用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物及其用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910264483.9 (22)申请日 2019.04.03 (71)申请人 中国医学科学院北京协和医院 地址 100730 北京市东城区王府井帅府园1 号 (72)发明人 胡朝军张文李永哲张盼盼 李洁琼 (74)专利代理机构 北京智为时代知识产权代理 事务所(普通合伙) 11498 代理人 王加岭杨静 (51)Int.Cl. G01N 33/68(2006.01) G01N 33/53(2006.01) (54)发明名称 一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物 及其用途 (。

2、57)摘要 本发明公开了罗马蜗牛凝集素在制备用于 诊断腹膜后纤维化的试剂中的用途。 本发明通过 采用凝集素微阵列检测IgG4-RD患者血清IgG4分 子表面与凝集素特异性结合的聚糖谱， 结果显 示， HPA凝集素结合聚糖的含量在IgG4-RD患者中 是降低的。 由于HPA凝集素是特异性结合N-乙酰 半乳糖胺， 这表明N-乙酰半乳糖胺糖基化水平在 IgG4-RD患者中的表达是减少的。 进一步研究三 个亚组的IgG4-RD糖基化表达， 结果显示HPA凝集 素结合聚糖水平在腹膜后纤维化的病人中的表 达量最低。 降低的HPA凝集素结合聚糖水平可被 用作诊断腹膜后纤维化的生物学标志物。 权利要求书1页 。

3、说明书6页 附图5页 CN 110045125 A 2019.07.23 CN 110045125 A 1.一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物， 其为罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成 的复合物。 2.权利要求1所述的生物标志物在用于制备诊断腹膜后纤维化的试剂中的用途。 3.如权利要求2所述的用途， 其特征在于， 所述诊断包括： 测定获自呈现IgG4相关性疾 病的患者的生物样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平； 任选地， 与对照数据比较所述生物样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平， 其中， 相对于所述对照数据， 所述样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成。

4、的复合物的水 平可检测地降低表明患腹膜后纤维化的可能性。 4.罗马蜗牛凝集素在制备用于诊断腹膜后纤维化的试剂中的用途。 5.如权利要求4所述的用途， 其特征在于， 所述诊断包括： 将罗马蜗牛凝集素与测定获 自呈现IgG4相关性疾病的患者的生物样品进行接触， 测定罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形 成的复合物的水平； 任选地， 与对照数据比较所述生物样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平， 其中， 相对于所述对照数据， 所述样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水 平可检测地降低表明患腹膜后纤维化的可能性。 6.如权利要求3或5所述的用途， 其中， 所述生物样品为血清样。

5、品。 7.如权利要求3或5所述的用途， 其中， 罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的 水平通过以下步骤来测量， 包括： a.使来自患者的生物样品与罗马蜗牛凝集素接触； b.在生物样品中存在的IgG4与罗马蜗牛凝集素之间形成凝集素-聚糖复合物； c.洗涤来除去任何未结合的IgG4； d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体； e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体； 和 f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。 8.如权利要求7所述的用途， 其中， 所述的罗马蜗牛凝集素沉积或固定在固相表面载体 上， 优选地， 所述的固相表面载体是乳胶珠子、 多孔平板或膜条、。

6、 纳米管道、 带二维码的薄片 等的形式， 优选地， 所述检测抗体通过共价连接到酶、 具有荧光化合物或金属的标记物、 或 具有化学发光化合物的标记物来标记。 9.一种用于检测和/或定量生物样品中能与罗马蜗牛凝集素结合的IgG4的试剂盒， 包 括： 一种固相表面载体， 其中， 所述的罗马蜗牛凝集素沉积或固定在固相表面载体上， 其中， 罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物作为腹膜后纤维化的生物标志物， 优选地， 所 述试剂盒还包括被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体。 10.如权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于， 所述固相表面载体是乳胶珠子、 多孔平板 或膜条、 纳米管道、 带。

7、二维码的薄片等的形式。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110045125 A 2 一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物及其用途 技术领域 0001 本发明属于生物检测领域， 具体涉及一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物及 其用途。 背景技术 0002 IgG4相关性疾病(IgG4 related disease， IgG4RD)是近年来认识的一种新的免疫 介导的自身炎症性疾病。 该病以受累器官或组织增生、 肿大， 血清IgG4水平显著增高( 1350mg/L),受累组织中IgG4阳性淋巴细胞浸润(IgG4阳性浆细胞占总浆细胞50以上)为 主要特征。 本病可累及泪腺、 唾液腺、 胰腺、 腹膜。

8、后组织、 胆管、 肺、 肾脏、 前列腺等多个器官 或组织， 临床表现为米库利兹病、 自身免疫性胰腺炎、 腹膜后纤维化、 自身免疫性胆管炎、 间 质性肺炎、 眶周炎性假瘤等。 2010年自身免疫病综述(Autoimmunity Reviews)杂志以题为 “一种新的综合征诞生： IgG4相关疾病临床谱” 宣布这一新的病种得到公认。 2012年国际上 首次公布该病的综合诊断标准， 使其诊断得以规范化。 IgG4-RD特征的病理表现为淋巴细胞 浸润、 席纹状纤维化和闭塞性静脉炎。 对IgG4-RD早期诊断， 早期治疗， 可以预防严重的器官 损伤、 组织纤维化， 甚至死亡。 0003 人类血清中的糖蛋。

9、白浓度约为40g/L， 是寻找人类疾病生物标志物的极佳来源。 与 RNA和蛋白质不同， 糖蛋白上黏附的聚糖的合成不需要模板。 糖基化是受多种因素影响的过 程， 包括： 细胞类型及其活化状态； 环境因素， 例如可用代谢物的存在； 细胞的年龄， 因为部 分聚糖可能会随着时间的推移而丢失； 炎症介质， 如细胞因子和趋化因子。 所有这些因素都 可能在自身免疫的环境中发生改变。 例如， 一些自身免疫疾病具有特征性的细胞因子。 这些 细胞因子对糖苷酶， 唾液酸酶和糖基转移酶的表达产生影响， 而这些酶能直接影响聚糖的 合成。 从理论上说， 特征性的免疫状态可在血清糖蛋白的糖基化中表现出来。 0004 鉴于糖。

10、基化在疾病中的重要作用， 通过高通量的糖基化分析技术凝集素微阵 列来筛查IgG4-RD患者血清IgG4糖基化的表达， 以期探讨糖基化在IgG4-RD中的临床应用价 值。 发明内容 0005 为了解决上述问题， 本发明提供一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物及其用 途。 0006 首先， 本发明提供一种用于诊断腹膜后纤维化的生物标志物， 其为罗马蜗牛凝集 素与IgG4结合所形成的复合物。 0007 其中， 所述的IgG4含有N-乙酰半乳糖胺。 0008 其次， 本发明还提供所述生物标志物在用于制备诊断腹膜后纤维化的试剂中的用 途。 0009 具体地， 所述诊断包括： 测定获自呈现IgG4相关性疾。

11、病的患者的生物样品中罗马 蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平； 任选地， 说明书 1/6 页 3 CN 110045125 A 3 0010 与对照数据比较所述生物样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的 水平， 其中， 相对于所述对照数据， 所述样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物 的水平可检测地降低表明患腹膜后纤维化的可能性。 0011 其中， 所述生物样品为血清样品。 0012 优选的， 罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平通过以下步骤来测 量， 包括： 0013 a.使来自患者的生物样品与罗马蜗牛凝集素接触； 0014 b.在生物样品中存在的。

12、IgG4与罗马蜗牛凝集素之间形成凝集素-聚糖复合物； 0015 c.洗涤来除去任何未结合的IgG4； 0016 d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体； 0017 e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体； 和 0018 f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。 其次， 本发明还提供罗马蜗牛凝 集素在制备用于诊断腹膜后纤维化的试剂中的用途。 0019 其中， 所述的罗马蜗牛凝集素沉积或固定在固相表面载体上。 0020 其中， 所述的固相表面载体优选为乳胶珠子、 多孔平板或膜条、 纳米管道、 带二维 码的薄片等的形式。 0021 其中， 所述检测抗体通过共价连接到酶。

13、、 具有荧光化合物或金属的标记物、 或具有 化学发光化合物的标记物来标记。 0022 另一方面， 本发明还提供罗马蜗牛凝集素在制备用于诊断腹膜后纤维化的试剂中 的用途。 0023 其中， 所述诊断包括： 将罗马蜗牛凝集素与测定获自呈现IgG4相关性疾病的患者 的生物样品进行接触， 测定罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平； 任选地， 0024 与对照数据比较所述生物样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的 水平， 其中， 相对于所述对照数据， 所述样品中罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物 的水平可检测地降低表明患腹膜后纤维化的可能性。 0025 其中， 所述生物样。

14、品为血清样品。 0026 优选的， 罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复合物的水平通过以下步骤来测 量， 包括： 0027 a.使来自患者的生物样品与罗马蜗牛凝集素接触； 0028 b.在生物样品中存在的IgG4与罗马蜗牛凝集素之间形成凝集素-聚糖复合物； 0029 c.洗涤来除去任何未结合的IgG4； 0030 d.添加被标记的并且对来自生物样品的抗体为反应性的检测抗体； 0031 e.洗涤来除去任何未结合的被标记的所述检测抗体； 和 0032 f.将所述检测抗体的标记物转化为可检测信号。 0033 其次， 本发明还提供罗马蜗牛凝集素在制备用于诊断腹膜后纤维化的试剂中的用 途。 0034 。

15、其中， 所述的罗马蜗牛凝集素沉积或固定在固相表面载体上。 0035 其中， 所述的固相表面载体优选为乳胶珠子、 多孔平板或膜条、 纳米管道、 带二维 码的薄片等的形式。 说明书 2/6 页 4 CN 110045125 A 4 0036 其中， 所述检测抗体通过共价连接到酶、 具有荧光化合物或金属的标记物、 或具有 化学发光化合物的标记物来标记。 0037 另一方面， 本发明还提供一种用于检测和/或定量生物样品中能与罗马蜗牛凝集 素结合的IgG4的诊断试剂盒， 包括： 一种固相表面载体， 其中， 所述的罗马蜗牛凝集素沉积 或固定在固相表面载体上， 其中， 罗马蜗牛凝集素与IgG4结合所形成的复。

16、合物作为腹膜后 纤维化的生物标志物。 0038 在本发明优选的实施方案种， 所述试剂盒还包括被标记的并且对来自生物样品的 抗体为反应性的检测抗体。 0039 优选地， 所述固相表面载体是乳胶珠子、 多孔平板或膜条、 纳米管道、 带二维码的 薄片等的形式。 0040 本研究通过采用凝集素微阵列检测IgG4-RD患者血清IgG4分子表面与凝集素特异 性结合的聚糖谱， 结果显示， HPA凝集素结合聚糖的含量在IgG4-RD患者中是降低的。 由于 HPA凝集素是特异性结合N-乙酰半乳糖胺， 这表明N-乙酰半乳糖胺糖基化水平在IgG4-RD患 者中的表达是减少的。 进一步研究三个亚组的IgG4-RD糖基。

17、化表达， 结果显示HPA凝集素结 合聚糖水平在腹膜后纤维化的病人中的表达量最低。 0041 研究结果显示， IgG4-RD患者， 特别是腹膜后纤维化患者， HPA凝集素结合聚糖水平 是降低的， HPA凝集素结合聚糖水平可作为腹膜后纤维化疾病诊断的生物学标志物。 附图说明 0042 图1所示为凝集素微整列56个凝集素(三复孔)在阵列载玻片的布局。 0043 图2所示为IgG4-RD患者凝集素微阵列示意图。 0044 图3所示为IgG4-RD组、 DC组和HC组HPA凝集素信号值比较(*： P0.01)。 0045 图4所示为米库利兹病和腹膜后纤维化患者HPA凝集素信号值比较及ROC曲线图。 00。

18、46 图5所示为自身免疫性胰腺炎和腹膜后纤维化患者HPA凝集素信号值比较及ROC曲 线图。 0047 图6所示为纯化前后IgG4浓度的相关性。 0048 图7所示为凝集素微阵列中血清IgG4与纯化的IgG4之间HPA凝集素信号值的相关 性。 具体实施方式 0049 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0050 实验标本： 纳入本次研究的三组人群包括： IgG4-RD组(167例IgG4-RD患者， 其中A1 组米库利兹病59例， A2组自身免疫性胰腺炎50例， A3组腹膜后纤维化58例)， DC组(130例AID 疾病对照)， HC组(86例健康体检者)。 其中IgG4-R。

19、D组和DC组的诊断均符合相应疾病的诊断 标准。 入组的人群均采集新鲜血液， 并立即分离出血清， -80冻存备用。 0051 实施例1凝集素微阵列分析血清IgG4糖基化 0052 由56种凝集素微芯片组成的凝集素微阵列。 将56种凝集素一式三份固定到芯片 中,将每个患者的总血清进行1:1000稀释,添加到阵列中， 4孵育过夜。 然后,抗IgG4-Cy3 共轭在黑暗中与微芯片杂交45分钟。 对所有蛋白的荧光强度和低信号的荧光强度进行了独 说明书 3/6 页 5 CN 110045125 A 5 立分析。 芯片图像被转换为数字格式进行分析。 0053 利用各凝集素点的信噪比(点前景相对于背景的中等强。

20、度)计算了各凝集素点的 信噪比(S/N)。 为了防止凝集素微阵列在阵列间的偏置,我们使用阵列之间的归一化来归一 化S/N数据。 根据以下规则,通过组内的数据分布来确定凝集素结合活力的显著性差异:(1) IgG4-RD组的凝集素平均S/N不应小于对照组中的最大S/N(50(IgG4-RD组)最大值(对 照组)； (2)IgG4-RD组的S/N下四分位数不应小于对照组的上四分位值(25(IgG4-RD组) 75(对照组)； (3)IgG4-RD组的最小S/N不应小于对照组的中值最小值(IgG4-RD组) 50(对照组)。 0054 采用含有56个凝集素的凝集素微阵列来检测实验标本中的糖基化状态(图。

21、1)。 凝 集素可特异性的结合糖蛋白末端的聚糖分子， 形成复合物， 通过不同的凝集素与聚糖的特 异性结合来研究目的蛋白表面聚糖的种类与含量。 凝集素微阵列因其高效的特点， 现今已 越来越广泛的应用到糖基化的研究。 冻存的标本室温平衡后， 加入到凝集素微阵列， 与之反 应， 再经过洗涤、 封闭、 荧光二抗反应和荧光检测等步骤， 可获得每个凝集素与之特异结合 聚糖的信号值， 信号值与结合亲和力以及结合强度相关(图2)。 0055 为了确保收集到的荧光信号来源于IgG4的特定结合,使用Cy3标记IgG4抗体。 符合 前述三种规则之中的任何一种的凝集素S/N数据被认定为具有显著性差异， 共有6种凝集素。

22、 (表1)。 0056 表1凝集素微阵列中具有显著性差异的凝集素 0057 0058 0059 6种凝集素的亲和力信号值显示出三组样本之间有显著性差异。 通过凝集素-聚糖 结合信号分析， 我们发现， 对比DC组和HC组， 罗马蜗牛凝集素(HPA)信号值在IgG4-RD组总体 是降低的(图3)， 进一步分析IgG4-RD亚组HPA凝集素信号值的分布发现， A3组腹膜后纤维化 组在三个亚组中的值最低(数据及ROC诊断曲线见图4-5)。 鉴于HPA特异性的结合N-乙酰半 乳糖胺(GalNAc)聚糖， 由此推断， IgG4-RD患者， 特别是腹膜后纤维化患者， 血清中IgG4的N- 乙酰半乳糖胺糖基化。

23、水平较其他组相比， 呈现降低趋势， 可作为腹膜后纤维化的诊断及鉴 别诊断的生物学标志物。 0060 实施例2血清IgG4提纯及鉴定 说明书 4/6 页 6 CN 110045125 A 6 0061 为了进一步确定IgG-RD患者糖基化的变化是否由于血清IgG4浓度的增加,还是糖 基化的实际变化,使用了第二凝集素微阵列和凝集素印迹Dotblot进行验证。 该第二凝集素 由6种凝集素组成,包括HPA、 DSL、 LTL、 VVA甘露糖、 MNA-M和ConA。 操作同前。 0062 通过免疫沉淀法从血清中分离出IgG4。 样本包括12名IgG-RD患者、 3名DC患者和1 名HC患者。 将20 。

24、l鼠抗IgG4抗体(SouthernBiotech,Birmingham,USA)偶联到20 l珠子 (NHS-activated SepharoseTM 4 Fast Flow,GE healthcare Life Sciences,Pittsburgh, USA)， 然后加入0.1M Tris-HCl来密封过量的部位。 用酸性溶液和碱溶液清洗鼠抗IgG4抗体 珠3次。 每柱子使用5 l血清。 将柱子是孵育过夜。 用PBST清洗8次,水洗2次后,用20 l0.1M甘 氨酸将IgG4洗脱到真空管。 用Dotblot鉴定蛋白质纯度,用蛋白质银染试剂盒(Beyotiome, 上海,中国)测定蛋白质。

25、浓度,所有IgG4样品均储存在-80进行后续处理。 0063 通过对16例患者纯化后的IgG4浓度和相对血清IgG4含量的比较,发现纯化后的 IgG4浓度结果与血清IgG4水平有较好的相关性(r0.593,P0.015)(图6)。 结果显示， 对 于HPA凝集素而言， 血清IgG4微阵列的信号值与纯化的IgG4微阵列信号值呈正比(图7)。 这 表明， IgG4-RD患者血清中的HPA凝集素结合的聚糖N-乙酰半乳糖胺糖基化水平是异常 的。 0064 实施例3 167例IgG-RD患者的IgG4糖基化与实验室特征的相关性分析 0065 观察到IgG-RD患者的凝集素信号之间存在显著差异,我们进一步。

26、评估凝集素信号 与临床实验室指标之间的关系。 相关性分析结果显示： IgG4-RD患者HPA凝集素结合聚糖的 含量并未与实验室指标有相关性(表2)。 0066 表2 167例IgG4-RD患者凝集素结合聚糖的含量与实验室特征的相关性 0067 0068 *NS:无显著性差异 0069 实施例4 167例IgG-RD患者IgG4糖基化与器官受累的关系 0070 在患者呈现各种器官受累中， 对凝集素特异性结合聚糖的不同水平进行了比较。 结果如表3所示。 IgG4-RD患者HPA凝集素结合聚糖水平与多胰腺、 胆管受累及腹膜后纤维化 相关(表3)。 由此表明， IgG4-RD患者HPA凝集素结合聚糖的。

27、降低与胰腺、 胆管受累及腹膜后 纤维化相关。 这些器官的受累在腹膜后纤维化患者中都是常见的临床表现， 我们的结果也 表明HPA在这些器官有无受累的患者中存在差异， 且差异有统计学意义， 这可作为该指标诊 断腹膜后纤维化提供证据。 0071 表3 IgG4-RD患者器官受累与IgG4糖基化含量的比较 说明书 5/6 页 7 CN 110045125 A 7 0072 0073 NS*无显著性差异。 说明书 6/6 页 8 CN 110045125 A 8 图1 图2 说明书附图 1/5 页 9 CN 110045125 A 9 图3 说明书附图 2/5 页 10 CN 110045125 A 10 图4 说明书附图 3/5 页 11 CN 110045125 A 11 图5 图6 说明书附图 4/5 页 12 CN 110045125 A 12 图7 说明书附图 5/5 页 13 CN 110045125 A 13 。