锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910064906.2 (22)申请日 2019.01.23 (71)申请人 甘肃省科学院生物研究所 地址 730000 甘肃省兰州市定西南路197号 (72)发明人 李花花康红梅 (74)专利代理机构 兰州振华专利代理有限责任 公司 62102 代理人 张晋 (51)Int.Cl. A01H 4/00(2006.01) (54)发明名称 一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其 培养基 (57)摘要 本发明提供了一种锦鸡儿芽增殖与植株再 生的方法， 通过材料准备、 茎段腋芽诱。

2、导、 芽继代 增殖、 生根培养、 植株移栽等步骤， 建立了锦鸡儿 芽增殖与植株再生的方法， 本方法为锦鸡儿的组 织培养提供了稳定高效的快繁体系， 有效保证了 锦鸡儿组培体系的高生根率和存活率， 为锦鸡儿 快繁体系的扩大发展和推广种植提供了有力的 技术保障。 权利要求书1页 说明书6页 CN 110024688 A 2019.07.19 CN 110024688 A 1.一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法， 其特征在于该方法包括如下步骤： a. 采取34年龄的锦鸡儿半木质化枝条为外植体， 消毒备用； b. 将步骤a获得的外植体接种到芽诱导培养基中， 23-26， 光照14 h/d， 3000 Lu。

3、x， 透气培养40d至长出新生幼芽； 芽诱导培养基配方为： 在MS培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖,添加15 uM 6-BA 和1 uM NAA， pH 5.86.0； c. 将步骤b中诱导出的新生幼芽剪成0.51 cm长的单节茎段， 23-26， 光照14 h/d， 3000 Lux， 透气培养40d； 芽继代增殖培养基配方为： 在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖， 添加5 uM 6-BA、 0.1 uM NAA和2 uM GA3， pH 5.86.0； d. 切取步骤c获得的3cm以上的健壮芽至MS培养基中， 30d后接种到生根培养基中， 0。

4、.15% CO2， 20-25， 14 h/d， 3300 Lux， RH 90%， 培养30d； 生根培养基配方为： 在1/2MS中添加6g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖， pH值调整为5.8 6.0； e. 将步骤d得到的生根的植株移栽到混合基质中， 即珍珠岩： 蛭石： 腐质土=1： 1： 3。 2.根据权利要求1所述的锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法， 其特征在于所述步骤a所述 的锦鸡儿半木质化枝条为4-5月的新生枝条。 3.一套用于锦鸡儿芽增殖与植株再生的培养基， 其特征在于该培养基包括以下内容： a. 芽诱导培养基配方为： 在MS培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖。

5、,添加15 uM 6-BA和1 uM NAA， pH 5.86.0； b. 芽继代增殖培养基配方为： 在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖， 添加5 uM 6-BA、 0.1 uM NAA和2 uM GA3， pH 5.86.0； c. 生根培养基配方为： 在1/2MS中添加6g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖， pH值调整为5.8 6.0。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110024688 A 2 一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基 发明领域 0001 本发明涉及植物组织培养领域， 具体为一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其 培养基。 背景技术 00。

6、02 锦鸡儿 （Caragana sinica） 又名金雀花、 娘娘袜， 是豆科锦鸡儿属灌木。 主要分布 于我国山西、 内蒙古、 新疆、 河北、 河南、 山东、 陕西、 甘肃、 湖北、 湖南、 四川、 吉林、 辽宁、 黑龙 江、 江西等省、 区。 耐瘠薄, 生于山坡, 于石灰岩山地土层浅薄处也常见， 常与杂草及其他 灌木混生。 锦鸡儿具有食用、 饲养、 绿肥、 薪碳、 蜜源等资源价值， 其根或根皮可入药 （中药 名： 金雀根） ， 富含的二苯乙烯类化合物具有多种活性， 可促进成骨细胞增殖， 具有预防骨质 疏松的功效。 锦鸡儿植物是西部恢复生态的先锋树种， 是防沙治沙发展畜牧业的优选灌木 植物，。

7、 具有极高的生态价值、 经济价值和药用价值。 0003 锦鸡儿种子采集困难， 其繁殖一般采取扦插、 分株、 压条等方法， 繁殖系数低， 时间 周期长， 生根困难， 无法满足市场和科研需求。 组织培养能短时间内获得大量苗木， 且不受 季节因素影响， 可常年进行。 目前， 对于锦鸡儿及其同属植物组织培养方面的研究虽然已有 一些， 但缺少稳定高效的快繁体系， 生根率及存活率较低。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种克服现有技术不足， 提出一种锦鸡儿芽增殖与植株再生 的方法及其培养基。 0005 本发明的目的一是提供一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法， 具体包括如下步 骤： （1） 材料准备： 。

8、采取34年龄的锦鸡儿半木质化枝条为外植体， 剪去叶片后消毒， 将消 毒后的外植体剪成1.01.5 cm长单节茎段备用。 0006 （2） 茎段腋芽诱导： 将步骤 （1） 获得的茎段接种到芽诱导培养基中， 置于透气瓶中 培养， 培养间温度23-26， 光照时间14 h/d,光照强度约3000 Lux， 培养40d。 芽诱导培养基 配方为： 在MS培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖,添加15 uM 6-苄氨基腺嘌呤 （6- BA） 和1 uM萘乙酸 （NAA） ， pH值调整为5.86.0。 0007 （3） 芽继代增殖： 将步骤 （2） 中诱导出的新生幼芽剪成0.51 cm长的。

9、单节茎段， 接 种到继代增殖培养基中， 置于透气瓶中培养， 培养间温度23-26， 光照时间14 h/d,光照强 度约3000 Lux， 培养30d。 芽继代增殖培养基配方为： 在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖， 添加5 uM 6-BA、 0.1 uM NAA和2 uM GA3， pH值调整为5.86.0。 0008 （4） 生根培养： 切取步骤 （3） 获得的3cm以上的健壮芽至MS培养基中， 30d后接种到 生根培养基中， 置于透气瓶中培养， 培养条件为0.15% CO2， 培养温度20-25， 光照时间14 h/d， 光照强度3300 Lux， RH 90%。

10、， 培养30d。 生根培养基配方为： 在1/2MS中添加6g.L-1琼脂 和10 g.L-1的蔗糖， pH值调整为5.86.0。 说明书 1/6 页 3 CN 110024688 A 3 0009 （5） 将步骤 （4） 得到的生根的植株移栽到混合基质中， 即珍珠岩： 蛭石： 腐质土=1： 1： 3。 0010 作为优选， 所述锦鸡儿半木质化枝条为4-5月的新生枝条。 0011 本发明的目的二是提供一套锦鸡儿芽增殖与植株再生的培养基， 具体包括以下内 容： （1） 芽诱导培养基配方： 在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖,添加15 uM 6-BA和1 uM NAA。 。

11、0012 （2） 芽继代增殖培养基配方： 在 MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖， 添 加5 uM 6-BA、 0.1 uM NAA和2 uM GA3。 。 0013 （3） 生根培养基配方： 增施0.15%的CO2， 在1/2MS中添加6 g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗 糖。 。 0014 本发明提供的技术方案可以有效实现锦鸡儿芽增殖与植株再生。 4 -5月的新生枝 条的茎段初生芽诱导率最高， 高于90%； 芽诱导培养基中的6-BA对芽的诱导有显著促进作 用， 是实现锦鸡儿芽高诱导率的关键因素； ； 在增殖培养过程中， 6-BA对继代增殖出芽率的 影响最显著， 。

12、通过我们的试验发现GA3可有效增加芽长， 是实现锦鸡儿茎段芽伸长的关键因 子。 而我们筛选的增殖培养基可成功实现锦鸡儿的继代增殖培养； 生根培养阶段增施0.15% 的CO2可以在不添加激素的情况下有效诱导生根， 且根系生长良好， 幼苗健壮， 生根率和存 活率高， 是一种简单有效的促生根方法。 0015 本发明提供的一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基， 为锦鸡儿的组织 培养提供了稳定高效的快繁体系， 有效保证了锦鸡儿组培体系的高生根率和存活率， 为锦 鸡儿快繁体系的扩大发展和推广种植提供了有力的技术保障。 具体实施方式 0016 下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。 以下实施实例有。

13、助于此领域的技 术人员进一步理解本发明， 但不以任何形式限制本发明。 0017 以下实施例所选用的锦鸡儿枝条均采自34年龄的锦鸡儿半木质化新生枝条， 以 下实施例中所使用的各种试剂材料均可通过商业途径购买获得。 0018 实施例1 材料准备与茎段腋芽诱导 采取34年龄的当年45月的锦鸡儿半木质化新生枝条为外植体， 剪去叶片， 肥皂水 漂洗35 min,用流动的自来水冲洗干净。 无菌条件下75%的乙醇表面消毒30 s,无菌蒸馏 水冲洗12次后， 0.1%氯化汞灭菌10 min,再用无菌蒸馏水冲洗45次， 洗去残余氯化汞。 将消毒后的外植体剪成1.01.5 cm长单节茎段备用。 0019 以MS为。

14、基本培养基， 添加不同浓度的 （5、 10、 15、 20 uM） 6-BA与1 uMNAA 的A1A5培 养基 （表1） ， 置于透气瓶中培养， 培养间温度23-26， 光照时间14 h/d， 光照强度约3000 Lux， 培养40d后， 统计出芽率、 芽长等相关指标。 实验结果如表1所示： 说明书 2/6 页 4 CN 110024688 A 4 不同浓度的6-BA与1 uMNAA组合对茎段腋芽诱导的结果如表1所示。 6-BA浓度在515 uM时， 茎段出芽率均为90%， 芽长3.493.88 cm， 增殖系数最高2.9 （p CB， 6-BA对继代增殖出芽率的影响最显著， 其次为GA3，。

15、 NAA的影响最小。 纵向 说明书 5/6 页 7 CN 110024688 A 7 比较三因素四水平平均值k1、 k2、 k3和k4的大小， 表中数值显示A因素中平均值k3最大； B因素 中平均值k1、 k2最大， 根据实验经验， 为了后续的继代， 我们一般会选用较低浓度的B因素 NAA， 因此， 在B因素中平均值k1和k2相同的情况下， 我们会选取更适宜的第一水平k1值作为 参考； C因素中平均值k4最大， 选取的最优组合为A3B1C4， 即A因素6-BA选取第三水平的浓度 5uM， B因素NAA选取第一水平的浓度0.1uM， C因素GA3选取第四水平的浓度2uM。 因此最佳培 养基是在 。

16、MS 培养基中加入6 g.L-1琼脂和30 g.L-1蔗糖， 添加5 uM 6-BA、 0.1 uM NAA和2 uM GA3， 此培养基可成功实现锦鸡儿茎段继代增殖培养。 0022 实施例3生根培养及移栽 切取实施例2所述的增殖培养基中长度为3cm以上的健壮芽至空白培养基(MS+6g.L-1 琼脂 +30g.L-1蔗糖)中壮苗， 30d后转入生根培养基1-7中， 培养条件为下表备注所示。 30d 后， 统计生根率、 根长、 根数等数据， 实验结果见表3。 将生根的植株移栽到混合基质中,即珍 珠岩： 蛭石： 腐质土1： 1： 3， 30d后统计成活率， 实验结果见表3。 0023 表3 不同培。

17、养基及培养方法对锦鸡儿生根的影响 培养条件 a: 2326, 约3000 Lux, 14 h/d b: 0.15% CO2; 25/20, 14 h/d, 3300 Lux; RH 90% 实验结果表明， CO2增施条件下， 琼脂基质要优于开放培养的蛭石基质； 添加少量蔗糖 （10 g.L-1） 的6#培养基， 有利于生根， 生根率高达80%， 且根系生长良好， 植株健壮， 其根长、 根数及成活率均最高， 显著高于传统生根法中添加激素NAA的1#生根率 （8%） ； 即最适宜生根 的培养基为1/2MS中添加6 g.L-1琼脂和10 g.L-1的蔗糖。 说明书 6/6 页 8 CN 110024688 A 8 。