多孔的网状培养肉生产模具.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201921875316.X (22)申请日 2019.11.03 (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇 国家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 丁世杰唐文来周光宏杨继全 吴中元朱浩哲李春保徐幸莲 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛竞存 (51)Int.Cl. C12M 3/00(2006.01) C12N 5/0775(2010.01) C12N 5/077(2010.01) (ESM。

2、)同样的发明创造已同日申请发明专利 (54)实用新型名称 一种多孔的网状培养肉生产模具 (57)摘要 本实用新型涉及一种多孔的网状培养肉生 产模具。 该生产模具包括外壁， 第一凹槽， 第二凹 槽和由若干微柱规律排布组成的微柱阵列。 所述 第一凹槽设置在外壁内侧， 所述第二凹槽设置在 第一凹槽内部； 所述第二凹槽底部设置若干个微 柱， 所述若干个微柱规律排布形成微柱阵列。 微 柱阵列的设计考虑了后期混合凝胶压实过程中 的力学变化， 增强营养物质向细胞的扩散， 并通 过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维 细胞排列， 促进分化过程。 第二凹槽是培养肉肌 肉组织的培养空间。 第一凹槽的设计有利于阳。

3、模 脱模过程， 还可以扩大培养液的使用量， 促进营 养物质的交换。 利用该模具， 可以生产获得较大 的网状培养肉肌肉组织。 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 CN 211394496 U 2020.09.01 CN 211394496 U 1.一种多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述模具上端开口， 包括外壁(1)、 第 一凹槽(2)、 第二凹槽(3)、 微柱(4)； 所述第一凹槽(2)设置在外壁(1)内侧， 所述第二凹槽(3)设置在第一凹槽(2)底部； 所述第二凹槽(3)底部竖直设置若干个微柱(4)， 所述若干个微柱(4)错位间隔排列形 成微柱阵列。 2.根据权利要求1所述的多孔。

4、的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述微柱(4)的长 度为15mm， 宽度为0.51.5mm， 高度为15mm。 3.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述若干个微柱 (4)错位间隔排列为： 相邻行的微柱(4)之间间隔1-3mm， 相邻行的微柱(4)平行偏移1-4mm， 每行中的各微柱(4)之间间隔0.5-3mm。 4.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述微柱(4)的横 截面为矩形或椭圆形。 5.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述模具为上端开 口的长方体或者圆柱状体。 6.根据权利要求1所述的多孔的网。

5、状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述第一凹槽(2) 居中设置在外壁(1)内侧。 7.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述第一凹槽(2) 的高度为3-7mm。 8.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述第一凹槽(2) 的底部宽度为2-4mm。 9.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述第二凹槽(3) 居中设置在第一凹槽(2)底部。 10.根据权利要求1所述的多孔的网状培养肉生产模具， 其特征在于， 所述第二凹槽(3) 的高度为2-6mm。 权利要求书 1/1 页 2 CN 211394496 U 2 一种多孔。

6、的网状培养肉生产模具 技术领域 0001 本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域， 具体地， 涉及一种多孔的网状培 养肉生产模具。 背景技术 0002 中国是世界第一大肉类生产和肉类消费国。 肉类产品的需求还在进一步提升。 然 而， 传统的畜牧业生产存在着食物原料蛋白转化率不高， 环境污染以及一些病毒的流行会 威胁动物和人的健康等诸多问题。 培养肉生产时通过提取动物的干细胞在体外进行肉类的 生产， 具有缓解传统畜牧业诸多问题的潜力。 0003 培养肉的体外生产中最重要的技术之一就是体外生产肌肉组织。 传统的肌肉组织 工程利用仿生学的原理， 通过两个锚点来牵引体外肌肉组织。 这类肌肉组织一般较。

7、小， 目的 是应用到肌肉组织工程或者肌肉药物的筛选。 0004 培养肉需要在体外生产一种较大的肌肉组织用于食用， 而在一个大的区域内排列 许多肌肉细胞层是相当困难的。 目前用于培养肉研究和生产的培养肉生产模具有圆柱体单 柱型和两个锚点牵引的双柱型模具。 利用单柱型模具， 可以在圆柱体周围形成紧紧贴住圆 柱体的肌肉束， 展开后可以形成一条肌肉束。 双柱型模具也会在两个柱型锚点间形成一条 肌肉束。 但由于氧气和其他营养成分以及废物的运输距离极限是100-200um， 且一条肌肉束 由于力学原因不能过长， 因而限制了这两种模具获得较大的肌肉组织， 如何提供一种有利 于建立较大的且有利于组织营养成分和。

8、废弃物交换的培养肉组织的模具尤为重要。 发明内容 0005 为解决上述技术问题， 本实用新型提供一种具有较大尺寸、 规律排布微柱阵列的 多孔的网状培养肉生产模具， 将肌源性细胞和水凝胶肌肉组织胶置于其中培养， 可以获得 一个培养肉用的多孔的网状肌肉组织。 该模具还可以在保持微柱的尺寸和排列方式、 第一 凹槽2、 第二凹槽3的高度在本申请限定的范围内的同时， 对外壁， 第一凹槽， 第二凹槽的长 和宽进行扩大调整， 从而实现在体外生产出较大的、 符合未来工业生产大小的培养肉产品。 0006 本实用新型技术方案如下： 0007 一种多孔的网状培养肉生产模具， 所述模具上端开口， 包括外壁1、 第一凹。

9、槽2、 第 二凹槽3、 微柱4； 0008 所述外壁1的纵向截面为向下的二级阶梯状， 第一级为第一凹槽2的底部， 第二级 为第二凹槽3的底部。 0009 所述第一凹槽2设置在外壁1内侧， 第一凹槽主要作用是在第二凹槽加入培养肉所 需的混合凝胶细胞培养液之后， 第一凹槽还有较大的空间加入培养液， 提供适合的培养液 储存空间， 保证营养的供给。 第一凹槽还有利于制备本申请的模具时， 从阳模中脱模， 帮助 模具的制作(阳模可以但不限于通过3D打印获得)。 0010 所述第二凹槽3设置在第一凹槽2底部； 第二凹槽为主要用于加入培养肉所需混合 说明书 1/6 页 3 CN 211394496 U 3 凝。

10、胶的培养区域。 0011 所述第二凹槽3底部竖直设置若干个微柱4； 所述若干个微柱4规律错位间隔排布 形成微柱阵列， 微柱阵列的设计考虑了后期混合凝胶培养过程中的力学变化， 增强营养物 质向细胞的扩散， 并通过控制机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列， 促进分化 过程。 0012 进一步的， 所述微柱4的长度为15mm， 宽度为0.51.5mm， 高度为15mm。 0013 进一步的， 微柱4所述的规律排列方式为错位间隔排列。 0014 进一步的， 微柱4所述的错位间隔排列具体为： 相邻行的微柱4之间间隔1-3mm， 相 邻行的微柱4平行偏移1-4mm， 每行中的各微柱4之间间隔0.5-。

11、3mm。 0015 基于微柱4的该尺寸、 排列方式及间隔距离， 即使扩大模具尺寸， 也能够在培养肉 生产过程中， 结合含肌源性细胞混合凝胶形成凝胶以及凝胶压实过程中的力学变化， 给予 氧气和其他营养成分以及代谢废物适宜的运输距离， 使凝胶能在不同柱子之间收缩形成肌 肉束， 微柱周围由于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散， 并通过控制 机械张力的空间格局来引导局部的三维细胞排列， 促进分化过程， 从而获得较大的肌肉组 织。 0016 所述微柱4的行数2行； 优选的， 在以上微柱4的尺寸和排列方式范围内， 根据第 二凹槽3底部面积尽量多的设置微柱4。 0017 进一步的， 所述微柱4。

12、的横截面为矩形或椭圆形。 0018 进一步的， 所述模具为上端开口的长方体或者圆柱状体。 0019 进一步的， 所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧。 0020 进一步的， 所述第一凹槽2的高度为3-7mm。 在该高度范围内， 第一凹槽可以提供适 合的培养基储存空间， 且有利于制备本模具时的脱模。 0021 进一步的， 所述第一凹槽2的底部宽度为2-4mm。 该宽度有利于制备本模具时的脱 模。 0022 进一步的， 所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部。 0023 进一步的， 所述第二凹槽3的高度为2-6mm， 即所述第二凹槽3的高度相同或略高于 微柱4的高度。 0024 更进一步的， 在一些。

13、实施方式中， 所述外壁1的长度为20-100mm； 宽度为20-100mm； 高度为10-18mm， 形成上端开口的长方体。 0025 更进一步的， 在一些实施方式中， 所述第一凹槽2的长度为16-92mm； 宽度为16- 92mm； 高度为3-7mm； 底部宽度均为2-4mm。 0026 更进一步的， 在一些实施方式中， 所述第二凹槽3的长度为10-84mm； 宽度为10- 84mm； 高度为2-6mm。 0027 该模具还可以在保持微柱4的尺寸和排列方式、 第一凹槽2、 第二凹槽3的高度在本 申请限定的范围内的同时， 调整模具外壁1、 第一凹槽2、 第二凹槽3的长度、 宽度， 从而实现 在。

14、体外生产出一种较大的用于食用的肌肉组织， 生产出符合未来工业生产大小的培养肉产 品。 0028 本实用新型技术方案所实现的有益效果为： 0029 本申请设计的规律排布微柱阵列的多孔网状培养肉生产模具， 充分了考虑培养肉 说明书 2/6 页 4 CN 211394496 U 4 的体外培养过程中， 含肌源性细胞的混合溶液形成水凝胶肌肉组织以及水凝胶肌肉组织压 实过程中的力学变化， 使水凝胶肌肉组织能在不同柱子之间收缩形成肌肉束， 微柱周围由 于肌肉束形成的收缩空间可以增强营养物质向细胞的扩散， 并通过控制机械张力的空间格 局来引导局部的三维细胞排列， 促进分化过程。 该模具还可以在保持微柱的尺寸。

15、和排列方 式、 第一凹槽、 第二凹槽的高度在本申请限定的范围内的同时， 调整模具外壁、 第一凹槽、 第 二凹槽的长和宽的尺寸， 可进行适当扩大， 从而实现在体外生产出较大的、 符合未来工业生 产大小的培养肉产品。 附图说明 0030 图1为本实用新型的培养肉生产模具的结构示意图。 0031 图2网状肌肉组织在培养肉生产模具中的生长情况。 0032 图中： 1外壁、 2第一凹槽、 3第二凹槽、 4微柱。 具体实施方式 0033 下面结合附图和具体实施例， 进一步阐明本实用新型， 应理解这些实施例仅用于 说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围， 在阅读了本实用新型之后， 本领域技术 人员对本实。

16、用新型的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。 0034 在本实用新型的描述中，“若干” 的含义是两个或两个以上， 除非另有明确具体的 限定。 0035 实施例1 0036 一种多孔的网状培养肉生产模具， 所述模具为上端开口的长方体， 包括外壁1、 第 一凹槽2、 第二凹槽3、 微柱4； 0037 所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状， 由上而下的第一级为第一凹槽2的底 部， 第二级为第二凹槽3的底部。 0038 所述外壁1的长度为25mm； 宽度为25mm； 高度为12mm， 形成上端开口的长方体。 0039 所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧， 第一凹槽2的长度为20mm。

17、； 宽度为20mm； 高 度为5mm。 所述第一凹槽2的底边宽度为2mm。 0040 所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部； 第二凹槽3的长度为16mm； 宽度为 16mm； 高度为3mm， 第二凹槽3的底部厚度为4mm。 0041 所述第二凹槽3底部竖直设置25个微柱4； 所述微柱4的长度为2mm， 宽度为1mm， 高 度为3mm； 所述微柱的横截面为矩形， 25个微柱4规律排布为微柱阵列； 0042 所述微柱4的排列方式为错位间隔排列， 所述微柱阵列为7行， 各行微柱分别以4 个-3个-4个依次排列， 相邻行的微柱4之间间隔1mm， 相邻行的微柱4平行偏移1mm， 每行中的 各微柱4之间。

18、间隔1.5mm(图1)。 0043 实施例2 0044 一种多孔的网状培养肉生产模具， 所述模具为上端开口的长方体， 包括外壁1、 第 一凹槽2、 第二凹槽3、 微柱4； 0045 所述外壁1的长度为30mm； 宽度为30mm； 高度为15mm， 形成上端开口的长方体。 0046 所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状， 由上而下的第一级为第一凹槽2的底 说明书 3/6 页 5 CN 211394496 U 5 部， 第二级为第二凹槽3的底部。 0047 所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧， 第一凹槽2的长度为26mm； 宽度为26mm； 高 度为6mm。 所述第一凹槽2的底边宽度为4mm。 0。

19、048 所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部； 第二凹槽3的长度为18mm； 宽度为 18mm； 高度为4mm， 第二凹槽3的底部厚度为5mm。 0049 所述第二凹槽3底部竖直设置18个微柱4； 所述微柱4的长度为3mm， 宽度为1.5mm， 高度为4mm； 所述微柱的横截面为矩形； 18个微柱4规律排布为微柱阵列； 0050 所述微柱4的排列方式为错位间隔排列， 所述微柱阵列为5行， 各行微柱分别以4 个-3个-4个依次排列， 相邻行的微柱4之间间隔1.5mm， 相邻行的微柱4平行偏移2mm， 每行中 的各微柱4之间间隔1mm。 0051 实施例3 0052 一种多孔的网状培养肉生产模具。

20、， 所述模具为上端开口的长方体， 包括外壁1、 第 一凹槽2、 第二凹槽3、 微柱4； 0053 所述外壁1的长度为20mm； 宽度为20mm； 高度为10mm， 形成上端开口的长方体。 0054 所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状， 由上而下的第一级为第一凹槽2的底 部， 第二级为第二凹槽3的底部。 0055 所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧， 第一凹槽2的长度为16mm； 宽度为16mm； 高 度为3mm。 所述第一凹槽2的底边宽度为3mm。 0056 所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部； 第二凹槽3的长度为10mm； 宽度为 10mm； 高度为3mm， 第二凹槽3的底部厚度为4m。

21、m。 0057 所述第二凹槽3底部竖直设置18个微柱4； 所述微柱4的长度为1 .5mm， 宽度为 0.5mm， 高度为2mm； 所述微柱的横截面为矩形； 18个微柱4规律排布为微柱阵列； 0058 所述微柱4的排列方式为错位间隔排列， 所述微柱阵列为5行， 各行微柱分别以4 个-3个-4个依次排列， 相邻行的微柱4之间间隔1mm， 相邻行的微柱4平行偏移1mm， 每行中的 各微柱4之间间隔0.5mm。 0059 实施例4 0060 除微柱4横截面为椭圆形外， 本实施例模具与实施例1的模具均相同。 0061 实施例5 0062 一种多孔的网状培养肉生产模具， 所述模具为上端开口的长方体， 包括。

22、外壁1、 第 一凹槽2、 第二凹槽3、 微柱4； 0063 所述外壁1的长度为100mm； 宽度为100mm； 高度为18mm， 形成上端开口的长方体。 0064 所述外壁1纵向截面为向下的二级阶梯状， 由上而下的第一级为第一凹槽2的底 部， 第二级为第二凹槽3的底部。 0065 所述第一凹槽2居中设置在外壁1内侧， 第一凹槽2的长度为92mm； 宽度为92mm； 高 度为7mm。 所述第一凹槽2的底边宽度为4mm。 0066 所述第二凹槽3居中设置在第一凹槽2底部； 第二凹槽3的长度为84mm； 宽度为 84mm； 高度为6mm， 第二凹槽3的底部厚度为5mm。 0067 所述第二凹槽3底部。

23、竖直设置250个微柱4； 所述微柱4的长度为4mm， 宽度为1.5mm， 高度为5mm； 所述微柱的横截面为矩形； 250个微柱4规律排布为微柱阵列； 说明书 4/6 页 6 CN 211394496 U 6 0068 所述微柱4的排列方式为错位间隔排列， 所述微柱阵列为20行， 各行微柱分别以13 个-12个-13个依次排列， 相邻行的微柱4之间间隔2.5mm， 相邻行的微柱4平行偏移3mm， 每行 中的各微柱4之间间隔2mm。 0069 实施例6利用阳模制作培养肉生产模具 0070 1)利用三维绘图软件构建具有规律排布柱状凹槽的阳模的三维CAD模型， 基于细 化STL模型方法对模型进行数据。

24、处理； 设计出用于制造本发明培养肉生产模具的阳模， 阳模 的纵向截面为三阶梯结构， 由下而上的第一层阶梯用于形成本发明模具的外壁1， 第二层阶 梯用于形成本发明模具的第一凹槽2， 第三层阶梯用于形成第二凹槽3和微柱4。 阳模的第二 层阶梯的高度为3-7mm， 所述第三层阶梯的高度为2-6mm， 第三层阶梯设置若干个柱状凹槽 (用于微柱4生产)， 柱状凹槽的排列方式为错位间隔排列， 相邻行的柱状凹槽平行偏移1- 4mm， 柱状凹槽的长宽高为(1-5)(0.5-1.5)(1-5)mm， 相邻行的柱状凹槽之间间隔1- 3mm， 每行中的各柱状凹槽之间间隔0.5-3mm， 其余长宽尺寸可根据所需制备的。

25、多孔网状培 养肉生产模具相应调整。 0071 2)利用切片软件将得到的STL模型文件进行分层切片处理， 得到打印机的运动控 制Gcode代码文件； 0072 3)将Gcode代码文件导入FDM打印机， 在打印机上执行加工指令， 挤出PLA或ABS等 热塑性塑料丝材， 逐点累积成型形成各种尺寸的用于制作培养肉生产模具的阳模结构。 0073 4)称量道康宁Sylgard 184硅橡胶PDMS的A液和B液， 按质量比为10:1混合。 将充分 混合的PDMS(聚二甲基硅氧烷)小心的倒入并装满阳模中。 将PDMS和阳模置于真空脱气机 中， 脱气的时间为1-16h。 同时将PDMS和阳模置于25凝固24h。

26、。 之后用手术刀片切割PDMS与 阳模的接触部分， 用称量勺的另一端延模具的四周撬动PDMS和阳模， 通过对PDMS和阳模四 周的挤压可以将培养肉生产模具及其规律排列的微柱较为完整的取出， 柱子取出时断裂的 数目比例为0-20， 微柱剩余数目为90以上才能用于后续培养肉的生产。 取出的模具 即为本申请的培养肉生产模具。 0074 将模具经清洗后121灭菌15min， 取出后烘干。 将灭菌后的PDMS模具在0.2(质 量体积比)的Pluronic F-127溶液中浸泡1小时， 以防止水凝胶附着在PDMS模具上。 之后取 出PDMS模具， 用PBS清洗3遍晾干待用。 0075 实施例7网状肌肉组织。

27、在培养肉生产模具中生长情况。 0076 (1)取I型胶原(浓度为3.35-3.73mg/ml)， 与含酚红的DMEM培养基， 1M NaOH以及基 质胶混匀制成混合溶液。 胶原、 含酚红的DMEM培养基、 NaOH溶液、 基质胶的体积比为50:40: 1.5:8， 混合溶液的pH为7.3-7.5。 本实施例中胶原、 含酚红的DMEM培养基、 NaOH溶液、 基质胶 的具体添加量分别为500ul、 400ul、 15ul、 8ul。 0077 (2)将成肌细胞系C2C12(来源： ATCC， 美国菌种保藏中心)与混合溶液一起混匀， 得 到含细胞的混合溶液， 含细胞的混合溶液中， 成肌细胞系C2C。

28、12的密度为1x105个/ml-1x107 个/ml。 0078 (3)将含细胞的混合溶液缓慢添加到实施例1制备的培养肉生产模具中， 含细胞的 混合溶液的添加量不高于所述模具的微柱4的高度， 轻轻震荡， 以除去气泡。 0079 将装有混合溶液的培养肉生产模具置于37， 5CO2培养箱中培养2h以形成水凝 胶肌肉组织。 之后加入2.5ml生长培养基， 以加满整个培养肉生产模具。 所述生长培养基为 说明书 5/6 页 7 CN 211394496 U 7 包括79volF-10、 20vol胎牛血清、 1vol青霉素-链霉素双抗的培养基， 1-10ng/ml成纤 维细胞生长因子2。 水凝胶肌肉组织。

29、在培养1-3天之后， 将生长培养基换液成2.5ml分化培养 基， 以加满整个培养肉生产模具。 所述的分化培养基为包括97volDMEM培养基、 2vol马 血清、 1vol青霉素-链霉素双抗。 生长5-7天后获得网状肌肉组织(图2)。 0080 实验结果显示， 通过本实施例获得的网状肌肉大小约为长12mm， 宽12mm， 厚度为 0.1-0.3mm， 单个网状肌肉的重量约为0.12-0.15g， 利用鬼笔环肽(Phalloidin)染色发现网 状肌肉组织中也出现了较长的肌管样的结构， 所得到的网状肌肉组织可以作为培养肉的原 料来源。 0081 实施例8 0082 除将生产模具替换为实施例5制备。

30、的培养肉生产模具， 并等比例调整混合溶液、 细 胞和培养基用量外， 其他实验方法与实施例7相同。 0083 结果显示： 通过该实施例可以获得网状肌肉的大小约为长80mm， 宽80mm， 厚度为 0.2-0.5mm。 单个网状肌肉的重量约为3.2g， 利用鬼笔环肽(Phalloidin)染色发现网状肌肉 组织中也出现了较长的肌管样的结构， 所得到的网状肌肉组织可以作为培养肉的原料来 源。 0084 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。 应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员来 说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护 范围。 因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说明书 6/6 页 8 CN 211394496 U 8 图1 图2 说明书附图 1/1 页 9 CN 211394496 U 9 。