一株类肠膜魏斯氏菌及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910368183.5 (22)申请日 2019.05.05 (83)生物保藏信息 CGMCC No. 17539 2019.04.10 (71)申请人 西南大学 地址 400715 重庆市北碚区天生路2号 (72)发明人 曾凯芳马佳宏易兰花邓丽莉 姚世响阮长晴 (74)专利代理机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 代理人 武君 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23B 7/155(2006.01) C12R 1/01(2006.0。

2、1) (54)发明名称 一株类肠膜魏斯氏菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了保藏编号为CGMCCNo.17539 的 类 肠 膜 魏 斯 氏 菌 ( W e i s s e l l a paramesenteroides)JT13， 以及该类肠膜魏斯氏 菌 在 制备 抑 制 指 状 青 霉( P e n i c i l l i u m digitatum)的药物尤其是预防由指状青霉引起 的柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用。 本发明 不仅丰富了乳酸菌菌种资源库， 拓宽了乳酸菌在 果蔬保鲜领域的应用范围， 也为柑橘果实采后绿 霉病的防治提供了新的解决方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表3页。

3、 附图2页 CN 109988732 A 2019.07.09 CN 109988732 A 1.类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)JT13， 保藏编号为CGMCC No.17539。 2.权利要求1所述的类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)JT13在制备抑 制指状青霉(Penicillium digitatum)的药物中的应用。 3.如 权 利 要 求 2 所 述的 应 用 ， 其 特 征 在 于 ， 类 肠 膜 魏 斯氏 菌 (W e i s s e l l a paramesenteroides)JT13在制备预防。

4、由指状青霉(Penicillium digitatum)引起的柑橘果 实采后绿霉病的药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 109988732 A 2 一株类肠膜魏斯氏菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株类肠膜魏斯氏菌， 还涉及该类肠膜魏斯氏菌的应用。 背景技术 0002 乳酸菌是一类能够发酵糖类且主要产物为乳酸的革兰氏阳性杆菌或球菌， 对与其 亲缘关系较近的部分革兰氏阳性或阴性细菌具有良好的抑制作用， 目前广泛用于食品发 酵、 保鲜等领域。 但有关乳酸菌对真菌的抑制作用尚少见报道。 0003 柑橘是芸香科柑橘亚科柑橘属植物， 柑橘果实是世界上产量最多的水果， 在贮藏 中受。

5、微生物侵染和贮藏环境的影响极易出现腐烂、 水肿、 浮皮等现象， 严重影响果实的商品 价值。 由真菌指状青霉(Penicillium digitatum)引起的绿霉病是柑橘果实贮藏过程中主 要的侵染性病害。 目前柑橘果实采后病害防治主要采用多菌灵、 甲基托布津、 抑霉唑等化学 杀菌剂， 但存在化学杀菌剂的残留性、 微生物易对其产生抗药性等问题。 发明内容 0004 本发明的目的在于从柑橘果园中筛选、 鉴定具有抑制指状青霉效果特别是能够预 防柑橘果实采后绿霉病的乳酸菌， 以丰富乳酸菌菌种资源库， 拓宽乳酸菌在果蔬保鲜领域 的应用范围， 同时为柑橘果实采后绿霉病的防治提供新的解决方法。 0005 经。

6、研究， 本发明提供如下技术方案： 0006 1.类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)JT13， 保藏编号为CGMCC No.17539。 0007 2.类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)JT13在制备抑制指状青霉 (Penicillium digitatum)的药物中的应用。 0008 进一步， 类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)JT13在制备预防由指 状青霉(Penicillium digitatum)引起的柑橘果实采后绿霉病的药物中的应用。 0009 本发明的类肠膜魏斯氏菌(We。

7、issella paramesenteroides)JT13于2019年4月10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址： 北京市朝阳 区北辰西路1号院3号)， 保藏编号为CGMCC No.17539。 0010 本发明的有益效果在于： 本发明从柑橘果园中筛选出了具有抑制指状青霉效果特 别是能够预防由其引起的柑橘果实采后绿霉病的乳酸菌， 不仅丰富了乳酸菌菌种资源库， 拓宽了乳酸菌在果蔬保鲜领域的应用范围， 也为柑橘果实采后绿霉病的防治提供了新的解 决方法。 附图说明 0011 图1为乳酸菌对指状青霉的离体抑菌效果。 0012 图2为乳酸菌无菌发酵液对指状青霉。

8、的离体抑菌效果。 0013 图3为乳酸菌无菌发酵液对指状青霉引起的柑橘果实采后绿霉病的控制效果， 图 说明书 1/5 页 3 CN 109988732 A 3 中标有相同小写英文字母(a、 b、 c)的组之间不存在显著差异(p0.05)； 标有不同小写英文 字母(a、 b、 c)的组之间存在显著差异(p0.05)。 具体实施方式 0014 为了使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将结合附图对本发明的优 选实施例进行详细的描述。 0015 1、 乳酸菌的筛选 0016 从重庆市北碚区缙云山柑橘果园分别采集柑橘果实、 叶片、 土壤和花生叶片作为 样品。 将各样品分别完全浸没于100mL。

9、 MRS肉汤培养基中， 37富集培养24h， 10倍梯度稀释 后涂布于含有0.3CaCO3的MRS平板上， 37培养48h， 挑选具有明显溶钙圈的单个菌落进 行分离纯化， 并进行镜检和革兰氏染色。 纯化后的菌种置于-80冰箱保存。 0017 结果如表1所示， 实验共筛选出68株疑似菌株， 其中16株来自柑橘果实， 6株来自柑 橘叶片， 24株来自柑橘果园土壤， 22株来自花生叶片， 镜检观察到球状和杆状两种形态， 革 兰氏染色均呈阳性。 0018 表1乳酸菌的筛选 0019 说明书 2/5 页 4 CN 109988732 A 4 0020 0021 2、 乳酸菌对指状青霉的离体抑菌效果 00。

10、22 将筛选出的68株菌株通过双层平板法明确其对指状青霉的离体抑菌效果。 0023 将各疑似菌株挑取一菌环接种于20mL MRS肉汤培养基中， 37培养48h得到种子 液； 吸取1mL种子液接种于100mL MRS肉汤培养基中， 37培养48h； 随后用接种针在MRS平板 中间平行划两条长度为2cm的直线， 将平板置37培养48h； 然后加入10mL含104指状青霉孢 子的PDA培养基， 待培养基完全凝固后， 将平板置25培养； 观察抑菌现象， 以未接种菌株的 MRS肉汤培养基划线为对照， 筛选出对指状青霉具有较高抑制活性的菌株。 0024 结果如图1所示， 实验共筛选出10株对指状青霉具有较。

11、高抑制活性的菌株， 其中7 株来自花生叶片， 2株来自柑橘果园土壤， 1株来自柑橘叶片。 0025 3、 乳酸菌的鉴定 0026 将筛选出的10株对指状青霉具有较高抑制活性的菌株通过16S rDNA序列分析进 行鉴定。 0027 取培养菌液， 采用基因组DNA提取试剂盒提取菌体DNA； 采用通用引物PCR扩增 16srDNA序列， 正向引物为5 -agagtttgatcctggctcag-3 (SEQ ID No.1)， 反向引物为5 - ctacggctaccttgttacga-3 (SEQ ID No.2)； 反应体系包括： 12.5 L 2Es Taq MasterMix (Dye),1。

12、 L各引物和1 L DNA模板； PCR反应过程如下： 预变性， 94， 2min； 然后30个循环： 变 性， 94， 30s； 退火， 55， 30s； 延伸72， 30s； 终延伸， 72， 2min。 PCR扩增产物采用1琼 脂糖凝胶电泳进行检测， 委托上海生工生物股份有限公司进行测序， 测序结果通过NCBI中 的BLAST程序进行同源性比对分析。 说明书 3/5 页 5 CN 109988732 A 5 0028 结果见表2， 10株对指状青霉具有较高抑制活性的菌株经鉴定， 其中8株均为 Lactobacillus sucicola， 1株为类肠膜魏斯氏菌(Weissella par。

13、amesenteroides)， 1株为 乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)。 0029 表2乳酸菌的鉴定 0030 0031 将所得Lactobacillus sucicola菌株命名为JT03， 于2019年4月10日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号 院3号)， 保藏编号为CGMCC No.17538。 其16S rDNA序列如SEQ ID No.3所示。 0032 将所得类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)菌株命名为JT13， 于 2019年4月10日保藏。

14、于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号)， 保藏编号为CGMCC No.17539。 其16S rDNA序列如SEQ IDNo.4所示。 0033 将所得乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌株命名为JY03， 于2019年4月 10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址： 北京市朝 阳区北辰西路1号院3号)， 保藏编号为CGMCC No.17540。 其16S rDNA序列如SEQ ID No.5所 示。 0034 4、 乳酸菌无菌发酵液对指状青霉的离体抑菌效果 00。

15、35 考察经鉴定的3株乳酸菌的无菌发酵液对指状青霉的离体抑菌效果。 0036 吸取1mL乳酸菌种子液接种于100mL MRS肉汤培养基中， 37培养； 每隔2h取出一 定量发酵液， 5000rpm离心15min， 上清液过0.22 m微孔膜， 得到不同培养时间的无菌发酵 液。 将100 L发酵液与100 L 104指状青霉孢子悬浮液(含5PDB培养基)混合， 未接种乳酸 菌的MRS肉汤培养基为对照， 25培养48h， 测定OD600值。 0037 结果如图2所示， 3株乳酸菌(JT03、 JT13、 JY03)的无菌发酵液对指状青霉均存在不 同程度的抑制效果， 且随着培养时间的延长， 抑制效果。

16、逐渐增强， 培养至60h后能够完全抑 制指状青霉的生长。 0038 5、 乳酸菌无菌发酵液对柑橘果实采后绿霉病的控制效果 0039 通过同孔接种实验考察经鉴定的3株乳酸菌的无菌发酵液对柑橘果实采后绿霉病 的抑制效果。 说明书 4/5 页 6 CN 109988732 A 6 0040 吸取1mL乳酸菌种子液接种于100mL MRS肉汤培养基中， 37培养48h， 5000rpm离 心15min， 上清液过0.22 m微孔膜， 得到乳酸菌无菌发酵液； 挑选大小均一、 成熟度一致、 无 机械伤的健康柑橘果实， 用2次氯酸钠溶液浸泡2min进行表面消毒， 水冲洗晾干； 果实赤 道部位用70酒精消毒后。

17、， 用打孔器在果实赤道部位等距打2个小孔(直径3mm， 深3mm)， 接 种10 L 104指状青霉孢子悬浮液， 待液体吸收完全后再接种20 L乳酸菌无菌发酵液， 以未 接种乳酸菌的MRS肉汤培养基为对照， 待液体吸收完全后将果实进行单果包装， 放置于25 、 相对湿度90-95的环境中贮藏； 每天观察记录果实发病率及病斑直径。 0041 结果如图3所示， 3株乳酸菌(JT03、 JT13、 JY03)的无菌发酵液均能够在一定程度上 抑制柑橘果实的发病和病斑直径的增长。 其中JT03和JT13的效果更好。 0042 最后说明的是， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制， 尽管通过参 照。

18、本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述， 但本领域的普通技术人员应当理解， 可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变， 而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。 说明书 5/5 页 7 CN 109988732 A 7 序列表 西南大学 一株类肠膜魏斯氏菌及其应用 5 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 1 agagtttgat cctggctcag 20 2 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 2 ctacggctac cttgttacga 20 3 1032 D。

19、NA Lactobacillus sucicola JT03 3 ggagggcggc agctatacat gcagtcgtac gcaaaacttt ctctgagtgt tcgcactcac 60 tgaaagattt gagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggt aacctgccca gaagaagggg 120 ataacacttg gaaacaggtg ctaataccgt ataacaacaa agaccgcatg gtctttgttt 180 aaaagatggt tctgctatca cttctggatg gacccgcggc gtattagcta gtt。

20、ggtgagg 240 taatggctca ccaaggcaat gatacgtagc cgaactgaga ggttgatcgg ccacattggg 300 actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360 aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aaactctgtt 420 gttagagaag aacgtgtgtg agagtaactg ttcatgcagt gacggtatct aaccagaaag 480 ccacggct。

21、aa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540 ttattgggcg taaagggaac gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctt 600 aaccgaagtc gtgcattgga aactggaaga cttgagtgca gaagaggaga gtggaactcc 660 atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaaa gcggctctct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gttcga。

22、aagc atgggtagca aacaggatta gataccctgg 780 tagtccatgc cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacgatcgc aagattgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960 序列表 1/3 页 8 CN 109988732 A 8 cttaccaggt cttgacat。

23、ct tctgccaatc tgagagatca gatgttccct tcggggacaa 1020 gaatgacacg tg 1032 4 1034 DNA 类肠膜魏斯氏菌JT13(Weissella paramesenteroides JT13) 4 tggcatgcgg tgctatacat gcagtcgaac gctttgtctt taattgatct gacgagcttg 60 ctctgatttg attttatctg acaaagagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggtaacct 120 acctcttagc aggggataac atttggaaa。

24、c aagtgctaat accgtataat accaacaacc 180 gcatggttgt tggttgaaag atggttctgc tatcactaag agatggaccc gcggtgcatt 240 agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg 300 atcggccaca atgggactga gacacggccc atactcctac gggaggcagc agtagggaat 360 cttccacaat gggcgcaagc ctgatggagc aacgccgcgt gtgtgat。

25、gaa gggtttcggc 420 tcgtaaaaca ctgttataag agaagaacgg cactgagagt aactgttcag tgtgtgacgg 480 tatcttacca gaaaggaacg gctaaatacg tgccagcagc cgcggtaata cgtatgttcc 540 aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcaga cggttattta agtctgaagt 600 gaaagccctc agctcaactg aggaatggct ttggaaactg gatgacttga gtgcagtaga 660 g。

26、gaaagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720 cgaaggcggc tttctggact gtaactgacg ttgaggctcg aaagtgtggg tagcaaacag 780 gattagatac cctggtagtc cacaccgtaa acgatgagtg ctagatgttc gagggtttcc 840 gcccttgagt gtcgcagcta acgcattaag cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt 900 tgaaactcaa aggaattgac。

27、 ggggacccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960 agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcccttgc taatcctaga aataggacgt 1020 tcccttcggg gaca 1034 5 895 DNA 乳酸片球菌JY03(Pediococcus acidilactici JY03) 5 aaggatgcgc atgctataca tgcagtcgaa cgaacttccg ttaattgatt atgacgtgct 60 tgcactgaat gagattttaa cacgaagtga gtgg。

28、cggacg ggtgagtaac acgtgggtaa 120 cctgcccaga agcaggggat aacacctgga aacagatgct aataccgtat aacagagaaa 180 accgcctggt tttcttttaa aagatggctc tgctatcact tctggatgga cccgcggcgc 240 attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgatga tgcgtagccg acctgagagg 300 gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc ag。

29、cagtaggg 360 aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaagggtttc 420 ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa cgtgggtgag agtaactgtt cacccagtga 480 cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540 序列表 2/3 页 9 CN 109988732 A 9 ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggc。

30、ggtctt ttaagtctaa 600 tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt gcattggaaa ctgggagact tgagtgcaga 660 agaggatagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga agaacaccag 720 tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa 780 caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga ttactaagtg ttggagggtt 840 tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt aagtaatccg cctggggagt acgac 895 序列表 3/3 页 10 CN 109988732 A 10 图1 图2 说明书附图 1/2 页 11 CN 109988732 A 11 图3 说明书附图 2/2 页 12 CN 109988732 A 12 。