氨基酸衍生化方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910440539.1 (22)申请日 2019.05.24 (71)申请人 广东中烟工业有限责任公司 地址 510000 广东省广州市天河区林和西 横路186号8-16楼 (72)发明人 陈森林陶红林云胡玉玲 叶为民李攻科 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 张春水唐京桥 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种氨基酸衍生化方法及其应用 (57)摘要。

2、 本发明涉及氨基酸检测方法技术领域， 尤其 涉及一种氨基酸衍生化方法及其应用。 本发明公 开了一种氨基酸衍生化方法， 包括以下步骤： 将 pH值为9的氨基酸溶液加入到4-硝基苯甲酰氯溶 液中进行震荡反应， 得到衍生化的氨基酸。 该衍 生化方法中的衍生化剂4-硝基苯甲酰氯的硝基 处于对位， 能减少位阻的影响， 提高衍生化的效 率， 另外， 该衍生化过程简单快速， 操作简单， 衍 生化时间短。 该衍生化方法得到衍生化氨基酸无 需萃取分离， 可以直接进行定性定量测试。 由实 验数据可知， 衍生化的氨基酸直接采用常规的色 谱柱结合多反应监测模式的液相色谱-三重四级 杆质谱进行测定， 具有良好的响应， 。

3、且灵敏高， 选 择性好。 权利要求书1页 说明书10页 附图3页 CN 110057944 A 2019.07.26 CN 110057944 A 1.一种氨基酸衍生化方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将pH值为9的氨基酸溶液加入到4-硝基苯甲酰氯溶液中进行震荡反应， 得到衍生化的 氨基酸。 2.根据权利要求1所述的氨基酸衍生化方法， 其特征在于， 所述震荡反应的时间为 1min， 温度为2045。 3.根据权利要求1所述的氨基酸衍生化方法， 其特征在于， 所述4-硝基苯甲酰氯溶液的 浓度为10100mg/L。 4.根据权利要求1所述的氨基酸衍生化方法， 其特征在于， 所述4-硝基苯甲酰氯。

4、溶液的 溶剂为无水乙腈或吡啶。 5.根据权利要求1所述的氨基酸衍生化方法， 其特征在于， 所述氨基酸溶液中的氨基酸 为20种天然的L-型氨基酸。 6.权利要求1至5任意一项所述的氨基酸衍生化方法在烟叶氨基酸检测中的应用。 7.一种烟叶中氨基酸的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提取烟叶中的氨基酸， 所述氨基酸采用权利要求1至5任意一项所述的氨基酸衍生化方 法得到的衍生化的氨基酸， 然后将所述衍生化的氨基酸通过超高效液相色谱-三重四级杆 质谱进行定性定量分析。 8.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述超高效液相色谱的检测条件为： 色谱柱： Shim-pack XR-ODSI。

5、II(2.2 m,2.0mmi.d.200mm)； 进样量： 20 L； 柱温： 35； 洗脱方式： 梯度洗脱。 9.根据权利要求8所述的检测方法， 其特征在于， 所述梯度洗脱的条件为： 流动相A： 0.1的甲酸的水溶液； 流动相B： 乙腈； 流速： 0.3mL/min； 时间： 20min。 10.根据权利要求7所述的检测方法， 其特征在于， 所述三重四级杆质谱的检测条件为： 离子源： ESI； 检测方式： 多反应监测模式； 毛细管电压： 3.0kV； 离子源温度： 350； 脱溶剂气温度： 400； 脱溶剂气流量： 650L/hr； 锥孔气流量： 50L/hr。 权利要求书 1/1 页 2。

6、 CN 110057944 A 2 一种氨基酸衍生化方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及氨基酸检测方法技术领域， 尤其涉及一种氨基酸衍生化方法及其应 用。 背景技术 0002 氨基酸是既含氨基(-NH2)又含羧基(-COOH)的有机化合物的统称， 是构成蛋白质 的基本单位， 一些蛋白酶的活性是影响植物代谢快慢的重要因素。 氨基酸作为烟叶中的初 级和次级代谢产物， 在陈化、 降解的过程中与糖类物质也会发生酶棕化反应生成糖-氨基酸 复合物， 其复合产物经过进一步的降解会生成酮类、 呋喃类、 吡咯类、 有机酸等多种致香成 分， 氨基酸也会直接降解生成羰基类的致香成分， 从而影响烟叶的品质。 。

7、0003 氨基酸常用液相色谱法进行检测， 但因为氨基酸无紫外和荧光吸收， 形成碎片离 子的响应弱等， 通过柱前衍生的方式可以改变目标物的极性， 提高离子的响应， 从而实现快 速分离。 但现有的氨基酸衍生化方法衍生化时间长， 还需对衍生化后的样品进行萃取分离 等， 衍生化过程繁琐。 发明内容 0004 本发明提供了一种氨基酸衍生化方法， 解决了现有的氨基酸衍生化方法衍生化时 间长， 还需对衍生化后的样品进行萃取分离等， 衍生化过程繁琐的问题。 0005 其具体技术方案如下： 0006 本发明提供了一种氨基酸衍生化方法， 包括以下步骤： 0007 将pH值为9的氨基酸溶液加入到4-硝基苯甲酰氯溶液。

8、中进行震荡反应， 得到衍生 化的氨基酸。 0008 上述氨基酸衍生化反应原理如下： 0009 0010 本发明提供的氨基酸衍生化方法中的衍生化剂4-硝基苯甲酰氯的硝基处于对位， 能减少位阻的影响， 提高衍生化的效率， 而且4-硝基苯甲酰氯价格低廉， 方便易得。 另外， 利 用该衍生化试剂衍生化完成后可直接进行测定， 多余的衍生化试剂不影响后续氨基酸衍生 产物的定量测定。 该衍生化过程简单快速， 操作简单， 衍生化时间短。 该衍生化方法得到衍 说明书 1/10 页 3 CN 110057944 A 3 生化氨基酸无需萃取分离， 可以直接进行定性定量测试。 0011 本发明中， 所述震荡反应后， 。

9、得到所述衍生化的氨基酸前， 还包括： 过滤。 0012 优选地， 所述震荡反应的时间为120min， 更优选为1min， 温度为20-45。 0013 本发明中， 室温下即可完成衍生化反应。 0014 优选地， 所述4-硝基苯甲酰氯溶液的浓度为10100mg/L， 更优选为10mg/L； 0015 所述氨基酸溶液的浓度为101000 g/L， 更优选为10 g/L。 0016 本发明中， pH值为9的缓冲溶液制备方法为： 将NH4HCO3溶于超纯水中， 加入氨水溶 解， 使溶液的pH值为9。 0017 本发明中， 衍生化反应只需在pH值为9缓冲溶液中进行， 不需在反应结束时调节酸 碱度。 00。

10、18 优选地， 所述4-硝基苯甲酰氯溶液的溶剂为无水乙腈或吡啶(弱碱性溶剂中)， 更 优选为无水乙腈。 0019 优选地， 所述氨基酸溶液中的氨基酸为20种天然的L-型氨基酸。 0020 本发明还提供了上述氨基酸衍生化方法在烟叶氨基酸检测中的应用。 0021 本发明还提供了一种烟叶中氨基酸的检测方法， 包括以下步骤： 0022 提取烟叶中的氨基酸， 所述氨基酸采用上述氨基酸衍生化方法得到的衍生化的氨 基酸， 然后将所述衍生化的氨基酸通过超高效液相色谱-三重四级杆质谱进行定性定量分 析。 0023 本发明中， 采用上述氨基酸衍生化方法检测烟叶中的氨基酸方便快捷， 提高了检 测效率， 节省了检测时。

11、间。 0024 本发明中， 提取烟叶中的氨基酸按照照YC/T31-1996的要求处理烟叶样品。 0025 优选地， 所述超高效液相色谱的检测条件为： 0026 色谱柱： Shim-pack XR-ODS III(2.2 m,2.0mmi.d.200mm)； 0027 进样量： 20 L； 0028 柱温： 35； 0029 洗脱方式： 梯度洗脱。 0030 优选地， 所述梯度洗脱的条件为： 0031 流动相A： 0.1的甲酸的水溶液； 0032 流动相B： 乙腈； 0033 流速： 0.3mL/min； 0034 时间： 20min。 0035 优选地， 所述三重四级杆质谱的检测条件为： 00。

12、36 离子源： ESI； 0037 检测方式： 多反应监测模式； 0038 毛细管电压： 3.0kV； 0039 离子源温度： 350； 0040 脱溶剂气温度： 400； 0041 脱溶剂气流量： 650L/hr； 0042 锥孔气流量： 50L/hr。 说明书 2/10 页 4 CN 110057944 A 4 0043 本发明中， 衍生化后的氨基酸采用液相色谱-三重四级杆质谱的方法进行检测， 检 测灵敏度高、 稳定、 检测结果准确可靠。 0044 从以上技术方案可以看出， 本发明具有以下优点： 0045 本发明中提供了一种氨基酸衍生化的方法， 包括以下步骤： 将pH值为9的氨基酸溶 液加。

13、入到4-硝基苯甲酰氯溶液中进行震荡反应， 得到衍生化的氨基酸。 0046 本发明中， 衍生化剂4-硝基苯甲酰氯的硝基处于对位， 能减少位阻的影响， 提高衍 生化的效率， 另外， 该衍生化过程简单快速， 操作简单， 衍生化时间短。 该衍生化方法得到衍 生化氨基酸无需萃取分离， 可以直接进行定性定量测试。 由实验数据可知， 衍生化的氨基酸 直接采用常规的色谱柱结合多反应监测模式的液相色谱-三重四级杆质谱进行测定， 具有 良好的响应， 且灵敏高， 选择性好， 能够保证检测结果的准确可靠。 附图说明 0047 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案， 下面将对实施例或现 有技术描述中所需要。

14、使用的附图作简单地介绍， 显而易见地， 下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动性的前提下， 还可 以根据这些附图获得其它的附图。 0048 图1为本发明实施例1提供的一种氨基酸衍生化流程示意图， 其中， 衍生化试剂 4-硝基苯甲酰氯氨基酸目标物震荡辅助衍生化衍生化产物； 0049 图2为本发明实施例1中衍生后的丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸和脯氨酸的离子碎片图， 其中， a为丙氨酸， b为缬氨酸， c为亮氨酸， d为脯氨酸； 0050 图3为本发明实施例1中衍生后的20种天然的L-型氨基酸的多反应监测总离子色 谱图； 0051 图4为本发明实。

15、施例3烟叶样品的多反应监测总离子色谱图。 具体实施方式 0052 本发明实施例提供了一种氨基酸衍生化方法， 用于解决现有的氨基酸衍生化方法 衍生化时间长， 还需对衍生化后的样品进行萃取分离等， 衍生化过程繁琐的问题。 0053 为使得本发明的发明目的、 特征、 优点能够更加的明显和易懂， 下面将对本发明实 施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述， 显然， 下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分 实施例， 而非全部的实施例。 基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造 性劳动前提下所获得的所有其它实施例， 都属于本发明保护的范围。 0054 实施例1 0055 本实施例氨基酸为20种。

16、天然的L-型氨基酸， 其氨基酸衍生化的制备方法如下： 0056 (1)4-硝基苯甲酰氯衍生化试剂的制备： 0057 取10mg的4-硝基苯甲酰氯溶于一定的无水乙腈， 配成10mg/L的衍生化试剂。 0058 (2)NH4HCO3-NH4OH缓冲溶液的配制： 0059 取0.39g的NH4HCO3溶于超纯水中， 加入氨水， 溶解至50mL的容量瓶， 使缓冲溶液的 pH9。 0060 (3)氨基酸标准溶液的配制： 说明书 3/10 页 5 CN 110057944 A 5 0061 取10mg的氨基酸标准品， 用0.1mol/L的NH4HCO3-NH4OH的缓冲溶液配制成10 g/L的 混合标准溶。

17、液待用。 0062 (4)取900 L 10 g/L的氨基酸混合标准溶液， 加入100 L 10mg/L4-硝基苯甲酰氯 衍生化试剂， 震荡反应1min后， 得到衍生化后的氨基酸。 0063 实施例2 0064 将实施例1制备得到的衍生化后的氨基酸进样分析， 进行超高效液相色谱-三重四 级杆质谱检的母离子和产物离子扫描分析。 0065 色谱柱： Shim-pack XR-ODS III(2.2 m,2.0mmi.d.200mm)； 进样量： 20 L； 柱温： 35； 洗脱方式： 梯度洗脱： 流动相A： 0.1的甲酸的水溶液， 流动相B： 乙腈； 流速： 0.3mL/ min； 时间： 20m。

18、in。 三重四级杆质谱的检测条件为： 离子源： ESI； 检测方式： 多反应监测模式； 毛细管电压： 3.0kV； 离子源温度： 350； 脱溶剂气温度： 400； 脱溶剂气流量： 650L/hr； 锥 孔气流量： 50L/hr。 0066 实施例1制备得到的衍生化氨基酸经液相色谱检测结果如图4所示， 20种氨基酸均 检出。 0067 图2a、 2b、 2c和2d分别为丙氨酸、 缬氨酸、 亮氨酸和脯氨酸的产物离子扫描图。 图3 质谱的分析结果表明， 在负离子模式下， 衍生产物失去一个H后均可以形成m-1的母离子峰。 通过图2a、 图2b、 图2c产物离子质谱图， 对于一级氨基酸， 其衍生产物均。

19、产生了m/z 122.0和 150.0特征碎片离子峰， 一级氨基酸其断裂方式相同， 且对一级氨基酸有良好的响应。 通过 图2d可以看出4-硝基苯甲酰氯与脯氨酸等二级氨基酸有良好的响应， 也产生了m/z122.0的 碎片离子， 其衍生产物均可以找到对应的碎片离子峰。 0068 对质谱多反应监测MRM模式的参数进行优化， 结果如表1所示。 其标准曲线、 相关系 数、 线性范围、 检出限和相对标准偏差见表2。 由表2可知， 衍生化后的氨基酸采用的液相色 谱-三重四级杆质谱的方法数据稳定可靠， 方法的检出限为0.01-2.10 g/L， 说明衍生化后 的氨基酸采用液相色谱-三重四极杆质谱测定的灵敏度高。

20、。 0069 表1 实施例1提供的衍生化的氨基酸的定量离子对、 最优化碎裂电压和电离能 说明书 4/10 页 6 CN 110057944 A 6 0070 说明书 5/10 页 7 CN 110057944 A 7 0071 0072 表2 实施例1提供的衍生化的氨基酸的标准曲线、 相关系数、 线性范围、 检出限和 相对标准偏差 0073 说明书 6/10 页 8 CN 110057944 A 8 0074 0075 实施例3 0076 烟叶样品中氨基酸含量的测定： 0077 1、 按照YC/T31-1996的要求处理烟叶样品， 准确称量100mg烟叶样品， 加入超纯水 萃取10min后， 。

21、离心分离后所得的上清液用0.22 m的水相滤膜过滤， 得到萃取液。 取100 L萃 取液， 采用0.1mol/L的NH4HCO3-NH3的缓冲溶液稀释成10mL的待测样品。 取离心分离后900 L 样品稀释液， 加入100 L 10mg/L 4-硝基苯甲酰氯衍生化试剂， 震荡反应1min经有机滤膜过 滤与液相色谱-三重四级杆质谱联用测定， 通过建立的MRM多通道反应监测方法进行定量分 析， 其烟叶样品氨基酸含量和加标实验如表3所示。 0078 表3 本实施例烟叶样品的氨基酸含量和加标回收率和RSD值 说明书 7/10 页 9 CN 110057944 A 9 0079 说明书 8/10 页 1。

22、0 CN 110057944 A 10 0080 0081 实施例4 0082 本实施例为不同产地的烟叶样品中氨基酸含量的测定： 0083 分别取6份来自3个不同产地的烟叶样品， 其中贵州产地2份， 湖南产地2份、 云南产 地2份， 按照YC/T31-1996的要求分别处理烟叶样品， 分别比较不同产地的烟叶样品氨基酸 含量的差异。 准确称量100mg烟叶样品， 加入超纯水萃取10min后， 离心分离后所得的上清液 用0.22 m的水相滤膜过滤， 得到萃取液。 取100 L萃取液， 采用0.1mol/L的NH4HCO3-NH3的缓 冲溶液稀释成10mL的待测样品。 取离心分离后900 L样品稀释。

23、液， 加入100 L 10mg/L 4-硝 基苯甲酰氯衍生化试剂， 震荡反应1min经有机滤膜过滤后与液相色谱-三重四级杆质谱联 用测定， 通过建立的MRM多通道反应监测方法进行定量分析， 则3种来自不同产地的烟叶样 品的氨基酸含量( g/L)如表4所示。 由表4可知， 对于成分复杂的烟叶样品， 其基底不影响产 物的测定， 能进行准确的定量分析， 说明选择性好。 0084 表4 本实施例不同产地的烟叶样品中氨基酸含量 0085 说明书 9/10 页 11 CN 110057944 A 11 0086 0087 以上所述， 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制； 尽管参照前 述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解： 其依然可以对前 述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些 修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。 说明书 10/10 页 12 CN 110057944 A 12 图1 说明书附图 1/3 页 13 CN 110057944 A 13 图2 图3 说明书附图 2/3 页 14 CN 110057944 A 14 图4 说明书附图 3/3 页 15 CN 110057944 A 15 。