基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910292813.5 (22)申请日 2019.05.08 (71)申请人 宁夏大学 地址 750021 宁夏回族自治区银川市西夏 区贺兰山西路489号 (72)发明人 罗瑞明耿多王丽娟陈辉 宋学丽 (74)专利代理机构 银川瑞海陈知识产权代理事 务所(普通合伙) 64104 代理人 赵嬛嬛 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12Q 1/6888(2018.01) (54)发明名称 一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉 检测方法 。

2、(57)摘要 本发明属于食品检测技术领域； 具体检测方 法如下： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA、 分别 检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样 品DNA浓度、 对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR 基因序列进行荧光标记、 利用SSR序列设计的引 物进行PCR扩增、 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结 果、 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR 基因序列分型、 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 本发明用于特异性地鉴别出滩羊、 小尾寒羊和滩 寒杂交羊， 该方法耗时短,操作简便,特异性强, 采用峰值谱图对检测结果进行比对， 检测结果能 互相验证,可以用于无法从形态学上加以识别的 。

3、三种近缘绵羊物种的精确鉴定， 有利于滩羊产业 的持续健康发展和消费者权益。 权利要求书2页 说明书8页 附图7页 CN 110004218 A 2019.07.12 CN 110004218 A 1.一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法， 其特征在于： 具体检测方法如 下： 第一步： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA： 分别取2550只滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂 交羊的肌肉组织分别研磨成粉末， 分别加到离心管中， 加入细胞裂解液， 离心处理至样品完 全裂解， 待用， 其中提取的滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊羊肉样品DNA为标准样品DNA； 再次 分别提取滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊。

4、共计324只绵羊肉样品DNA， 记为待测样品DNA； 第二步： 分别检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样品DNA浓度： 分别提取第一 步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各1-5 L分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定 提取的DNA的纯度； 第三步： 对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记： 采用MISA软件对 上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测， 分别选取标准样品DNA 和待测样品DNA中的SSR基因序列， 采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记， 得到 标准样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DN。

5、A的SSR基因序列荧光标记引物； 第四步： 利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增： 提取第一步中裂解后的标准样品DNA和 待测样品DNA各0.5-1.5 g， 分别向其中加入2TaqPlusMasterMix10-15 L、 第三步已合成 的SSR基因序列荧光标记引物、 上游引物0.3-0.8 L、 下游引物0.3-0.8 L、 ， 并且通过ddH2O 定容至25 L， 将制得的PCR反应体系进行PCR扩增； 第五步： 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果： 称取1琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶放入 水平电泳槽中向其中加入1TAE电泳缓冲， 分别将第四步PCR扩增后的标准样品DNA和待测 样品DNA的。

6、SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中， 将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进行成 像分析， 检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况； 第六步： 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型： 采用3730 xl设备分 别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图； 第七步： 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 根据第六步检测的标准样品DNA和待测样品 DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图， 将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳 峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的峰形。

7、 位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。 2.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法， 其特征 在于： 第三步中所述的对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记采用的 荧光标记试剂为FAM试剂和HEX试剂。 3.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法， 其特征 在于： 所述的PCR扩增的具体步骤如下： 将第四步中制得的PCR反应体系条件在90-100 预变性1-5min， 在90-100变性20-40s， 在55-65退火20s-40s， 在70-74延伸20- 40s， 上述过程重复操作15-30次， 再在70。

8、-74修复延申4-8min。 4.根据权利要求1所述的一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法， 其特征 在于： 第六步中所述的毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型的具体步 骤如下： 量取900-1000uL HIDI溶液和5uL-15uL LIZ500溶液混合均匀， 加入到96孔反应板 中， 每孔加入10uL； 将96孔板置于平板离心机中， 1100-1300rmp离心10s； 使用12排10 L排 枪， 对照STR检测表， 在96孔板对应的孔中加入40pg-50pg的PCR扩增后的标准样品DNA或待 权利要求书 1/2 页 2 CN 110004218 A 2 。

9、测样品DNA； 将96孔板置于平板离心机中， 1100-1300rmp离心10s； 使用封板膜密封96孔板， 振荡， 将96孔板置于平板离心机中， 1100-1300rmp离心10s， 进行毛细管电泳检测。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110004218 A 3 一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法 技术领域： 0001 本发明属于食品检测技术领域， 具体涉及一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵 羊肉检测方法。 背景技术： 0002 SSR是Simple Sequence Repeat的缩写， 意思是简单重复序列标记， SSR是以PCR技 术为核心的DNA分子标记技术。

10、， 或称微卫星序列标记(Microsatellite sequence， MS)， 或短 串联重复标记(Short Tandem Repeat， STR)。 0003 1982年， Hamade等人发现了简单重复序列标记(SSR)技术， 或称微卫星序列标记 (Microsatellite sequence， MS)， 或短串联重复标记(Short Tandem Repeat， STR)。 真核生 物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列。 按重复基序的长度 可将串联重复序列分为卫星DNA(基序100-300bp)、 小卫星DNA(基序10-60bp)、 微卫星DNA (基序。

11、1-6bp)和中卫星DNA(由不同大小串联重复组成)等。 微卫星是由DNA复制或修复过程 中DNA滑动和错配或者有丝分裂、 减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的。 微卫星的突 变率在不同物种、 同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。 尽管 微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置， 但其两端序列多是保守的单拷贝序列， 根据这两 端的序列设计一对特异引物， 通过PCR技术将期间的核心微卫星DNA序列扩增出来， 利用电 泳分析技术就可以得到其长度的多态性， 此即SSR标记的原理。 SSR或STR标记具有高度重复 性、 丰富的多态性、 共显性、 高度可靠性等优点。 0004 滩羊。

12、(Tan sheep)是宁夏优势特色畜种， 国家二级保护绵羊畜种。 宁夏盐池县为滩 羊主产区， 优良的遗传型加之盐池县土壤、 水矿物质丰富， 牧草品种繁多等特殊生态因素， 使滩羊肉味美， 质嫰， 无腥膻味， 深受我国及新丝路经济带许多国家、 地区消费者青睐。 滩羊 产业是宁夏极力打造的优势特色产业。 因滩羊为单羔生， 产量小， 全宁夏年出栏数仅300万 只， 市场供不应求， 价格看好， 于是， 一些不法经销商将多羔生小尾寒羊及滩寒杂交羊肉冒 充滩羊肉混淆售卖， 严重影响了滩羊产业的持续健康发展和消费者权益。 因此， 发明一种滩 羊肉分子鉴定的方法， 建立近缘绵羊属滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊肉。

13、的精准鉴定方法成 为宁夏滩羊产业发展必须突破的技术瓶颈。 0005 滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊是同属亚种范畴， 亲缘关系非常接近， 基因序列差异 的研究分析是羊肉基原鉴定成功与否的关键。 因此本发明基于物种特异性STR-SSR， 解决了 近缘三种绵羊鉴别困难的问题， 建立了近缘绵羊属滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊肉的精准 鉴定方法。 发明内容： 0006 本发明的目的在于提供一种用于鉴别滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊的方法。 其能 够解决现有技术中近缘三种绵羊肉滩羊、 小尾寒羊和鉴别困难、 成本高、 检测时间长、 误差 大等问题。 说明书 1/8 页 4 CN 110004218 A 4 000。

14、7 一种基于物种特异性STR-SSR的近缘绵羊肉检测方法， 具体检测方法如下： 0008 第一步： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA： 分别取2550只滩羊、 小尾寒羊和滩 寒杂交羊的肌肉组织分别研磨成粉末， 分别加到离心管中， 加入细胞裂解液， 离心处理至样 品完全裂解， 待用， 其中提取的滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊羊肉样品DNA为标准样品DNA； 再次分别提取滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只绵羊肉样品DNA， 记为待测样品DNA； 0009 第二步： 分别检测提取的标准样品DNA和待测样品DNA羊肉样品DNA浓度： 分别提取 第一步中裂解后的标准样品DNA和待测样品DNA各1-5。

15、 L分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪 测定提取的DNA的纯度； 0010 第三步： 对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记： 采用MISA软 件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测， 分别选取标准样 品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列， 采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记， 得到标准样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引 物； 0011 第四步： 利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增： 提取第一步中裂解后的标准样品 DNA和待测样品DNA各0.5-1.5 g， 分别向其中加。

16、入2TaqPlusMasterMix10-15 L、 第三步已 合成的SSR基因序列荧光标记引物、 上游引物0.3-0.8 L、 下游引物0.3-0.8 L、 ， 并且通过 ddH2O定容至25 L， 将制得的PCR反应体系进行PCR扩增； 0012 第五步： 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果： 称取1琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶 放入水平电泳槽中向其中加入1TAE电泳缓冲， 分别将第四步PCR扩增后的标准样品DNA和 待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中， 将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进 行成像分析， 检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况； 0013。

17、 第六步： 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型： 采用3730 xl设 备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图； 0014 第七步： 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 根据第六步检测的标准样品DNA和待测 样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图， 将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管 电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的 峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。 0015 优选的， 第三步中所述的对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光 标记采用的荧光。

18、标记试剂为FAM试剂和HEX试剂。 0016 优选的， PCR扩增的具体步骤如下： 将第四步中制得的PCR反应体系条件在90- 100预变性1-5min， 在90-100变性20-40s， 在55-65退火20s-40s， 在70-74延 伸20-40s， 上述过程重复操作15-30次， 再在70-74修复延申4-8min。 0017 优选的， 第六步中所述的毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分 型的具体步骤如下： 量取900-1000uL HIDI溶液和5uL-15uL LIZ500溶液混合均匀， 加入到 96孔反应板中， 每孔加入10uL； 将96孔板置于平板离心机中， 11。

19、00-1300rmp离心10s； 使用12 排10 L排枪， 对照STR检测表， 在96孔板对应的孔中加入40pg-50pg的PCR扩增后的标准样品 DNA或待测样品DNA； 将96孔板置于平板离心机中， 1100-1300rmp离心10s； 使用封板膜密封 96孔板， 振荡， 将96孔板置于平板离心机中， 1100-1300rmp离心10s， 进行毛细管电泳检测。 0018 本发明用于特异性地鉴别出滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊， 该方法耗时短,操作简 说明书 2/8 页 5 CN 110004218 A 5 便,特异性强,采用峰值谱图对检测结果进行比对， 检测结果能互相验证,可以用于无法从 。

20、形态学上加以识别的滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊肉及深加工肉产品， 用于此三种近缘绵 羊物种的精确鉴定， 有利于滩羊产业的持续健康发展和消费者权益， 解决了宁夏滩羊产业 发展必须突破的一项技术瓶颈。 0019 本方法所使用的特异性SSR荧光标记引物能够快速、 特异、 灵敏地检测出滩羊、 小 尾寒羊和滩寒杂交羊源性成分， 其具有如下特点： 0020 1.特异性强： 本发明提供的一种基于STR-SSR的三种近缘绵羊肉检测方法， 从100 对引物中筛选得到三对核心SSR荧光标记引物， 多态性丰富， 完全适用于STR-SSR标准分型 峰值谱图的构建。 0021 2.精确度高： 本发明方法采用峰值谱图对检。

21、测结果进行比对， 检测结果能互相验 证， 对于近缘绵羊品种肉及肉制品， 滩羊肉、 小尾寒羊肉、 滩寒杂交肉的鉴别快速准确； 0022 3.操作简便： 本发明方法通过毛细管电泳检测近缘绵羊肉及肉制， 比对STR-SSR标 准分型峰值谱图， 操作简便易行。 附图说明： 0023 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍。 0024 附图1为实施例一中滩羊的STR-SSR标准分型峰值谱图； 0025 附图2为实施例一中小尾寒羊的STR-SSR标准分型峰值谱图； 0026 附图3为实施例一中滩寒杂交羊的STR-SSR标准分型峰值谱图； 0027 附图4为。

22、实施例一中的部分DNA提取质量结果电泳图。 0028 附图5为实施例一中的滩羊样本标号为6931037_516检测结果； 0029 附图6为实施例一中的滩羊样本标号为6815452_409检测结果； 0030 附图7为实施例一中的滩羊样本标号为6889052_460检测结果； 0031 附图8为实施例一中的小尾寒羊标号为6815452_409检测结果； 0032 附图9为实施例一中的小尾寒羊标号为6815452_409检测结果； 0033 附图10为实施例一中的小尾寒羊标号为6889052_460检测结果； 0034 附图11为实施例一中的滩寒杂交羊标号为6931037_516检测结果； 00。

23、35 附图12为实施例一中的滩寒杂交羊标号为6815452_409检测结果； 0036 附图13为实施例一中的滩寒杂交羊标号为6889052_460检测结果； 具体实施方式： 0037 为使本发明的目的、 技术方案和优点更加清楚明白， 下面结合实施方式和附图， 对 本发明做进一步详细说明， 在此， 本发明的示意性实施方式及其说明用于解释本发明， 并不 作为对本发明的限定。 0038 实施例一： 0039 第一步： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA： 分别取25只滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂 交羊的肌肉组织分别用液氮研磨成粉末， 加到1 .5L离心管中， 加入400LBuffer Digestion。

24、， 震荡混匀。 65水浴1h至细胞完全裂解； 加入200 L Buffer PA， 充分颠倒混匀， 说明书 3/8 页 6 CN 110004218 A 6 置于-20冰箱放置5min； 室温10,000rpm离心5min， 将上清液吸取500 L转移到新的1.5 L 的离心管中； 放入离心机中在12,000rpm离心取上清； 加入等体积的异丙醇， 颠倒5次使之充 分混匀， 室温放置2min； 室温10,000rpm离心5min， 弃上清； 加入1 L75乙醇， 颠倒漂洗 1min， 10,000rpm离心2min， 弃上清； 开盖室温倒置5min至残留的乙醇完全挥发； 得到的标准 羊肉样品D。

25、NA， 提取的标准羊肉样品DNA可立即进行下一步实验或-20保存； 用同样的方法 提取滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只混合绵羊样品DNA， 提取的DNA为待测羊肉样品 DNA； 0040 第二步： 分别检测提取的标准样品DNA和待测样DNA浓度： 分别提取第一步中裂解 后的标准样品DNA和待测样品DNA各1 L分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取的DNA 的纯度； 具体步骤如下： 根据实验的样品， 开机后， 分别选择标准样品DNA的双链DNA和待测 样品DNA的双链DNA； 1mm光程， 使用移液器将空白对照样品点到样品孔位置， 按Blank键对设 备做空白校准。 校准后， 使用吸水。

26、纸将空白样品从样品孔处擦拭干净， 同时擦拭干净样品上 盖的液体； 分别将标准样品DNA和待测样品DNA点到样品孔处， 盖上样品盖， 然后按Measure 键进行测量； 按Results键， 分别获得标准样品DNA和待测样品DNA的纯度测试结果， 其中空 白对照样为水。 0041 第三步： 对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记： 采用MISA软 件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测， 分别选取标准样 品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列， 采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记， 得到标准样品DNA的SSR基因序列荧光。

27、标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引 物； 0042 第四步： 利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增： 提取第一步中裂解后的标准样品 DNA和待测样品DNA各0.5 g， 分别向其中加入2Taq Plus Master Mix 10 L、 第三步已合 成的SSR基因序列荧光标记引物、 上游引物0.3 L、 下游引物0.3 L、 ， 并且通过ddH2O定容至 25 L， 将值得的PCR反应体系进行PCR扩增； 0043 第五步： 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果： 称取1琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶 放入水平电泳槽中向其中加入1TAE电泳缓冲， 分别将第四步PCR扩增后的标准样品DN。

28、A和 待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中， 将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进 行成像分析， 检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况； 0044 第六步： 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型： 采用3730 xl设 备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图； 毛 细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型的具体步骤如下： 量取990uL HIDI 溶液和10uL LIZ500溶液混合均匀， 加入到96孔反应板中， 每孔加入10uL； 将96孔板置于平 板离心机中， 1100rmp离。

29、心10s即停； 使用12排10 L排枪， 对照STR检测表， 在96孔板对应的孔 中加入45pg的PCR扩增后的标准样品DNA或待测样品DNA； 将96孔板置于平板离心机中， 1100rmp离心10s即停； 使用封板膜密封96孔板， 振荡， 将96孔板置于平板离心机中， 1100rmp 离心10s即停， 进行毛细管电泳检测。 0045 第七步： 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 根据第六步检测的标准样品DNA和待测 样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图， 将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管 电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的。

30、 说明书 4/8 页 7 CN 110004218 A 7 峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。 0046 由附图1可知， 滩羊引物经检测， 确定荧光引物对滩羊源性肉特异性良好， 根据 STR-SSR分型峰图， 建立了滩羊STR-SSR标准分型峰值谱图； 滩羊样本标号为6931037_516的 特征数据Size为109.35/137.35； 小尾寒羊样本标号为6931037_516的特征数据Size为 109.35； 滩寒杂交羊样本标号为6931037_516的特征数据Size为109.35； 由此表明特异性荧 光引物样本标号为6931037_516可以将滩羊与小尾寒羊和滩寒杂交羊区分开来。。

31、 0047 由附图2可知， 小尾寒羊引物经检测， 确定6815452_409荧光引物对小尾寒羊源性 肉特异性良好， 根据STR-SSR分型峰图， 建立了小尾寒羊STR-SSR标准分型峰值谱图。 小尾寒 羊样本标号为6815452_409的特征数据Size为215.80； 滩羊样本标号为6815452_409的特征 数据Size为107.11； 滩寒杂交羊样本标号为6815452_409的特征峰Size为107.80； 由此表明 特异性荧光引物样本标号为6815452_409可以将小尾寒羊与滩羊和滩寒杂交羊区分开来。 0048 由附图3可知， 滩寒杂交羊引物经检测， 确定样本标号为6889052。

32、_460荧光引物对 滩寒杂交羊肉特异性良好， 根据STR-SSR分型峰图， 建立了滩寒杂交羊STR-SSR标准分型峰 值谱图。 滩寒杂交羊样本标号为6889052_460的特征峰Size为275.00； 滩羊样本标号为 6889052_460的特征数据Size为278.00/275.00； 小尾寒羊样本标号为6889052_460的特征 数据Size为278.00/275.00； 由此表明特异性荧光引物样本标号为6815452_409可以将滩寒 杂交羊与滩羊和小尾寒羊区分开来。 0049 由附图4可知， 获得的DNA质量良好， DNA完整， 无降解。 0050 由附图5可知， 以荧光引物样本标。

33、号为6931037_516检测样本sheep1， 检测结果与 滩羊STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为109.35/137.35。 0051 由附图6可知， 以荧光引物样本标号为6931037_409检测样本sheep1， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为107.00。 0052 由附图7可知， 以荧光引物样本标号为6931037_460检测样本sheep1， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为278.00/275.00。 0053 根据图5-7的检测结果， 样本sheep1。

34、为滩羊。 0054 由附图8可知， 以荧光引物样本标号为6931037_516检测样本sheep2， 检测结果与 滩羊STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为109.35。 0055 由附图9可知， 以荧光引物样本标号为6931037_409检测样本sheep2， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为215.8。 0056 由附图10可知， 以荧光引物样本标号为6931037_460检测样本sheep2， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为278.00/275.00。 0057 根据。

35、图8-10的检测结果， 样本sheep2为小尾寒羊。 0058 由附图11可知， 以荧光引物样本标号为6931037_516检测样本sheep3， 检测结果与 滩羊STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为109.35。 0059 由附图12可知， 以荧光引物样本标号为6931037_409检测样本sheep3， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Size为107.80。 0060 由附图13可知， 以荧光引物样本标号为6931037_460检测样本sheep3， 检测结果与 STR-SSR标准分型峰值谱图比对， 结果显示检测特征峰Si。

36、ze为275.00。 0061 根据图11-13的检测结果， 样本sheep3为滩寒杂交羊。 说明书 5/8 页 8 CN 110004218 A 8 0062 以上所述的具体实施方式， 对本发明的目的、 技术方案和有益效果进行了进一步 详细说明， 所应理解的是， 以上所述仅为本发明的具体实施方式而已， 并不用于限定本发明 的保护范围， 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含 在本发明的保护范围之内。 0063 实施例二： 0064 第一步： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA： 分别取40只滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂 交羊的肌肉组织分别用液氮研磨成粉末， 。

37、加到1 .5L离心管中， 加入400LBuffer Digestion， 震荡混匀。 65水浴1h至细胞完全裂解； 加入200 L Buffer PA， 充分颠倒混匀， 置于-20冰箱放置5min； 室温10,000rpm离心5min， 将上清液吸取525 L转移到新的1.5 L 的离心管中； 放入离心机中在12,000rpm离心取上清； 加入等体积的异丙醇， 颠倒7次使之充 分混匀， 室温放置2.5min； 室温10,000rpm离心5min， 弃上清； 加入1 L 75乙醇， 颠倒漂洗 2min， 10,000rpm离心2min， 弃上清； 开盖室温倒置8min至残留的乙醇完全挥发； 得到。

38、的标准 羊肉样品DNA， 提取的标准羊肉样品DNA可立即进行下一步实验或-20保存； 用同样的方法 提取滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只混合绵羊样品DNA， 提取的DNA为待测羊肉样品 DNA； 0065 第二步： 分别检测提取的标准样品DNA和待测样DNA浓度： 分别提取第一步中裂解 后的标准样品DNA和待测样品DNA各1 L分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取的DNA 的纯度； 具体步骤如下： 根据实验的样品， 开机后， 分别选择标准样品DNA的双链DNA和待测 样品DNA的双链DNA； 1mm光程， 使用移液器将空白对照样品点到样品孔位置， 按Blank键对设 备做空白校准。 。

39、校准后， 使用吸水纸将空白样品从样品孔处擦拭干净， 同时擦拭干净样品上 盖的液体； 分别将标准样品DNA和待测样品DNA点到样品孔处， 盖上样品盖， 然后按Measure 键进行测量； 按Results键， 分别获得标准样品DNA和待测样品DNA的纯度测试结果， 其中空 白对照样为水。 0066 第三步： 对标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记： 采用MISA软 件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测， 分别选取标准样 品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列， 采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记， 得到标准样品DNA的。

40、SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引 物； 0067 第四步： 利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增： 提取第一步中裂解后的标准样品 DNA和待测样品DNA各0.5-1.5 g， 分别向其中加入2Taq Plus Master Mix 12 L、 第三步 已合成的SSR基因序列荧光标记引物、 上游引物0.5 L、 下游引物0.5 L、 ， 并且通过ddH2O定 容至25 L， 将值得的PCR反应体系进行PCR扩增； 0068 第五步： 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果： 称取1琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶 放入水平电泳槽中向其中加入1TAE电泳缓冲， 分别将第四步。

41、PCR扩增后的标准样品DNA和 待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中， 将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进 行成像分析， 检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况； 0069 第六步： 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型： 采用3730 xl设 备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图； 毛 细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型的具体步骤如下： 量取995uL HIDI 说明书 6/8 页 9 CN 110004218 A 9 溶液和10uL LIZ500溶液混合均匀， 加入到9。

42、6孔反应板中， 每孔加入10uL； 将96孔板置于平 板离心机中， 1200rmp离心10s即停； 使用12排10 L排枪， 对照STR检测表， 在96孔板对应的孔 中加入45pg的PCR扩增后的标准样品DNA或待测样品DNA； 将96孔板置于平板离心机中， 1200rmp离心10s即停； 使用封板膜密封96孔板， 振荡， 将96孔板置于平板离心机中， 1200rmp 离心10s即停， 进行毛细管电泳检测。 0070 第七步： 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 根据第六步检测的标准样品DNA和待测 样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图， 将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管。

43、 电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的 峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。 0071 实施例三： 0072 第一步： 提取标准羊肉和待测羊肉样品DNA： 分别取50只滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂 交羊的肌肉组织分别用液氮研磨成粉末， 加到1 .5L离心管中， 加入400LBuffer Digestion， 震荡混匀。 65水浴1h至细胞完全裂解； 加入200 L Buffer PA， 充分颠倒混匀， 置于-20冰箱放置5min； 室温10,000rpm离心5min， 将上清液吸取550 L转移到新的1.5 L 的离心管中； 放入离心机中在12,00。

44、0rpm离心取上清； 加入等体积的异丙醇， 颠倒8次使之充 分混匀， 室温放置3min； 室温10,000rpm离心5min， 弃上清； 加入1 L75乙醇， 颠倒漂洗 3min， 10,000rpm离心2min， 弃上清； 开盖室温倒置10min至残留的乙醇完全挥发； 得到的标 准羊肉样品DNA， 提取的标准羊肉样品DNA可立即进行下一步实验或-20保存； 用同样的方 法提取滩羊、 小尾寒羊和滩寒杂交羊共计324只混合绵羊样品DNA， 提取的DNA为待测羊肉样 品DNA； 0073 第二步： 分别检测提取的标准样品DNA和待测样DNA浓度： 分别提取第一步中裂解 后的标准样品DNA和待测样品。

45、DNA各1 L分别加入微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取的DNA 的纯度； 具体步骤如下： 根据实验的样品， 开机后， 分别选择标准样品DNA的双链DNA和待测 样品DNA的双链DNA； 1mm光程， 使用移液器将空白对照样品点到样品孔位置， 按Blank键对设 备做空白校准。 校准后， 使用吸水纸将空白样品从样品孔处擦拭干净， 同时擦拭干净样品上 盖的液体； 分别将标准样品DNA和待测样品DNA点到样品孔处， 盖上样品盖， 然后按Measure 键进行测量； 按Results键， 分别获得标准样品DNA和待测样品DNA的纯度测试结果， 其中空 白对照样为水。 0074 第三步： 对标准样品DNA。

46、和待测样品DNA的SSR基因序列进行荧光标记： 采用MISA软 件对上述第一步中提取的标准样品DNA和待测样品DNA进行SSR序列检测， 分别选取标准样 品DNA和待测样品DNA中的SSR基因序列， 采用Primer3对选取的SSR基因序列进行荧光标记， 得到标准样品DNA的SSR基因序列荧光标记引物和待测样品DNA的SSR基因序列荧光标记引 物； 0075 第四步： 利用SSR序列设计的引物进行PCR扩增： 提取第一步中裂解后的标准样品 DNA和待测样品DNA各1.5 g， 分别向其中加入2Taq Plus Master Mix 15 L、 第三步已合 成的SSR基因序列荧光标记引物、 上游。

47、引物0.8 L、 下游引物0.8 L、 ， 并且通过dd H2O定容至 25 L， 将值得的PCR反应体系进行PCR扩增； 0076 第五步： 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果： 称取1琼脂糖溶液制为琼脂糖凝胶 放入水平电泳槽中向其中加入1TAE电泳缓冲， 分别将第四步PCR扩增后的标准样品DNA和 说明书 7/8 页 10 CN 110004218 A 10 待测样品DNA的SSR基因序列均匀点样在琼脂糖凝胶中， 将琼脂糖凝胶置于电泳检测仪上进 行成像分析， 检测标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的PCR扩增情况； 0077 第六步： 毛细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因。

48、序列分型： 采用3730 xl设 备分别检测PCR扩增后的标准样品DNA和待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图； 毛 细管电泳检测标准样品和待测样品的SSR基因序列分型的具体步骤如下： 量取9901000uL HIDI溶液和10uL LIZ500溶液混合均匀， 加入到96孔反应板中， 每孔加入10uL； 将96孔板置 于平板离心机中， 1300rmp离心10s即停； 使用12排10 L排枪， 对照STR检测表， 在96孔板对应 的孔中加入45pg的PCR扩增后的标准样品DNA或待测样品DNA； 将96孔板置于平板离心机中， 1300rmp离心10s即停； 使用封板膜密封96孔板， 振。

49、荡， 将96孔板置于平板离心机中， 1300rmp 离心10s即停， 进行毛细管电泳检测。 0078 第七步： 构建STR-SSR标准分型峰值谱图； 根据第六步检测的标准样品DNA和待测 样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图峰形图， 将待测样品DNA的SSR基因序列的毛细管 电泳峰图的峰形位置和峰值大小确定与标准样品DNA的SSR基因序列的毛细管电泳峰图的 峰形位置和峰值大小判断待测羊肉的种类。 说明书 8/8 页 11 CN 110004218 A 11 图1 说明书附图 1/7 页 12 CN 110004218 A 12 图2 说明书附图 2/7 页 13 CN 110004218 A 13 图3 说明书附图 3/7 页 14 CN 110004218 A 14 图4 图5 图6 说明书附图 4/7 页 15 CN 110004218 A 15 图7 图8 图9 说明书附图 5/7 页 16 CN 110004218 A 16 图10 图11 图12 说明书附图 6/7 页 17 CN 110004218 A 17 图13 说明书附图 7/7 页 18 CN 110004218 A 18 。