检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试剂盒及检测方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910371238.8 (22)申请日 2019.05.06 (71)申请人 上海药明康德医学检验所有限公司 地址 200131 上海市浦东新区自由贸易试 验区富特中路288号 (72)发明人 朱磊李宇 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 郑权 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试 剂盒及检测方法 (57)摘要 本发。

2、明公开一种检测干血斑中尼洛替尼药 物浓度的试剂盒， 包括： 内标提取试剂和干血斑 校准品； 所述内标提取试剂采用同位素取代的尼 洛替尼作为内标物， 所述内标提取试剂的溶剂为 有机溶剂与水的混合物； 所述尼洛替尼干血斑校 准品为一组具有不同浓度梯度的尼洛替尼的干 血斑样本， 所述干血斑样本的数量为至少6个， 所 述干血斑样本固定于血斑采集卡； 所述浓度梯度 的浓度范围为50-4000ng/mL。 本发明还公开该试 剂盒的检测方法。 本发明提供的试剂盒及检测方 法， 具有取样量少， 样本稳定性好， 检测结果的准 确度高的优点。 权利要求书2页 说明书10页 附图3页 CN 110045037 A 。

3、2019.07.23 CN 110045037 A 1.一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试剂盒， 其特征在于， 包括： 内标提取试剂和 干血斑校准品； 所述内标提取试剂采用同位素取代的尼洛替尼作为内标物， 所述内标提取试剂的溶剂 为有机溶剂与水的混合物； 所述有机溶剂为甲醇、 或乙腈、 或甲醇与乙腈的混合液， 所述有 机溶剂与水的体积比为(1.54.0):1； 所述尼洛替尼干血斑校准品为一组具有不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本， 所述 干血斑样本的数量为至少6个， 所述干血斑样本固定于血斑采集卡； 所述浓度梯度的浓度范 围为50-4000ng/mL。 2.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征。

4、在于， 所述试剂盒还包括干血斑质控品； 所述干 血斑质控品包括至少一组具有三个不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本； 所述三个不同 浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本分别为LQC样本、 MQC样本和HQC样本； 其中， LQC样本中尼 洛替尼浓度为100500ng/mL， MQC样本中尼洛替尼浓度为15002500ng/mL， HQC样本中尼 洛替尼浓度为28003600ng/mL。 3.如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， LQC样本中尼洛替尼浓度为150450ng/ mL， MQC样本中尼洛替尼浓度为18002200ng/mL， HQC样本中尼洛替尼浓度为3000 3200ng/mL。 4.。

5、如权利要求2所述的试剂盒， 其特征在于， 所述干血斑质控品包括一个空白对照干血 斑质控样本， 所述空白对照干血斑质控点为空白全血， 其中不含有尼洛替尼。 5.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述干血斑样本的血斑来源为兔血， 兔血 HCT范围为30-45。 6.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述同位素取代的尼洛替尼是氢同位素取 代， 或碳同位素取代， 或氮同位素取代。 7.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述同位素取代的尼洛替尼为D6-尼洛替 尼。 8.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述尼洛替尼干血斑校准品上干血斑样本 的数量为6个或7个或8个， 所述。

6、干血斑样本是将血液样本点制于血斑采集卡上形成， 点血体 积10uLV40uL。 9.如权利要求1所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒用于LC-MS/MS方法检测干血斑 中尼洛替尼的浓度。 10.如权利要求1-9任一项所述的试剂盒用于检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的检测 方法， 包括如下步骤： (1)样本前处理： 利用干血斑打孔器打取各干血斑校准品的样本和待检测血斑的样本， 加入内标提取试 剂， 振荡， 离心， 吸取上清液， 上清液再离心， 再吸取上清液进LC-MS/MS进行分析检测； (2)液相条件： a、 流动相配制 流动相A： 0.1甲酸+4mmoL甲酸胺的水溶液； 流动相B： 乙腈 b。

7、、 液相条件： 色谱柱： Waters ACQUITY UPLC BEH C18， 21mm50mm， 1.7 m； 权利要求书 1/2 页 2 CN 110045037 A 2 梯度洗脱程序： 流动相A+流动相B100； 00.35min， 流动相A体积保持65.0； 0.35 1.00min， 流动相A体积由65.0递减至5.0； 1.001.50min， 流动相A体积保持5.0； 1.501.51min， 流动相A体积由5.0升高至80.0； 1.512.30min， 流动相A体积由 80.0降低至5.0； 2.302.60min， 流动相A体积保持5.0； 2.602.70min， 流。

8、动相A体 积由5.0升高至65.0； 2.703.00min， 流动相A体积保持65.0； c、 质谱条件： 离子源： ESI+； 锥孔电压(V)： 60； 去溶剂化温度()： 500； 去溶剂化流速(L/H)： 1000； 锥 孔流速： 150L/Hr； 雾化压力： 7.0Bar； (3)结果分析： 通过各校准品标示浓度， 校准品中尼洛替尼和尼洛替尼同位素内标的峰面积比值， 绘 制校准曲线， 并拟合校准曲线方程； 再将待检测血斑的尼洛替尼的峰面积与尼洛替尼同位 素内标的峰面积比值， 带入校准曲线方程， 即可定量计算待检测血斑中尼洛替尼的浓度。 权利要求书 2/2 页 3 CN 1100450。

9、37 A 3 一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试剂盒及检测方法 技术领域 0001 本发明属于生物检测领域， 具体地涉及一种对干血斑样本中尼洛替尼药物浓度进 行检测的试剂盒及方法。 背景技术 0002 尼洛替尼(Nilotinib)， 分子式为C28H22F3N7O， 分子量为529.51600， 2007年由瑞士 诺华研发推出。 尼洛替尼对BCR-ABL激酶活性有更强的选择性， 对酪氨酸激酶的抑制作用较 伊马替尼强30倍， 可抑制对伊马替尼耐药的BCR-ABL突变型的激酶活性， 临床上主要用于治 疗对格列卫(伊马替尼)耐药的慢性粒细胞性白血病。 0003 治疗药物监测(TDM)是对治疗指数。

10、窄、 毒性作用强、 个体差异大的药物， 测定其血 液或其他体液中的药物浓度， 根据药动学原理制订个体给药方案。 TDM是借助于一定的分析 技术， 测定药物在血液中的浓度， 用以评价疗效或确定给药方案， 使给药方案个体化， 以提 高药物治疗水平， 达到临床安全、 有效、 合理的用药。 传统的治疗方法是参照教科书上推荐 的平均剂量给药， 其结果是仅一些患者得到有效治疗， 另一些则未能达到预期的疗效， 甚至 出现了毒性反应。 0004 尼洛替尼是经肝脏中的CYP3A4代谢的， 该药品的系统吸收(包括吸收及随后的消 除)可能会受到CYP3A4的影响。 如酮康唑或其它强效CYP3A4抑制剂(如伊曲康唑、。

11、 伏立康唑、 克拉霉素、 利托那韦、 泰利霉素和其它蛋白酶抑制剂)会增加本品血清浓度； CYP3A4诱导剂 (如利福平、 卡马西平、 苯巴比妥、 苯妥英和贯叶连翘)会减少本品血清浓度； 与食物一同摄 入时会导致本品的吸收和生物利用度会增加， 血药浓度升高； 葡萄柚汁和其它抑制CYP3A4 的食物会会增加本品血清浓度。 因此， 进行尼洛替尼的血药浓度监测对发挥药物作用、 指导 用药、 减少副反应有重要作用。 0005 尼洛替尼传统的检测样本为血清、 血浆及全血， 为医院及检测机构长期使用的检 测样本。 随着新技术的不断进步及病患对就医诊断新的需求， 传统样本在使用中不断地显 现了一定的缺点： 1。

12、、 传统样本采样量大， 全血、 血浆、 血清样本检测都需要采集数毫升， 且血 清、 血浆需再分离。 2、 液态样本稳定性差， 各种物理、 化学、 生物因素会导致分析结果的准确 度， 如光照、 PH、 酶的作用等， 且偏远地区病患的样本需冷链运输送至区域检测中心， 成本较 高。 3、 液态基质样本造成职业暴露及病原菌传染的可能性较大。 4、 传统的样本需精确测量 采样体积， 否则将影响定量的准确度。 0006 尼洛替尼血药浓度监测目前全部在医学实验室开展， 项目模式为实验室自建方法 (laboratory developed tests,LDT)， 需要自行配制校准品、 质控品、 提取溶液。 L。

13、DT模式的 检测项目大多缺乏质量控制， 分析批、 试剂批的不稳定性将造成重现性的巨大风险， 实验数 据的准确度、 精密度、 可靠性难以保证。 LDT模式项目的开展费时费力， 便利性差， 试剂配制、 方法建立、 仪器参数等需要专业、 责任心强的员工来保证。 0007 综上所述， 本领域迫切需要一种便捷性强、 灵敏度高、 准确度高、 采样量少、 样本致 病性弱、 保存稳定的新型尼洛替尼检测方式。 说明书 1/10 页 4 CN 110045037 A 4 发明内容 0008 本发明所要解决的技术问题在于， 提供一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试 剂盒及方法， 其能对干血斑样本进行检测， 具有便捷。

14、性强， 采血量少， 样本稳定， 检测的重复 性、 精密度、 稳定性高的优点。 0009 为解决上述技术问题， 本发明提供一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试剂 盒， 包括： 内标提取试剂和干血斑校准品； 0010 所述内标提取试剂采用同位素取代的尼洛替尼作为内标物， 所述内标提取试剂的 溶剂为有机溶剂与水的混合物； 所述有机溶剂为甲醇、 或乙腈、 或甲醇与乙腈的混合液， 所 述有机溶剂与水的体积比为(1.54.0):1； 0011 所述尼洛替尼干血斑校准品为一组具有不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本， 所述干血斑样本的数量为至少6个， 所述干血斑样本固定于血斑采集卡； 所述浓度梯度的浓 度范围。

15、为50-4000ng/mL。 0012 在一种优选的实施方式中， 所述试剂盒还包括干血斑质控品； 所述干血斑质控品 包括至少一组具有三个不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本； 所述三个不同浓度梯度的 尼洛替尼的干血斑样本分别为低浓度质控样本(LQC样本)、 中浓度质控样本(MQC样本)和高 浓度质控样本(HQC样本)； 其中， LQC样本中尼洛替尼浓度为100500ng/mL， MQC样本中尼洛 替尼浓度为15002500ng/mL， HQC样本中尼洛替尼浓度为28003600ng/mL。 0013 在一种优选的实施方式中， LQC样本中为尼洛替尼浓度为150450ng/mL， MQC样本 中尼。

16、洛替尼浓度为18002200ng/mL， HQC样本中尼洛替尼浓度为30003200ng/mL。 0014 在一种优选的实施方式中， 所述干血斑质控品包括一个空白对照干血斑质控样 本。 所述空白对照干血斑质控点为空白全血， 其中不含有尼洛替尼。 0015 在一种优选的实施方式中， 所述干血斑样本的血斑来源为兔血， 兔血HCT范围为 30-45。 0016 在一种优选的实施方式中， 所述同位素取代的尼洛替尼可以是氢同位素取代， 比 如氘代(D4、 D5、 D6、 D7、 D8取代等)； 也可以是碳同位素取代， 比如C13取代； 也可以是氮同位 素取代， 比如N15取代等同位素取代形式。 0017。

17、 在一种优选的实施方式中， 所述同位素取代的尼洛替尼为D6-尼洛替尼。 0018 在一种优选的实施方式中， 所述内标提取试剂的溶剂为甲醇与水的混合液， 甲醇 与水的体积比为(1.54.0):1。 0019 在一种优选的实施方式中， 所述内标提取试剂的溶剂为乙腈与水的混合液； 乙腈 与水的体积比为(1.54.0):1。 0020 在一种优选的实施方式中， 所述内标提取试剂的溶剂为甲醇、 乙腈与水的混合液； 甲醇、 乙腈的总体积与水的体积比为(1.54.0):1。 0021 在一种优选的实施方式中， 所述尼洛替尼干血斑校准品上干血斑样本的数量为6 个或7个或8个， 所述干血斑样本是将血液样本点制于。

18、血斑采集卡上形成， 点血体积10uLV 40uL。 0022 具体的， 本发明的试剂盒， 用于LC-MS/MS方法检测干血斑中尼洛替尼的浓度。 0023 本发明还提供上述试剂盒用于检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的检测方法， 包括 如下步骤： 说明书 2/10 页 5 CN 110045037 A 5 0024 (1)样本前处理： 0025 利用干血斑打孔器打取各干血斑校准品的样本和待检测血斑的样本， 加入内标提 取试剂， 振荡， 离心， 吸取上清液， 上清液再离心， 再吸取上清液进LC-MS/MS进行分析检测。 0026 (2)液相条件： 0027 a、 流动相配制 0028 流动相A： 0.1。

19、甲酸+4mmoL甲酸胺的水溶液； 流动相B： 乙腈 0029 b、 液相条件： 0030 色谱柱： Waters ACQUITY UPLC BEH C18， 2.1mm50mm， 1.7 m 0031 梯度洗脱程序： 流动相A+流动相B100； 00.35min， 流动相A体积保持65.0； 0.351.00min， 流动相A体积由65.0递减至5.0； 1.001.50min， 流动相A体积保持 5.0； 1.501.51min， 流动相A体积由5.0升高至80.0； 1.512.30min， 流动相A体积 由80.0降低至5.0； 2.302.60min， 流动相A体积保持5.0； 2.6。

20、02.70min， 流动相A 体积由5.0升高至65.0； 2.703.00min， 流动相A体积保持65.0； 0032 c、 质谱条件： 0033 离子源： ESI+； 锥孔电压(V)： 60； 去溶剂化温度()： 500； 去溶剂化流速(L/H)： 1000； 锥孔流速： 150L/Hr； 雾化压力： 7.0Bar； 0034 (3)结果分析： 0035 通过各校准品标示浓度(X)， 校准品中尼洛替尼和尼洛替尼同位素内标的峰面积 比值(Y)， 绘制校准曲线， 并拟合校准曲线方程； 再将待检测血斑的尼洛替尼的峰面积与尼 洛替尼同位素内标的峰面积比值， 带入校准曲线方程， 即可定量计算待检测。

21、血斑中尼洛替 尼的浓度。 本发明提供的试剂盒， 以干血斑为样本载体， 可实现取较少血量(10ul)即可实现 精确检测， 所需样本量远低于液态基质。 而常规液态生物样本全血、 血清、 血浆一次测定需 要数毫升采血量， 且血清、 血浆需要再离心制备， 采样量大， 前处理繁琐。 0036 本发明的试剂盒将校准品样本和质控品样本保存在血斑卡中， 具有优异的稳定 性， 样本中尼洛替尼在严酷的环境中保存稳定， 无需冷链运输， 试剂盒干血斑中化合物的稳 定性在未密封(40度， 湿度75)的条件下与密封条件相当， 均符合要求， 保证了检测结果的 准确度。 0037 本发明的试剂盒的校准品和质控品均匀性好， 样。

22、本扩散均匀一致， 血斑的中心与 边缘位置尼洛替尼定量结果没有显著性差异； 采用打孔器能精确打取相同面积的血斑样 本， 取样精确， 消除了液态基质取样不精准导致的检测结果偏差。 附图说明 0038 图1为本发明的一实施例的尼洛替尼干血斑校准品固定于血斑采集卡的示意图。 0039 图2为本发明的一实施例的尼洛替尼干血斑质控品固定于血斑采集卡的示意图。 0040 图3为尼洛替尼低值样本加速稳定性(密封)的数据分析图。 0041 图4为尼洛替尼高值样本加速稳定性(密封)的数据分析图。 0042 图5为尼洛替尼低值样本加速稳定性(未密封)的数据分析图。 0043 图6为尼洛替尼高值样本加速稳定性(未密封。

23、)的数据分析图。 说明书 3/10 页 6 CN 110045037 A 6 具体实施方式 0044 下面将对本发明的技术方案进行清楚、 完整的描述， 显然， 所描述的实施例是本发 明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在 没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例， 都属于本发明保护的范围。 0045 实施例1： 试剂盒组成 0046 一种检测干血斑中尼洛替尼药物浓度的试剂盒， 包括： 内标提取试剂、 干血斑校准 品和干血斑质控品。 其中， 0047 内标提取试剂采用D6-尼洛替尼作为内标物， 内标提取试剂的溶剂为有机溶剂与 水的混合物； 。

24、有机溶剂为甲醇、 或乙腈、 或甲醇与乙腈的混合液， 有机溶剂与水的体积比为 (1.54.0):1。 0048 尼洛替尼干血斑校准品为一组具有不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本， 所述 干血斑样本的数量为至少6个， 所述干血斑样本固定于血斑采集卡； 所述浓度梯度的浓度范 围为50-4000ng/mL。 如图1所示， 该尼洛替尼校准品卡具有7个不同浓度的尼洛替尼的干血 斑样本C1C7。 7个干血斑样本中的尼洛替尼浓度呈一定的浓度梯度， C1C7的尼洛替尼浓 度从低至高排布。 0049 尼洛替尼干血斑质控品包括一个空白对照干血斑质控样本和三个不同浓度梯度 的尼洛替尼的干血斑样本。 该空白对照干血斑质。

25、控点为空白全血， 其中不含有尼洛替尼。 该 三个不同浓度梯度的尼洛替尼的干血斑样本分别为低浓度质控样本(LQC样本)、 中浓度质 控样本(MQC样本)和高浓度质控样本(HQC样本)； 其中， LQC样本中尼洛替尼浓度为100 500ng/mL， MQC样本中尼洛替尼浓度为15002500ng/mL， HQC样本中尼洛替尼浓度为2800 3600ng/mL。 如图2所示， 该尼洛替尼校质控卡具有两组质控样本， 每一组质控样本具有四个 质控点， 分别为空白对照干血斑质控样本(blank)、 低浓度质控样本(LQC样本)、 中浓度质控 样本(MQC样本)和高浓度质控样本(HQC样本)。 采用质控品卡。

26、对检测结果进行质量控制， 并 附有空白对照用于尼洛替尼的专属性、 特异性评价、 高浓度样本残留的监测。 尤其是在大批 量样本的分析检测或长时间分析检测中， 每间隔一定数量的样本可以插入质控品进行检 测， 以验证检测结果的准确性， 还能够验证仪器状态是否良好、 样本前处理操作是否合理。 0050 本发明的试剂盒还包含说明书、 标签、 外包装盒。 0051 试剂盒的一种具体组分如下所示： 0052 说明书 4/10 页 7 CN 110045037 A 7 0053 0054 其中， 校准品卡中， 干血斑C7校准点由移液管量取一定浓度相应体积的尼洛替尼 工作溶液， 容量瓶量取混合均匀的兔血并定容，。

27、 二者轻微混合数次保证均匀， 其浓度为 4000ng/mL。 C2-C6兔血基质校准点， 由C1， C7校准点采用十万级天平按计算比例称重配制或 按体积法比例量取， 混合均匀。 将上述C1-C7兔血基质校准品在十万级净化车间， 采用移液 装置点制在DBS卡上， 点血体积10uLV40uL， 血斑卡为GE whatman903、 DMPK-A卡， 但不限 于上述品牌及型号。 0055 上述试剂盒用于液相色谱串联质谱检测方法的检测方法， 包括如下步骤： 0056 (1)样本前处理： 0057 1、 采用干血斑打孔器打取直径3mm的干血斑至96孔板中， 加入80甲醇的水溶 液， 内含20ng/mL尼。

28、洛替尼同位素内标。 0058 2、 在双空白样本中加入80甲醇溶液， 其他样本中加入上述内标提取液， 体积为 250uL至300uL， 涡旋混合5min， 4000r/min4离心10min。 0059 3、 吸取上清液至新的96孔板中， 4000r/min4离心5min。 0060 4、 LC-MS/MS 2uL进样分析。 0061 (2)LC-MS/MS质谱进样分析， 包含 0062 1、 流动相配制 0063 流动相A： 0.1甲酸+4mmoL甲酸胺的水溶液； 流动相B： 乙腈； 0064 2、 质谱方法、 液相方法建立 0065 色谱柱： Waters ACQUITY UPLC BEH。

29、 C18， 2.1mm50mm， 1.7 m 0066 梯度洗脱程序： 0067 说明书 5/10 页 8 CN 110045037 A 8 0068 0069 3、 仪器进样及结果分析 0070 (1)MS设置： 0071 离子源： ESI+； 锥孔电压(V)： 60； 去溶剂化温度()： 500； 去溶剂化流速(L/H)： 1000； 锥孔流速： 150L/Hr； 雾化压力： 7.0Bar； 0072 (2)采集离子： 0073 化合物名称母离子(m/z)子离子(m/z)驻留时间(s)锥孔电压(v)碰撞能量(v) 尼洛替尼530.3604259.27440.07110058 尼洛替尼530。

30、.3604289.25160.07110028 尼洛替尼-D6536.3266295.22620.0715830 0074 (3)结果分析 0075 本试剂盒采用内标法对尼洛替尼进行定量。 通过7个校准品标示浓度(X)， 校准品 中尼洛替尼和尼洛替尼同位素内标的峰面积比值(Y)， 绘制校准曲线， 并拟合校准曲线方 程； 再将检测样品的尼洛替尼的峰面积与尼洛替尼同位素内标的峰面积比值， 带入校准曲 线方程， 即可定量计算样本中尼洛替尼的浓度。 此外， 试剂盒附有高、 中、 低三个不同浓度的 质控品对检测结果进行质量控制， 并附有空白对照用于尼洛替尼的专属性、 特异性评价、 高 浓度样本残留的监测。

31、。 0076 实施例2： 尼洛替尼DBS点样体积对检测结果的研究 0077 使用LC-MS/MS方法检测干血片中尼洛替尼的浓度， 研究点样体积对检测结果的影 响。 0078 用HCT值为40的全血配制高浓度样本(high)、 低浓度样本(low)， 样本浓度同 HQC、 LQC。 0079 体积效应血斑卡的准备： 取上述HQC、 LQC样本， 分别点10uL,15uL,20uL,40uL于DBS 卡上。 每个样本重复三次， 室温条件下晾干备用。 0080 实验结果： 说明书 6/10 页 9 CN 110045037 A 9 0081 0082 可接受标准： 考察点样体积为10 L， 15 L。

32、， 20 L,30ul或40 L时检测浓度。 当CV 15， 相对理论值偏倚20， 视为体积效应对检测结果没有影响。 0083 实验分析： 分别取10， 15， 20， 30， 40ul进行点样， 其中点样体积15ul有一个HQC样品 点偏倚为35.6， 其余两个平行点偏倚为-1.7和-3.5， 并且其余10ul-40ul样品点均符 合要求， 本实验结果表明体积效应对检测结果没有影响。 0084 实验结论： 实验结果表明本试剂盒可实现取较少血量(10ul)即可实现精确检测。 0085 实施例3： 尼洛替尼DBS加速稳定性实验 0086 用上述实施例所述的试剂盒的配制方法和检测方法， 在比日常操。

33、作更加严酷(高 温40高湿75)的环境下保存样本， 在更短的时间内检测样本的储存稳定性。 0087 实验结果数据统计： 参考EP25-A长期稳定性的数据统计方法， 以时间为横坐标， 每 个时间点检测平均浓度为纵坐标做散点图， 使用线性回归分析得到回归方程YbX+a。 0088 1)将斜率b与0作t检验， 如果没有显著性差异(P0.05)， 则样品在检测时间段内保 持稳定。 0089 2)如果斜率b与0有显著性差异(P0.05)， 则画出回归线的95单侧置信线， 在Y 轴可接受限(T0点浓度20的浓度点)处平行于X轴作直线， 与95单侧置信线相交点对 应的X轴时间， 为可接受的稳定性时间。 00。

34、90 样本平均浓度(ng/ml) 0091 说明书 7/10 页 10 CN 110045037 A 10 0092 0093 尼洛替尼低值样本加速稳定性(密封， ng/ml) 0094 Days036102030 Lot-1489.844464.124488.262392.660390.569516.950 Lot-2445.346449.423462.778388.015391.027508.372 Lot-3442.437465.134434.856406.125411.556506.517 AVE459.209459.560461.965395.600397.717510.613 SD。

35、21.6957.18021.8107.6809.7874.544 CV4.721.564.721.942.460.89 相对T0偏倚00.080.60-13.85-13.3911.19 相对理论偏倚3.193.273.81-11.10-10.6314.74 0095 尼洛替尼高值样本加速稳定性(密封， ng/ml) 0096 Days036102030 Lot-13250.5543238.5173011.8743228.4772618.3903367.047 Lot-23112.0643220.7113055.8603154.5452710.7113442.140 Lot-33214.9613。

36、305.9503299.7473191.2322681.8603376.780 AVE3192.5263255.0593122.4943191.4182670.3203395.322 SD58.72236.712126.61730.18338.56333.343 CV1.841.134.060.951.440.98 相对T0偏倚01.96-2.19-0.03-16.366.35 相对理论偏倚5.988.053.655.94-11.3612.71 0097 尼洛替尼低值样本加速稳定性(未密封， ng/ml) 0098 Days036102030 Lot-1489.844466.547414.40。

37、3431.966359.892477.817 Lot-2445.346502.236429.724425.544386.641465.844 Lot-3442.437449.121406.131431.703423.085464.570 AVE459.209472.635416.753429.738389.873469.410 SD21.69522.1079.7742.96725.8995.967 CV4.724.682.350.696.641.27 相对T0偏倚02.92-9.25-6.42-15.102.22 说明书 8/10 页 11 CN 110045037 A 11 相对理论偏倚3.。

38、196.21-6.35-3.43-12.395.49 0099 尼洛替尼高值样本加速稳定性(未密封， ng/ml) 0100 Days036102030 Lot-13250.5543505.3742863.0133292.9972918.9803428.498 Lot-23112.0643073.0082897.8743170.0802699.8253445.782 Lot-33214.9613184.6263263.4653141.2642654.3453304.076 AVE3192.5263254.3363008.1173201.4472757.7173392.785 SD58.7221。

39、83.266181.11865.796115.53263.123 CV1.845.636.022.064.191.86 相对T0偏倚01.94-5.780.28-13.626.27 相对理论偏倚5.988.03-0.156.27-8.4612.62 0101 实验总结： 尼洛替尼兔血基质样本40度加速稳定性， 在高温高湿环境下采用密封 和未密封两种保存条件， 放置30天检测显示密封条件下低值样本相对T0偏倚11.19， 高值 样本偏倚6.35， 第0， 3， 6， 10， 20， 30天尼洛替尼浓度数据经回归分析， 低值样本回归方程Y 0.776*X+438.5， 斜率95置信区间-4.456。

40、6.008， P0.75040.05， 无显著性差异， 稳 定性符合要求。 高值样本回归方程Y-1.277*X+3153， 斜率95置信区间为-31.25 28.69， P0.91160.05， 无显著性差异， 稳定性符合要求。 放置第30天检测显示未密封条件 下低值样本相对T0偏倚2.22， 高值样本偏倚6.27， 第0， 3， 6， 10， 20， 30天尼洛替尼浓度 数据经回归分析， 低值样本回归方程Y-0.3638*X+443.8， 斜率95置信区间为-4.349 3.622， P0.81240.05， 无显著性差异， 稳定性符合要求。 高值样本回归方程Y0.7435*X+ 3126，。

41、 斜率95置信区间-26.2627.75， P0.94270.05， 无显著性差异， 稳定性符合要 求。 0102 实验结论： 以上结果表明本试剂盒DBS载体中的尼洛替尼在严酷的环境中保存稳 定， 无需冷链运输， 试剂盒干血斑中化合物的稳定性在未密封(40度， 湿度75)的条件下与 密封条件相当， 均符合要求。 0103 实施例4： 尼洛替尼DBS中心边缘效应对检测结果的研究 0104 从血斑边缘打卡检测浓度与血斑中心打卡比较， 使用LC-MS/MS方法检测干血片中 尼洛替尼的浓度， 研究层析效应对检测结果的影响。 0105 用HCT值为40的全血配制高浓度样本(High)、 低浓度样本(Lo。

42、w)， 样本浓度同 HQC、 LQC。 0106 每个样本重复三次， 室温条件下晾干备用。 0107 实验结果: 0108 说明书 9/10 页 12 CN 110045037 A 12 0109 0110 可接受标准： 从血斑边缘打卡检测浓度与血斑中心打卡比较。 当CV15， 偏倚 20是， 视为层析效应对检测结果没有影响。 0111 实验分析： 取20 L和40 L进行点样， 分别从血斑边缘与血斑中心打卡， 样品点实验 结果均符合要求， 层析效应对检测结果没有影响。 0112 实验结论： 现有传统样本需要精确采集一定体积血液样本， 否则将影响定量准确 度。 本试剂盒DBS卡的中心与边缘位置。

43、尼洛替尼定量结果没有显著性差异， 血液中的尼洛替 尼在DBS卡纸上扩散均匀， 降低了对体积要求的精密度。 本试剂盒基于DBS的尼洛替尼定量 结果直接改善了现有技术的不足， 无需精确采样。 0113 综上所述， 上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已， 并不用以限定本发明的 保护范围， 凡在本发明的精神和原则之内， 所做的任何修改、 等同替换、 改进等， 皆应包含在 本发明的保护范围内。 说明书 10/10 页 13 CN 110045037 A 13 图1 图2 说明书附图 1/3 页 14 CN 110045037 A 14 图3 图4 说明书附图 2/3 页 15 CN 110045037 A 15 图5 图6 说明书附图 3/3 页 16 CN 110045037 A 16 。