后置于20ul Tritonx100(或去离子水)中搅和。 2、 将装有 20ul Tritonx100的。

21、EP管在100下煮2分钟。 3、 取1ul上清为模板， 加入PCR体系进行PCR 反应， PCR体系可以为20ul。 4、 琼脂糖凝胶电泳观察结果。 0048 当噬菌体抗体库的连接效率低于90时， 说明在操作失误， 需要重复上述实验过 程； 当噬菌体抗体库的效率达到90时， 进行下一步操作。 说明书 3/7 页 5 CN 109970855 A 5 0049 g0： 扩大培养， 保藏。 将电转化菌液涂布LB/Amp平板上， 32， 过夜培养物用2YT培 养基洗下， 以1:1000比例在2YT培养基下进行扩大培养， 加入辅助噬菌体M13K07 (Invitrogen)进行感染， 过夜培养， 离心。

22、， 收集上清后加入20PEG-2.5M NaCl混匀(噬菌体 在上清中)， 离心收集沉淀， 加入PBS和甘油进行重悬， 并保藏于-80备用。 0050 二、 特异性噬菌体的筛选 0051 由于经过巢式PCR扩增出来的VHH片段有多种， 而这些片段中， 并非所有这些基因 片段都是目标片段， 将这些片段VHH片段转入噬菌体后， 需要对目标噬菌体进行纯化， 下述 内容为纯化目标噬菌体的步骤： 0052 a1:CPBS溶液的配备。 将少量无脂牛奶加入到PBS溶液中， 其中， 无脂牛奶的占比在 1-5(封闭作用)； 将溶解在CPBS溶液中的IL23蛋白稀释至150 g/ml； 0053 b1： 将IL2。

23、3蛋白稀释液后， 150 l/孔进行包被； 0054 c1： 静置， 并弃包被液， 加入封闭液(1CPBS)300 l/孔， 37封闭2h； 0055 d1： 将筛选出来的噬菌体加入到微孔中， 并加入封闭液混匀至每孔体积150 l； 0056 e1： 室温孵育2h(噬菌体的外壳上分泌抗体， 抗体与IL23蛋白结合)； 0057 f1： 筛孔分别用PBST(含0.05Tween20)、 PBS各洗涤10次， 每次2min， 将没有结合 的噬菌体洗掉； 0058 g1： 加入TEA到筛孔中洗脱噬菌体， 吹吸混悬均匀， 室温静置10min； 0059 h1： 再次吹吸混悬均匀后加入到预冷的1M Tr。

24、is-HCl中混匀， 进行滴度的测定； 0060 i1:扩增并纯化扩增后的噬菌体。 0061 上述步骤a1至步骤i1， 重复三轮， 并以步骤i1的噬菌体作为下一轮步骤d1中的加入 微孔的噬菌体(第一轮的噬菌体来源于上述-80保藏备用的)， (第二轮筛选包被浓度为10 g/ml， 第三轮筛选包被浓度为1 g/ml。 二、 三轮各150 l/孔进行包被)。 0062 筛选结果详见下表 0063 筛选次数加入噬菌体抗体库总量洗脱液+Tris-HCl洗脱滴度 第一轮5.60E+11300ulTEA+200ulTris28/ul 第二轮5.20E+11150ul*5TEA+350ulTris6.76E+。

25、3/ul 第三轮5.03E+11150ul*5TEA+350ulTris1E+4/ul 0064 上述步骤a1至步骤i1以包被IL23抗原作为靶标， 采用固相筛选法从总噬菌体抗体 库进行3轮筛选， 检测每轮洗脱下来的噬菌体滴度， 由上表可以看出， 随着筛选轮数的增加， 包被浓度逐级减少， 但洗脱下来的噬菌体滴度增加， 也就是说IL23特异性噬菌体得到了高 效富集。 0065 三、 特异性阳性单克隆的筛选 0066 虽然上述噬菌体已经得到了高效富集， 但是任然残留有少量非特异性的噬菌体， 在在下述内容中， 将进一步纯化特异性IL23单域抗体基因。 具体步骤如下： 0067 a2： 通过SEQ I。

26、D NO： 4和SEQ ID NO： 5核苷酸序列， 对上述已经富集的IL23特异性 噬菌体进行PCR扩增， 获得的特异性IL23单域抗体基因(带有限制性内切酶BbsI和BamHI位 点的PCR产物)； 0068 b2： 用限 制性 内 切酶 B b s I 和 Ba m H I 分 别处 理 P C R 产 物 和 p S J F 2 载 体 说明书 4/7 页 6 CN 109970855 A 6 (ZL201110280031)， 经T4连接酶连接重组， 而获得能在大肠杆菌中高效表达的质粒sdAb- pSJF2； 0069 c2： 从生长菌落的琼脂平板上随机挑取多个单菌落， 然后接种在含。

27、有Amp的2YT液 体培养基的96孔深孔培养板中； 0070 d2： 培养4小时后， 将单克隆一一对应接种在带编号的以小格分隔的含Amp的LB固 体平板上； 0071 e2： 向深孔培养板加入IPTG至终浓度0.5mM诱导； 0072 f2： 培养过夜后， 收获表达蛋白的菌上清液； 0073 g2： 以IL23抗原进行ELISA测定， 选出Anti-IL23阳性克隆ELISA测定结果； 0074 h2： 挑选出的IL23阳性克隆， 经DNA测序以鉴定抗IL23单域抗体克隆的基因序列 SEQ ID NO： 6(或者与SEQ ID NO： 6互补的SEQ ID NO： 7)。 0075 SEQ I。

28、D NO： 6序列如下： 0076 CAGGTAAAGCTGGAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTACAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGC AGCCTCTGGATGGAACCTTGGTAATTATGCCTTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAGTTTGTA GCAGCTATCGACTGGCGTCATAGTTCATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACA CCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAGCAGCCTGAAACTTGAGGACACGCGCCTTTAT。

29、TACTGTGCAGCATCAAG CCTATTCCCTAGTAGTGCTCCCCGTCAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA。 0077 四、 IL23单域抗体在宿主大肠杆菌中表达、 纯化 0078 得到上述阳性单克隆后， 需要将其表达方可得到IL23抗体， 后续主要是通过大肠 杆菌表达， 然后纯化， 即可得到所需的IL23单域抗体。 具体操作过程如下： 0079 a3： 将上述含有质粒IL23的菌种接种在含氨基苄青霉素的LB培养板上， 37过夜。 在此， 由于pSJF2载体自身对氨基苄青霉素具备抗性， 从而， 在含氨基苄青霉素的LB培养板 。

30、上， 只有含有pSJF2载体的大肠杆菌能生长， 避免了其它杂菌的干扰； 0080 b3： 挑选单个菌落接种于5ml的含氨基苄青霉素的LB培养液中， 37， 摇床培养过 夜； 0081 c3： 转种2ml过夜培养物于200mL含氨基苄青霉素的LB培养液中； 0082 d3： 37摇床培养， 240转/分， 培养到OD值达0.40.6时， 加入0.51.0mM IPTG， 继续培养过夜， 然后离心， 收菌。 0083 e3： 高渗法裂解细菌， 离心， 收上清中可溶性单域抗体蛋白； 0084 f3： 经Ni+离子亲和层析获得纯度达95以上的蛋白。 0085 (图3与上一案例不同， 需要详细分析)具体。

31、请参照图3， 在图3中， M为蛋白分子标 准， 条带1为破菌后总蛋白粗提样品。 0086 条带2为总蛋白粗提过镍柱后的样品， 说明只有少量的样本被洗脱下来， Ni+柱中 还剩余有大量的样本蛋白。 0087 条带3为用含有40毫摩咪唑的洗脱过脱镍柱后剩余的样品， 说明经过进一步洗脱 后， 大部分蛋白都被洗脱下来。 0088 条带4为用含有100毫摩咪唑的洗脱液过脱镍柱后剩余的样品， 说明Ni+柱中， 没有 被洗脱下来的蛋白极少。 0089 条带5为用含有400毫摩咪唑的洗脱液过镍柱后剩余的样品， 通过此条带可以看 说明书 5/7 页 7 CN 109970855 A 7 出， Ni+柱的蛋白几乎。

32、全部被洗脱下来， 洗脱下来的目标蛋白较纯。 五、 单域抗体与IL23抗原 结合活性测定 0090 上述过程已经将目标抗体筛选并纯化出来， 为了验证目标抗体的活性， 实验步骤 如下： 0091 a4： 以0.05M Na2CO3NaHCO3(pH9.5)稀释IL23抗原至2 g/ml， 100 l/孔， 抗原包 被96孔板， 4孵育过夜； 0092 b4： 用PBS洗板三次， 300 l2BSA(或1CPBS)封闭96孔板， 37， 孵育2小时； 0093 c4： 加入不同稀释浓度的纯化的IL23单域抗体， 按100 l/孔加入， 37， 孵育1小 时； 0094 d4： 用0.05PBST洗板。

33、三次； 0095 e4： 加5000倍稀释的antiMyctag antibody(HRP)， 按100 l/孔加入， 37， 孵育1小 时； 0096 f4： 用0.05PBST洗板三次， 加TMB100 l/孔， 避光室温静置10分钟。 g4： 加入2M H2SO4 50 l/孔终止反应； 0097 g4： 用酶标仪测定450nm波长下的样品OD值。 0098 从图4可以看出， 即便IL23单域抗体与IL23抗原结合后的浓度在8ng/ml时， 依然可 以检测到较高的活性。 0099 图5为亲和力检测过程图与测算结果。 其中， 四条曲线分别为使用不同浓度梯度抗 体测得结果(1号线对应浓度为2。

34、35.3nM的抗体， 2号线对应浓度为470.6nM的抗体， 3号线对 应浓度为941.2nM的抗体， 4号线对应浓度为1882nM的抗体)。 横坐标为时间轴(0-900秒)， 纵 坐标为实验过程中机器读取的反应数值(Response)。 根据实验设计， 300秒前为抗原抗体结 合过程， 300秒-900秒为解离过程， 参照图5中的分割线。 根据结合过程中机读数值随时间的 变化， 可得结合常数Kon(1/Ms)。 根据解离过程中机读数值随时间的变化， 可得解离常数 Kdis(1/s)。 根据公式： 0100 亲和力常数KD解离常数Kdis/结合常数Kon， 可得使用不同浓度测得的IL17RA抗。

35、 体亲和力常数KD1.30E-7M。 各浓度梯度下检测结果一致， 实验结果可靠(参照图6中拟合 曲线及下表， R20.999)。 0101 0102 对于IL IL23抗体生产效率， 本发明使用分光光度计对纯化后得到的IL17RA抗体 进行浓度测定， 测得经表达、 提取、 纯化后蛋白总量为4.80mg。 因实施例中所用表达体系为 200ml， 因此， 本实施例中构建的IL IL23单域抗体原核表达系统单位表达量为2.40mg/ 100ml菌液。 说明书 6/7 页 8 CN 109970855 A 8 0103 通过分析计算最终获得的表达量， 可以证明实施例中所用的表达体系对蛋白的表 达效率，。

36、 即单位表达体积可获得的蛋白质量。 通常情况下， 表达量达到0.5mg/100ml， 即认为 体现出了较高的表达水平(相对于现有技术中的最高水准)， 本次IL23单域抗体的表达量达 到了2.40mg/100ml， 远高行业水准。 0104 以上所述仅为本发明的优选实施例， 并非因此限制本发明的专利范围， 凡是在本 发明的发明构思下， 利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换， 或直接/间接运用 在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。 说明书 7/7 页 9 CN 109970855 A 9 SEQUENCE LISTING 深圳普瑞金生物药业有限公司 IL23单域抗体的VHH。

37、链、 IL23单域抗体、 核苷酸序列及试剂盒 123 7 PatentIn version 3.5 1 309 PRT 人工序列 1 Gly Leu Asn Val Ala Leu Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Gly 1 5 10 15 Leu Tyr Gly Leu Tyr Val Ala Leu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Gly Leu 20 25 30 Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg Cys Tyr Ser 35 40 45 Ala Leu Ala A。

38、la Leu Ala Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Thr Arg Pro Ala 50 55 60 Ser Asn Gly Leu Tyr Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Thr Arg Pro Pro His Glu Ala Arg Gly Gly Leu Asn Ala Leu Ala 85 90 95 Gly Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Pro His Glu Val Ala Leu Ala 100 105 110 Leu Ala Ala Leu。

39、 Ala Ile Leu Glu Ala Ser Pro Thr Arg Pro Ala Arg 115 120 125 Gly His Ile Ser Ser Glu Arg Ser Glu Arg Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg 130 135 140 Ala Leu Ala Ala Ser Pro Ser Glu Arg Val Ala Leu Leu Tyr Ser Gly 145 150 155 160 Leu Tyr Ala Arg Gly Pro His Glu Thr His Arg Ile Leu Glu Ser Glu 165 170 175 Arg Ala。

40、 Arg Gly Ala Ser Pro Ala Ser Asn Thr His Arg Leu Tyr Ser 180 185 190 Ala Ser Asn Met Glu Thr Val Ala Leu Thr Tyr Arg Gly Leu Asn Met 195 200 205 Glu Thr Ser Glu Arg Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Ala Ser Pro Thr His 序列表 1/3 页 10 CN 109970855 A 10 210 215 220 Arg Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Cys Tyr 。

41、Ser Ala Leu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Ala Ser Glu Arg Ser Glu Arg Pro His Glu Ser Glu Arg Ser 245 250 255 Glu Arg Ala Leu Ala Ala Arg Gly Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Ala Ser 260 265 270 Pro Thr Tyr Arg Thr Arg Pro Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Gly Leu Tyr 275 280 285 Thr His Arg Gly Leu Asn Val Ala Leu Thr 。

42、His Arg Val Ala Leu Ser 290 295 300 Glu Arg Ser Glu Arg 305 2 21 DNA 人工序列 2 cgccatcaag gtaccagttg a 21 3 29 DNA 人工序列 3 cgggatccca ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36 4 43 DNA 人工序列 4 ccgctcgagt acttcattcg ttcctgagga gacggt 36 5 41 DNA 人工序列 5 ccgctcgagt gaggagacgg tgacctgg 28 6 47 序列表 2/3 页 11 CN 10997085。

43、5 A 11 DNA 人工序列 6 cgggatccga ggtacagctg gtggagtctg ggggag 36 7 366 DNA 人工序列 7 caggtaaagc tggaggagtc tgggggagga ttggtacagg ctgggggctc tctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatg gaaccttggt aattatgcct tgggctggtt ccgccaggct 120 ccagggaagg agcgtgagtt tgtagcagct atcgactggc gtcatagttc atactatgca 180 gactccgtga ag。

44、ggccgatt caccatctcc agagacaaca ccaagaacat ggtgtatctg 240 caaatgagca gcctgaaact tgaggacacg cgcctttatt actgtgcagc atcaagccta 300 ttccctagta gtgctccccg tcagtatgac tactggggcc aggggaccca ggtcaccgtc 360 tcctca 366 序列表 3/3 页 12 CN 109970855 A 12 图1 图2 说明书附图 1/3 页 13 CN 109970855 A 13 图3 图4 说明书附图 2/3 页 14 CN 109970855 A 14 图5 图6 说明书附图 3/3 页 15 CN 109970855 A 15 。