由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合物的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910280532.8 (22)申请日 2019.04.09 (71)申请人 嘉兴市爵拓科技有限公司 地址 314300 浙江省嘉兴市海盐县武原街 道盐北路211号西区2幢102室-9 (72)发明人 孙坤来张译文宫凯凯赵成英 (74)专利代理机构 北京国翰知识产权代理事务 所(普通合伙) 11696 代理人 吕彩霞 (51)Int.Cl. A61K 31/407(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12P 1。

2、7/18(2006.01) C12R 1/67(2006.01) (54)发明名称 一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合 物的应用 (57)摘要 本发明提供一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉 得到的化合物的应用， 属于微生物技术领域， 包 括： 制备具有抑制蛋白激酶的药物与抑制蛋白激 酶； 制备抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的药物 与抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系； 制备抑制人 非小细胞肺癌A549细胞系的药物与抑制人非小 细胞肺癌细胞A549细胞系； 制备具有抑制细菌活 性的抑菌剂与抑制细菌。 有益效果为： 所述化合 物对CDK、 PKC-、 Src等蛋白激酶具有较为优异 的抑制作用， 可作为所。

3、述蛋白激酶相关癌症的预 防和抑制药物有效成分， 所述化合物还对MCF-7 细胞系、 A549细胞系以及某些致病菌具有限制生 长的作用。 权利要求书2页 说明书16页 附图4页 CN 110051667 A 2019.07.26 CN 110051667 A 1.式(1)所示化合物的应用， 为如下(a)和/或(b)： (a)制备具有抑制蛋白激酶的药物； (b)抑制蛋白激酶； 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 其中， 式(1)中， R1、。

4、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6中至少一个是氘代的或氘。 2.一种蛋白激酶抑制剂， 其特征在于： 其活性成分为权利要求1中式(1)所示化合物； 所 述蛋白激酶抑制剂所针对的蛋白激酶包括CDK蛋白激酶、 PKC- 蛋白激酶、 Src蛋白激酶。 3.权利要求1所示化合物的应用， 其特征在于为如下(a)和/或(b)： (a)制备抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的药物； (b)抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系。 4.一种抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的药物， 其特征在于其活性成分为权利要求1所 示化合物。 5.根据权利要。

5、求4所述的药物， 其特征在于所述药物的功能为如下(a)和/或(b)和/或 (c)： (a)： 预防MCF-7人乳腺癌； (b)： 抵抗人乳腺癌细胞MCF-7细胞系； (c)： 治疗MCF-7人乳腺癌。 6.权利要求1所示化合物的应用， 其特征在于为如下(a)和/或(b)： (a)制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞系的药物； (b)抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系。 7.一种抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系的药物， 其特征在于其活性成分为权利要 求1所示化合物。 8.根据权利要求7所述的药物， 其特征在于： 所述抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系 体现为可将人非小细胞肺癌A549细胞阻。

6、止在S期。 9.权利要求1所示化合物的应用， 其特征在于为如下(a)和/或(b)： (a)制备具有抑制细菌活性的抑菌剂； (b)抑制细菌； 其中， 所述细菌包括立枯丝核菌、 拟盘多毛孢属、 荔枝霜疫霉菌、 花生黑腐病菌、 金黄色 葡萄球菌和白色念珠菌。 权利要求书 1/2 页 2 CN 110051667 A 2 10.一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合物的应用， 其特征在于： 所述由凡纳滨对 虾中的黄曲霉得到化合物的步骤包括： 1)获取真菌材料： 采集凡纳滨对虾， 洗涤后捣碎并稀释； 稀释液均匀涂布在马铃薯右旋 糖琼脂培养基上， 培养后收集并纯化菌落； 鉴定菌株是黄曲霉OUCMDZ-220。

7、5； 2)发酵提取： 配制发酵液， 将所述黄曲霉培养在含有发酵液的容器中， 静态条件下持续 生长； 发酵液过滤以分离滤液和菌丝； 滤液用乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯溶液 ； 用丙酮提 取菌丝三次得丙酮溶液， 减压浓缩后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液； 乙酸乙酯 溶液 和混合后减压浓缩得乙酸乙酯提取物； 3)纯化鉴定： 乙酸乙酯提取物注入硅胶VLC柱， 以石油醚-CH2Cl2和CH2Cl2-MeOH逐级梯度 洗脱， 获取馏分2； 葡萄糖凝胶将馏分2以CH2Cl2-MeOH进一步纯化， 得到馏分2.2， 注入HPLC纯 化， MeOH-H2O洗脱馏分2.2后在tR8min得到目标化合物1； 4)制。

8、备： 目标化合物1即权利要求1中式(1)MH所示的化合物； 目标化合物1分别与K+、 Li+、 Na+、 NH4+的盐酸盐和/或硫酸盐发生反应， 即可获得相应目标化合物的钾盐、 锂盐、 钠盐 与铵盐。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110051667 A 3 一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合物的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合 物的应用。 背景技术 0002 凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)， 又称南美白对虾(White Prawn)， 别名白脚 虾、 凡纳对虾， 原产国家厄瓜多尔， 原产地中南美太。

9、平洋海岸水域， 生长气候带热带、 亚热 带、 暖温带、 温带海域， 分布于太平洋西海岸至墨西哥湾中部， 生命周期一年。 0003 黄曲霉属于半知菌类， 一种常见腐生真菌， 多见于发霉的粮食、 粮制品及其它霉腐 的有机物上。 菌落生长较快， 结构疏松， 表面灰绿色， 背面无色或略呈褐色。 菌体有许多复杂 的分枝菌丝构成。 营养菌丝具有分隔； 气生菌丝的一部分形成长而粗糙的分生孢子梗， 顶端 产生烧瓶形或近球形顶囊， 表面产生许多小梗(一般为双层)， 小梗上着生成串的表面粗糙 的球形分生孢子。 分生孢子梗、 顶囊、 小梗和分生孢子合成孢子头， 可用于产生淀粉酶、 蛋白 酶和磷酸二酯酶等， 也是酿造。

10、工业中的常见菌种。 众所周知， 微生物早已成为抗生素、 酶抑 制剂等活性物质的重要来源。 微生物由于可以大规模发酵培养， 无原料限制， 不会破坏环境 等优点已成为天然产物研究领域的热点。 近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅 降低， 而海洋来源微生物由于其生存环境特异， 除可产生与陆地相似的代谢产物之外， 有时 还会产生一些结构特异的新化合物， 显示了巨大的开发利用前景。 曲霉属真菌一直以来都 是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变， 除了常规的甾体， 倍半 萜， 蒽醌等常见结构类型以外， 往往还含有： 生物碱类， 肽类、 聚酮类、 二倍半萜等多种的骨 架。 这些结构新。

11、颖的化合物往往还含有细胞毒， 抗菌， 抗病毒等多种活性， 成为海洋药物先 导化合物的重要来源之一， 引起了业内学者的广泛关注。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合物的应用， 所述 化合物对CDK、 PKC- 、 Src等蛋白激酶具有较为优异的抑制作用， 可作为所述蛋白激酶相关 癌症的预防和抑制药物有效成分， 所述化合物还对MCF-7细胞系、 A549细胞系以及某些致病 菌具有限制生长的作用。 0005 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为： 0006 1式(1)所示化合物的应用， 为如下(a)和/或(b)： 0007 (a)制备具有抑制蛋白激酶的药物。

12、； 0008 (b)抑制蛋白激酶； 0009 说明书 1/16 页 4 CN 110051667 A 4 0010 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0011 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0012 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 0013 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6中至少一个是氘代的或氘； 0014 其中， 所述蛋白激酶包括CDK蛋白激酶、 PKC- 蛋白激酶、 Src蛋白激酶。。

13、 0015 2一种蛋白激酶抑制剂， 其活性成分为项1中式(1)所示化合物； 0016 其中， 所述蛋白激酶抑制剂所针对的蛋白激酶包括CDK蛋白激酶、 PKC- 蛋白激酶、 Src蛋白激酶。 0017 3如项2所述的蛋白激酶抑制剂， 所述蛋白激酶抑制剂体现为 0018 对CDK蛋白激酶的IC50不超过23.9 M； 0019 对PKC- 蛋白激酶的IC50不超过30.7 M； 0020 对Src蛋白激酶的IC50不超过10.6 M。 0021 CDK及其相关蛋白在增殖细胞中协调和驱动细胞周期的作用十分关键， CDK抑制 剂也可被用于治疗如病毒感染、 自身免疫性疾病和神经退行性疾病等其他疾病， 因。

14、此， 具有 CDK抑制活性的如式(1)的化合物对癌症的预防和治疗具有重要意义； PKC- 介导炎症、 有丝 分裂和血管生成作用的信号并参与发生结肠癌、 乳腺癌、 肺癌和神经母细胞瘤的发展， PKC- 抑制剂是一种新的药物， 可以有效地减轻血管并发症， PKC- 抑制表明可能如式(1)的化合 物是抗癌药物的潜在靶向化合物； Src在细胞增殖、 分化、 运动和定位等细胞进程中都发挥 重要作用， 人类Src基因产物c-Src在人类多种肿瘤细胞中过度表达并高度激活， 且Src 的 活化将激活与肿瘤恶化有关的MAPK和PI3K/Akt途径， 因此具有高度抑制Src 蛋白激酶的如 式(1)的化合物是与Sr。

15、c蛋白激酶相关癌症的潜在药物化合物。 0022 4式(1)所示化合物的应用， 为如下(a)和/或(b)： 0023 (a)制备抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的药物； 0024 (b)抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系； 0025 0026 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0027 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0028 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 0029 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R。

16、5和R6中至少一个是氘代的或氘。 0030 5如项4所述的应用， 所述抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系体现为抑制人乳腺 癌细胞MCF-7细胞系细胞复制。 0031 6一种抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系的药物， 其活性成分为式(1)所示化合物； 说明书 2/16 页 5 CN 110051667 A 5 0032 0033 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0034 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0035 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R。

17、5和R6各自独立地选自氢或氘； 0036 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6中至少一个是氘代的或氘。 0037 优选地， 所述项6的药物中还添加有药剂学中能够接受的辅料， 将活性成分制备 成片剂、 胶囊剂、 锭剂、 注射剂、 悬浮剂、 栓型、 软膏剂中的一种或多种剂型。 0038 进一步优选地， 所述辅料包括赋形剂和载体， 所述赋形剂包括碳酸钙、 磷酸钙、 糖 类、 淀粉、 纤维素衍生物、 明胶、 植物油和聚乙二醇中的一种或多种组合物， 载体包括稀释 剂、 崩解剂、 粘合剂和润滑剂中的一种或多种组合物。 0039 优选地， 所述项6的药物中活性成分的剂量为0.1500mg/k。

18、g。 0040 进一步优选地， 所述项6的药物中活性成分的剂量为250mg/kg。 0041 7如项6所述的药物， 所述抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞系体现为抑制人乳腺 癌细胞MCF-7细胞系细胞复制。 0042 8式(1)所示化合物在制备的药物中的应用； 所述药物的功能为如下(a)和/或 (b)和/或(c)： 0043 (a)： 预防MCF-7人乳腺癌； 0044 (b)： 抵抗人乳腺癌细胞MCF-7细胞系； 0045 (c)： 治疗MCF-7人乳腺癌。 0046 9一种药物， 其活性成分为项6中式(1)所示化合物； 所述药物的功能为如下 (a)和/或(b)和/或(c)： 0047 (a)：。

19、 预防MCF-7人乳腺癌； 0048 (b)： 抵抗人乳腺癌细胞MCF-7细胞系； 0049 (c)： 治疗MCF-7人乳腺癌。 0050 式(1)所示的化合物对人乳腺癌细胞MCF-7细胞系具有较高的细胞毒性作用， 其可 通过抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞内蛋白激酶的活性而达到抑制其复制的目的， 式(1)所示 的化合物对人乳腺癌细胞MCF-7细胞系IC50的值不超过16.5 M， 其抑制作用较为显著， 在各 期人乳腺癌的治疗中体现出良好的应用前景， 在对预防、 治疗各期人乳腺癌的过程中体现 了良好的应用潜力。 0051 10式(1)所示化合物的应用， 为如下(a)和/或(b)： 0052 (a。

20、)制备抑制人非小细胞肺癌A549细胞系的药物； 0053 (b)抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系； 说明书 3/16 页 6 CN 110051667 A 6 0054 0055 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0056 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0057 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 0058 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6中至少一个是氘代的或氘。 0059 11如项10。

21、所述的应用， 所述抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系体现为抑制 人非小细胞肺癌细胞A549细胞系细胞复制。 0060 12一种抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系的药物， 其活性成分为式(1) 所示 化合物； 0061 0062 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0063 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0064 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 0065 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6。

22、中至少一个是氘代的或氘。 0066 优选地， 所述项9的药物中还添加有药剂学中能够接受的辅料， 将活性成分制备 成片剂、 胶囊剂、 锭剂、 注射剂、 悬浮剂、 栓型、 软膏剂中的一种或多种剂型。 0067 进一步优选地， 所述辅料包括赋形剂和载体， 所述赋形剂包括碳酸钙、 磷酸钙、 糖 类、 淀粉、 纤维素衍生物、 明胶、 植物油和聚乙二醇中的一种或多种组合物， 载体包括稀释 剂、 崩解剂、 粘合剂和润滑剂中的一种或多种组合物。 0068 优选地， 所述项9的药物中活性成分的剂量为0.1500mg/kg。 0069 进一步优选地， 所述项9的药物中活性成分的剂量为250mg/kg。 0070 。

23、13如项12所述的药物， 所述抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系体现为可将 人非小细胞肺癌A549细胞阻止在S期。 所述的药物可以有效降低人非小细胞肺癌细胞A549 细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量与活性， 从而弱化其的供能， 进一步抑制由两个核苷 酸链之间形成DNA连接酶的催化作用， 降低DNA 连接酶的分泌和活性， 阻止A549细胞DNA的 复制， 将细胞阻止在DNA复制期， 即DNA合成期， 也即是S期， 有效预防和抑制人非小细胞肺癌 细胞A549细胞系的复制， 在对预防、 治疗各期人非小细胞肺癌的过程中体现了良好的应用 前景。 0071 14式(1)所示化合物在制备的药物中的应用； 。

24、所述药物的功能为如下(a)和/ 或 (b)和/或(c)： 说明书 4/16 页 7 CN 110051667 A 7 0072 (a)： 预防A549人非小细胞肺癌； 0073 (b)： 抵抗人非小细胞肺癌细胞A549细胞系； 0074 (c)： 治疗A549人非小细胞肺癌。 0075 15一种药物， 其活性成分为式(1)所示化合物； 所述药物的功能为如下(a) 和/ 或(b)和/或(c)： 0076 (a)： 预防A549人非小细胞肺癌； 0077 (b)： 抵抗人非小细胞肺癌细胞A549细胞系； 0078 (c)： 治疗A549人非小细胞肺癌。 0079 16式(1)所示化合物的应用， 为。

25、如下(a)和/或(b)： 0080 (a)制备具有抑制细菌活性的抑菌剂； 0081 (b)抑制细菌； 0082 0083 其中， 所述化合物如式(1)所示， 或其药学上可接受的盐、 前药、 水合物或溶剂化合 物、 多晶型、 立体异构体或同位素变体； 0084 其中， 式(1)中， MH、 K+、 Li+、 Na+、 NH4+； 0085 其中， 式(1)中， R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地选自氢或氘； 0086 附加条件是R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6中至少一个是氘代的或氘； 0087 其中， 所述细菌包括立枯丝核菌、 拟盘多毛孢属、 荔枝霜疫霉菌、 花生黑腐。

26、病菌、 金 黄色葡萄球菌和白色念珠菌。 0088 17一种具有抑制细菌活性的抑菌剂， 其活性成分为式(1)所示化合物。 0089 18如项17所述的抑菌剂， 所述抑制细菌活性体现为MIC值不超过 10.5 M。 0090 所述抑菌剂可以拮抗多种植物病原真菌和多种人体条件致病菌， 具有良好的抑菌 活性， 抑菌剂能够与所述细菌发生特异性结合， 并影响其DNA聚合酶的生成和活性， 促进DNA 聚合酶失活， 从遗传分子层面上抑制细菌的复制， 从而达到杀灭细菌的目的， 所述抑菌剂在 抑制多种植物病原菌和人体致病菌方面具有良好的应用前景。 0091 上述项1-18中的如式(1)的化合物是经由凡纳滨对虾中的。

27、黄曲霉制备得到， 0092 0093 其中， 式(1)中， M、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地为氢； 0094 由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到如式(1)所示化合物(下称目标化合物1)的方 法， 包括： 0095 1获取真菌材料： 0096 1.1、 从江苏省连云港海域采集凡纳滨对虾， 对虾样品为依次用75乙醇和无菌海 说明书 5/16 页 8 CN 110051667 A 8 水洗涤， 用研钵捣碎， 以无菌水稀释至100倍； 0097 1.2、 100 L稀释液均匀涂布在马铃薯右旋糖琼脂培养基(PDA)上， PDA含马铃薯提 取物200g/L， 葡萄糖20g/L， 琼脂。

28、15g/L， 和余量海水， 在28下培养7d， 然后收集并纯化菌 落； 0098 1 .3、 根据菌落的形态学特征和18S rRNA基因序列进行鉴定菌株是黄曲霉 OUCMDZ-2205； 将黄曲霉OUCMDZ-2205样品置于PDA斜面上并储存于4。 0099 2发酵提取： 0100 2.1、 由葡萄糖10g/L、 麦芽糖20g/L、 甘露醇20g/L、 谷氨酸单钠10g/L、 KH2PO40.5g/ L、 MgSO47H2O0.3g/L、 酵母抽提物3g/L、 SEA盐33g/L和余量自来水配制发酵液， pH为7； 0101 2.2、 将黄曲霉OUCMDZ-2205培养在含有发酵液的容器中，。

29、 在静态条件、 25条件 下持续生长32d； 0102 2.3、 将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝； 滤液用等效体积的乙酸乙酯萃 取三次得到乙酸乙酯溶液 ； 用80丙酮提取菌丝三次得丙酮溶液， 丙酮溶液减压浓缩后以 乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液； 乙酸乙酯溶液 和混合后减压浓缩， 得到乙酸乙 酯提取物(70.2g)。 0103 3纯化鉴定： 0104 3.1、 乙酸乙酯提取物(70.2g)注入硅胶VLC柱， 以石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1) 和 CH2Cl2-MeOH(1000)逐级梯度洗脱， 依次获取八个主要馏分(馏分18)； 0105 3.2、 通过葡萄糖凝胶LH-20(。

30、1:1CH2Cl2-MeOH)将馏分2(3.8g)以 CH2Cl2-MeOH (100:1)进一步纯化， 得到馏分2.1和馏分2.2， 注入HPLC纯化， 以90MeOH-H2O洗脱， 馏分 2.2洗脱后在tR 8min得到目标化合物1(2.3mg)。 0106 4鉴定： 0107 4.1、 目标化合物1为黄色无定形粉末， 通过质谱峰在m/z 502.2939M+H+以及具 有14的不饱和度， 可得出分子式为C32H39NO4。 0108(已知化合物0) 0109 4.2、 紫外光谱显示吲哚二萜的特征峰在max(log ):233nm(4.15)和 248nm (4.28)。 通过目标化合物1。

31、与已知化合物0在1H和13C核磁共振数据之间的相似性表明目标化 合物1与已知化合物0同样具有六环吲哚二萜骨架。 0110 4.3、 通过目标化合物1与已知化合物0在详细NMR数据之间的比较表明三取代的乙 烯部分( C/H111.4/5.64,145.6)取代相应的1,1,1,2-四取代乙烷部分 ( C/H284/2.72& 1.87,104.7)； 同时， 在目标化合物1出现了一个额外的可交换质子 ( H4.55)。 0111 4.4、 上述4.3中的结论通过同核化学位移相关谱(1H-1H COSY)统计以及异核多糖 相关谱(HMBC)统计均可得到进一步确认， 如图1所示， 所述同核化学位移相。

32、关谱统计为H2- 13( H3.01,2.40)到H-14( H5.64)， 所述异核多糖相关谱统计为 H-14( H5.64)到C-4a( C155)和C-12C( C43.3)、 从H-2( H4.03)和H-4( H5.81)到 C-14a( C145.6)、 从OH-1 ( H4.55)到C-2/1 /2 ( C86.4/73.4/27.6)； 因此， 目标化合物1的平面结构被鉴定为9-异戊烯 说明书 6/16 页 9 CN 110051667 A 9 基帕西林。 0112 4.5、 其他相关结构可在NOESY频谱的基础上进行配置， 如图2所示， NOESY 频谱显 示的关键数据Me-。

33、12b( H1.29)到H-13 ( H3.01)和OH-4b( H4.91)以及 Me-12c( H1)到H-6a ( H2.71)、 H-13 ( H2.40)、 H3-2 ( H1.25)和H3-3 ( H1.14)， 表明虽然H-13 /H-6A/ME-12C/ H3-2 均处于相对取向， 但Me-12b/H-13 /OH-4b处于同一取向。 0113 4.6、 在 max240nm( -5.2)处的负CD Cotton效应表明(4bS,6aS,12bS,12cR)- 构 型。 此外， 从顺式取向的Me-12c和Me-2 可推测出(2R)构型， 该(2R)构型可通过ECD计算进一 步确。

34、定。 ECD计算表明， 目标化合物1在 max327nm处的长波长的CD曲线与计算出的ECD曲线一 致； 但与它的2-差向异构体， (2S )-2相反。 0114 综上所述， 目标化合物1即式(1)所示化合物被准确地鉴定为 (2R,4bS,6aS,12bS, 12cR)-9-异戊烯基帕西林。 0115 由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到目标化合物的方法简单易行， 其取材靶向性较 为明确， 原材料凡纳滨对虾来源广泛、 价格低廉， 而且目标化合物的得率与纯度较高， 其生 物学活性较强， 所述目标化合物所表现出的对CDK、 PKC- 、 Src等蛋白激酶以及人乳腺癌细 胞MCF-7细胞系、 人非小细胞肺。

35、癌细胞A549细胞系和部分植物源、 人体源致病菌具有较为优 异的抑制和限制作用， 可以作为相关的拮抗剂、 蛋白激酶抑制剂、 靶向药、 药物组合物和抑 菌剂等的主要活性成分， 具有较为深远的应用前景。 0116 本发明的有益效果为： 0117 1)由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到的目标化合物可作为CDK、 PKC- 、 Src 等蛋 白激酶的抑制剂或者药物或者药物组合物的主要成分， 可作为抗癌药物的潜在靶向化合 物， 并可有效减轻血管并发症， 对CDK、 PKC- 、 Src等相关癌症的预防和治疗具有重要意义； 0118 2)本发明所述化合物对人乳腺癌细胞MCF-7细胞系具有较高的细胞毒性作用， 。

36、其 可通过抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞内蛋白激酶的活性而达到抑制其复制的目的， 对人乳 腺癌细胞MCF-7细胞系IC50的值可达不超过16.5 M， 其抑制作用较为显著； 0119 3)所述以本发明所述化合物为主要活性成分的药物可以有效降低人非小细胞肺 癌细胞A549细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的含量与活性， 从而弱化其供能， 将细胞阻止在S 期， 有效预防和抑制人非小细胞肺癌细胞A549细胞系的复制； 0120 4)所述以本发明所述化合物为主要活性成分的抑菌剂可以拮抗多种植物病原真 菌和多种人体条件致病菌， 具有良好的抑菌活性， 从遗传分子层面上抑制细菌的复制， 从而 达到杀灭细菌的目的， 。

37、所述抑菌剂在抑制多种植物病原菌和人体致病菌方面具有良好的应 用前景； 0121 5)由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到目标化合物的方法简单易行， 其取材靶向性 较为明确， 原材料凡纳滨对虾来源广泛、 价格低廉， 而且目标化合物的得率与纯度较高， 其 生物学活性较强， 可以作为相关的拮抗剂、 蛋白激酶抑制剂、 靶向药、 药物组合物和抑菌剂 等的主要活性成分， 具有较为深远的应用前景。 0122 本发明采用了上述技术方案提供一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉得到的化合物的 应用， 弥补了现有技术的不足， 设计合理， 操作方便。 说明书 7/16 页 10 CN 110051667 A 10 附图说明 0123。

38、 图1为本发明的化合物的同核化学位移相关谱和异核多糖相关谱示意图； 0124 图2为本发明的化合物的NOESY频谱示意图； 0125 图3为本发明的化合物对CDK蛋白激酶的抑制作用示意图； 0126 图4为本发明的化合物对PKC- 蛋白激酶的抑制作用示意图； 0127 图5为本发明的化合物对Scr蛋白激酶的抑制作用示意图； 0128 图6为本发明的化合物对MCF-7细胞系的细胞毒性作用示意图； 0129 图7为本发明的化合物对A549细胞系的细胞毒性作用示意图； 0130 图8为本发明的化合物对荔枝霜疫霉菌的抗菌作用示意图。 具体实施方式 0131 定义 0132 本文中， 如无特别说明，“溶。

39、剂化合物” 指本发明化合物与溶剂分子配位形成特定 比例的配合物。 0133 本文中， 如无特别说明，“水合物” 指本发明化合物与水进行配位形成的配合物。 0134 本文中， 如无特别说明，“前药” 包括其本身可以是具有生物活性的或非活性的， 当 用适当的方法服用后， 其在人体内进行代谢或化学反应而转变成式(1)的一类化合物， 或式 (1)的一个化合物所组成的盐或溶液。 0135 本文中， 如无特别说明，“氘代” 指化合物或基团中的一个或多个氢被氘所取代； 氘 代可以是一取代、 二取代、 多取代或全取代。 术语 “一个或多个氘代的” 与 “一次或多次氘代” 可互换使用。 0136 本文中， 如无。

40、特别说明，“药学上可接受的盐” 是指， 在可靠的医学判断范围内， 适 合与人和低等动物的组织接触而没有过度毒性、 刺激性、 变态反应等等， 并且与合理的益 处/危险比例相称的那些盐。 药学上可接受的盐在本领域是众所周知的。 例如， Berge等人在 J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述的药学上可接受的盐。 0137 本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和无机和有 机碱的盐。 药学上可接受的无毒的酸加成盐的实例是与无机酸形成的盐， 例如盐酸、 氢溴 酸、 磷酸、 硫酸和高氯酸， 或与有机酸形成的盐， 例如乙酸、 草酸、 马来。

41、酸、 酒石酸、 枸橼酸、 琥 珀酸或丙二酸。 也包括使用本领域常规方法形成的盐， 例如， 离子交换方法。 其它药学上可 接受的盐包括： 已二酸盐、 海藻酸盐、 抗坏血酸盐、 天冬氨酸盐、 苯磺酸盐、 苯甲酸盐、 重硫酸 盐、 硼酸盐、 丁酸盐、 樟脑酸盐、 樟脑磺酸盐、 柠檬酸盐、 环戊丙酸盐、 二葡糖酸盐、 十二烷基 硫酸盐、 乙磺酸盐、 甲酸盐、 富马酸盐、 葡萄糖酸盐、 甘油磷酸盐、 葡糖酸盐、 半硫酸盐、 庚酸 盐、 己酸盐、 氢碘酸盐、 2-羟基-乙磺酸盐、 乳糖酸盐、 乳酸盐、 月桂酸盐、 月桂基硫酸盐、 苹果 酸盐、 马来酸盐、 丙二酸盐、 甲磺酸盐、 2-萘磺酸盐、 烟酸盐、 。

42、硝酸盐、 油酸盐、 草酸盐、 棕榈酸 盐、 双羟萘酸盐、 果胶酯酸盐、 过硫酸盐、 3-苯丙酸盐、 磷酸盐、 苦味酸盐、 特戊酸盐、 丙酸 盐、 硬脂酸盐、 琥珀酸盐、 硫酸盐、 酒石酸盐、 硫氰酸盐、 对甲苯磺酸盐、 十一烷酸盐、 戊酸盐， 等等。 衍生自合适的碱的药学上可接受的盐包括碱金属、 碱土金属、 铵和N+(C1-4烷基)4盐。 代 表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、 锂、 钾、 钙、 镁盐， 等等。 如果合适的话， 其它的药学上可 接受的盐包括与反离子形成的无毒的铵盐、 季铵盐和胺阳离子， 反离子例如卤离子、 氢氧 说明书 8/16 页 11 CN 110051667 A 11 根、。

43、 羧酸根、 硫酸根、 磷酸根、 硝酸根、 低级烷基磺酸根和芳基磺酸根。 0138 以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述： 0139 实施例1： 0140 本实施例提供一种由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到如式(1)所示化合物的方 法， 0141 0142 其中， 式(1)中， M、 R1、 R2、 R3、 R4、 R5和R6各自独立地为氢； 0143 由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到如式(1)所示化合物(下称目标化合物1)的方 法， 包括： 0144 1获取真菌材料： 0145 1.1、 从江苏省连云港海域采集凡纳滨对虾， 对虾样品为依次用75乙醇和无菌海 水洗涤， 用研钵捣碎， 以无菌水稀。

44、释至100倍； 0146 1.2、 100 L稀释液均匀涂布在马铃薯右旋糖琼脂培养基(PDA)上， PDA含马铃薯提 取物200g/L， 葡萄糖20g/L， 琼脂15g/L， 和余量海水， 在28下培养7d， 然后收集并纯化菌 落； 0147 1 .3、 根据菌落的形态学特征和18S rRNA基因序列进行鉴定菌株是黄曲霉 OUCMDZ-2205； 将黄曲霉OUCMDZ-2205样品置于PDA斜面上并储存于4。 0148 2发酵提取： 0149 2.1、 由葡萄糖10g/L、 麦芽糖20g/L、 甘露醇20g/L、 谷氨酸单钠10g/L、 KH2PO40.5g/ L、 MgSO47H2O0.3g。

45、/L、 酵母抽提物3g/L、 SEA盐33g/L和余量自来水配制发酵液， pH为7； 0150 2.2、 将黄曲霉OUCMDZ-2205培养在含有发酵液的容器中， 在静态条件、 25条件 下持续生长32d； 0151 2.3、 将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝； 滤液用等效体积的乙酸乙酯萃 取三次得到乙酸乙酯溶液 ； 用80丙酮提取菌丝三次得丙酮溶液， 丙酮溶液减压浓缩后以 乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液； 乙酸乙酯溶液 和混合后减压浓缩， 得到乙酸乙 酯提取物(70.2g)。 0152 3纯化鉴定： 0153 3.1、 乙酸乙酯提取物(70.2g)注入硅胶VLC柱， 以石油醚-CH2。

46、Cl2(1:1和0:1) 和 CH2Cl2-MeOH(1000)逐级梯度洗脱， 依次获取八个主要馏分(馏分18)； 0154 3.2、 通过葡萄糖凝胶LH-20(1:1CH2Cl2-MeOH)将馏分2(3.8g)以 CH2Cl2-MeOH (100:1)进一步纯化， 得到馏分2.1和馏分2.2， 注入HPLC纯化， 以90MeOH-H2O洗脱， 馏分 2.2洗脱后在tR 8min得到目标化合物1(2.3mg)。 0155 4鉴定： 0156 4.1、 目标化合物1为黄色无定形粉末， 通过质谱峰在m/z 502.2939M+H+以及具 有14的不饱和度， 可得出分子式为C32H39NO4。 01。

47、57 4.2、 紫外光谱显示吲哚二萜的特征峰在max(log ):233nm(4.15)和 248nm 说明书 9/16 页 12 CN 110051667 A 12 (4.28)。 通过目标化合物1与已知化合物0在1H和13C核磁共振数据之间的相似性表明目标化 合物1与已知化合物0同样具有六环吲哚二萜骨架。 0158 4.3、 通过目标化合物1与已知化合物0在详细NMR数据之间的比较表明三取代的乙 烯部分( C/H111.4/5.64,145.6)取代相应的1,1,1,2-四取代乙烷部分 ( C/H284/2.72& 1.87,104.7)； 同时， 在目标化合物1出现了一个额外的可交换质子。

48、 ( H4.55)。 0159 4.4、 上述4.3中的结论通过同核化学位移相关谱统计以及异核多糖相关谱统计均 可得到进一步确认， 所述同核化学位移相关谱统计为H2-13( H3.01,2.40)到 H-14( H5.64)， 所述异核多糖相关谱统计为H-14( H5.64)到C-4a( C155)和 C-12C( C43.3)、 从H-2 ( H4.03)和H-4( H5.81)到C-14a( C145.6)、 从OH-1 ( H4.55) 到C-2/1 /2 ( C86.4/73.4/ 27.6)(图2)； 因此， 目标化合物1的平面结构被鉴定为9- 异戊烯基帕西林。 0160 4.5、 。

49、其他相关结构可在NOESY频谱的基础上进行配置， NOESY频谱显示的关键数据 Me-12b( H1.29)到H-13 ( H3.01)和OH-4b( H4.91)以及Me-12c( H1) 到H-6a( H2.71)、 H-13 ( H2.40)、 H3-2 ( H1.25)和H3-3 ( H1.14)(图3)， 表明虽然 H-13 /H-6A/ME-12C/H3-2 均 处于相对取向， 但Me-12b/H-13 /OH-4b处于同一取向。 0161 4.6、 在 max240nm( -5.2)处的负CD Cotton效应表明(4bS,6aS,12bS,12cR)- 构 型。 此外， 从顺式。

50、取向的Me-12c和Me-2 可推测出(2R)构型， 该(2R)构型可通过ECD计算进一 步确定。 ECD计算表明， 目标化合物1在 max327nm处的长波长的CD曲线与计算出的ECD曲线一 致； 但与它的2-差向异构体， (2S )-2相反。 0162 综上所述， 目标化合物1即式(1)所示化合物被准确地鉴定为 (2R,4bS,6aS,12bS, 12cR)-9-异戊烯基帕西林。 0163 由凡纳滨对虾中的黄曲霉制备得到目标化合物的方法简单易行， 其取材靶向性较 为明确， 原材料凡纳滨对虾来源广泛、 价格低廉， 而且目标化合物的得率与纯度较高， 其生 物学活性较强， 所述目标化合物所表现出。