低分子量黑莓多糖及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910268825.4 (22)申请日 2019.04.04 (71)申请人 珠海中美普莱健康科技有限公司 地址 519055 广东省珠海市斗门区珠峰大 道西6号310室 申请人 华南理工大学珠海现代产业创新研 究院 (72)发明人 扶雄窦祖满陈春 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 向玉芳 (51)Int.Cl. C08B 37/00(2006.01) A61P 39/06(2006.01) A61P 43/00(2006.01) 。

2、(54)发明名称 一种低分子量黑莓多糖及其制备方法 (57)摘要 本发明公开了一种低分子量黑莓多糖及其 制备方法。 低分子量黑莓多糖的重均分子量为 18-59万Da ； 在溶液中的颗粒粒径为400 1000nm， 分散指数为0.180.29； 由阿拉伯糖、 半 乳糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸组成， 且 其重量百分占比分别为： 9.811 .2、 3.1 3.6、 2.73.3、 81.983.5以及0.40 0.42； 对ABTS自由基清除活性IC50值为1.47 1.62mg/mL， 对-葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为 1.111.59mg/mL。 本发明采用水提醇沉法联合 超声。

3、降解法得到低分子量黑莓多糖， 该低分子量 多糖兼具优异的抗氧化和降血糖活性。 权利要求书2页 说明书9页 附图2页 CN 110066349 A 2019.07.30 CN 110066349 A 1.一种低分子量黑莓多糖， 其特征在于， 所述低分子量黑莓多糖的重均分子量为18-59 万Da； 所述低分子量黑莓多糖在溶液中的颗粒粒径为4001000nm， 分散指数为0.180.29； 所述低分子量黑莓多糖由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸组成， 且 其重量百分占比分别为： 9.811.2、 3.13.6、 2.73.3、 81.983.5以及0.40 0.42； 所述低。

4、分子量黑莓多糖兼具抗氧化活性和降血糖活性， 其中对ABTS自由基清除活性 IC50值为1.471.62mg/mL， 对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为1.111.59mg/mL。 2.一种如权利要求1所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： (1)前处理： 将黑莓鲜果洗净， 烘干， 冷却后超微粉碎， 过目筛， 得到黑莓粉， 备用； (2)脱脂： 向步骤(1)处理后的黑莓粉中加入乙醇， 在7090下加热24h， 离心后过 滤， 收集滤渣将其在4560烘干， 备用； (3)热水提取： 向步骤(2)脱脂后的黑莓滤渣中加入3040倍黑莓滤渣质量的去离子 水， 在8595水浴中加热。

5、并搅拌24h， 离心后过滤， 收集滤液； (4)脱蛋白： 将步骤(3)中的上清液浓缩， 添加Sevag试剂， 振荡后离心， 收集上清液， 再 经Sevag法脱蛋白， 重复此步骤912次； (5)脱色： 将步骤(4)中的脱蛋白提取液旋转蒸发除去多余的Sevag试剂， 并向其中加入 1618倍脱蛋白后提取液质量的AB-8大孔树脂， 振荡过滤后收集滤液； (6)乙醇沉淀： 向步骤(5)中脱色后的提取液中加入无水乙醇， 使其质量浓度最终为 8090， 在04下静置1224h； 离心后收集沉淀； (7)超声处理： 将步骤(6)中的沉淀物溶解在去离子水中， 在超声功率为250300w， 超 声温度7090。

6、下超声处理824h； (8)透析： 将步骤(7)中超声处理后的多糖溶液透析袋下透析2448h； (9)将步骤(8)中透析后的多糖溶液在-55-80下进行冷冻干燥， 得到黑莓多糖。 3.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(1)中所述 的烘干温度为4560； 干燥1224h； 过筛目数为60100目。 4.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(2)中所述 的乙醇加入量为黑莓粉质量的35倍； 烘干的温度为5055。 5.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中所述 去离子水的质量加入量为黑莓粉滤渣量。

7、的3540倍； 搅拌2.53.5h； 步骤(3)中所述的离 心为4500g离心10min。 6.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中振荡 是在200300r/min下振荡2030min。 7.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(5)中振荡 的速度为200300r/min， 振荡的时间为812h。 8.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(6)中乙醇 的质量浓度为8085； 步骤(6)中所述的离心是40004500g离心58min。 9.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特。

8、征在于， 步骤(7)中所述 在超声处理时间为1015h； 所述超声处理温度为7585。 权利要求书 1/2 页 2 CN 110066349 A 2 10.根据权利要求2所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 其特征在于， 步骤(8)中所述 透析袋的大小为30003500Da。 权利要求书 2/2 页 3 CN 110066349 A 3 一种低分子量黑莓多糖及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种多糖， 具体涉及一种低分子量黑莓多糖及其制备方法； 属于黑莓 提取物技术领域。 背景技术 0002 糖尿病作为一种慢性代谢疾病， 能够影响到多种器官病变， 如： 肾脏、 眼睛和神经。 据世界卫生。

9、组织报道， 糖尿病引起的致死率在2030年将达到世界第七位。 参与糖代谢的酶 通常被用作新的抗糖尿病药物开发的治疗靶点。 其中最有效的方法是通过抑制 -葡萄糖苷 酶活性来减缓葡萄糖的形成， 从而降低对葡萄糖的吸收， 达到控制餐后血糖的目的。 0003 目前， 临床上使用的阿卡波糖、 米格列醇等降血糖药物均是通过短时间内抑制 - 葡萄糖苷酶活性来控制血糖， 但长期服用会带来一定的副作用， 如： 低血糖、 肠胃气胀、 腹泻 等。 同时， 大量研究证明体内氧化应激是糖尿病形成的一个重要原因。 因此， 兼具抗氧化应 激和抑制 -葡萄糖苷酶的天然活性物质对控制餐后血糖及糖尿病的辅助治疗具有极大的 促进作。

10、用。 0004 近年来， 人们对植物多糖的功能活性有较深入的研究， 发现多糖的结构对其生物 活性具有重要的影响， 如自然界中存在多糖由于结构和理化性质障碍不利于其生物活性的 发挥， 或者一些从天然植物中分离纯化得到的多糖分子量大、 活性较弱。 发明内容 0005 本发明要解决的问题在于克服现有技术制备黑莓多糖的缺陷， 提供一种未破坏黑 莓多糖的基本结构， 低分子量， 同时兼具优异的抗氧化和 -葡萄糖苷酶抑制活性的黑莓多 糖及其制备方法。 0006 黑莓， 也称树莓、 露莓， 是蔷薇科悬钩子属多年生藤本植物的果实。 黑莓作为一种 药食同源水果， 对其生物活性的研究日益增多。 发明人发现黑莓多糖具。

11、有显著的抗氧化和 降血糖活性， 且黑莓多糖的分子量比较均一， 通过本发明的制备方法黑莓多糖的单元结构 没有破坏。 因此， 制备一种具有抗氧化和降血糖活性的黑莓多糖， 更有利于黑莓水果整体利 用价值的开发。 0007 本发明的目的通过如下技术方案实现： 0008 一种低分子量黑莓多糖， 重均分子量为18-59万Da； 0009 所述低分子量黑莓多糖在溶液中的颗粒粒径为4001000nm， 分散指数为0.18 0.29； 0010 所述低分子量黑莓多糖由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸组 成， 且其重量百分占比分别为： 9.811.2、 3.13.6、 2.73.3、 81。

12、.983.5以及 0.400.42； 0011 所述低分子量黑莓多糖兼具抗氧化活性和降血糖活性， 其中对ABTS自由基清除活 性IC50值为1.471.62mg/mL， 对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为1.111.59mg/mL。 说明书 1/9 页 4 CN 110066349 A 4 0012 一种所述的低分子量黑莓多糖的制备方法， 包括以下步骤： 0013 (1)前处理： 将黑莓鲜果洗净， 烘干， 冷却后超微粉碎， 过目筛， 得到黑莓粉， 备用； 0014 (2)脱脂： 向步骤(1)处理后的黑莓粉中加入乙醇， 在7090下加热24h， 离心 后过滤， 收集滤渣将其在4560烘干， 备。

13、用； 0015 (3)热水提取： 向步骤(2)脱脂后的黑莓滤渣中加入3040倍黑莓滤渣质量的去离 子水， 在8595水浴中加热并搅拌24h， 离心后过滤， 收集滤液； 0016 (4)脱蛋白： 将步骤(3)中的上清液浓缩， 添加Sevag试剂， 振荡后离心， 收集上清 液， 再经Sevag法脱蛋白， 重复此步骤912次； 0017 (5)脱色： 将步骤(4)中的脱蛋白提取液旋转蒸发除去多余的Sevag试剂， 并向其中 加入1618倍脱蛋白后提取液质量的AB-8大孔树脂， 振荡过滤后收集滤液； 0018 (6)乙醇沉淀： 向步骤(5)中脱色后的提取液中加入无水乙醇， 使其质量浓度最终 为8090。

14、， 在04下静置1224h； 离心后收集沉淀； 0019 (7)超声处理： 将步骤(6)中的沉淀物溶解在去离子水中， 在超声功率为250 300w， 超声温度7090下超声处理824h； 0020 (8)透析： 将步骤(7)中超声处理后的多糖溶液透析袋下透析2448h； 0021 (9)将步骤(8)中透析后的多糖溶液在-55-80下进行冷冻干燥， 得到黑莓多 糖。 0022 为进一步实现本发明目的， 优选的， 步骤(1)中所述的烘干温度为5055； 干燥 1224h； 过筛目数为60100目。 0023 优选的， 步骤(2)中所述的乙醇加入量为黑莓粉质量的35倍； 烘干温度为4560 。 00。

15、24 优选的， ， 步骤(3)中所述去离子水的质量加入量为黑莓粉滤渣量的3540倍； 搅 拌2.53.5h； 步骤(3)中所述的离心为4500g离心10min。 0025 优选的， 步骤(4)中振荡是在200300r/min下振荡2030min。 0026 优选的， 步骤(5)中振荡的速度为200300r/min， 振荡的时间为812h。 0027 优选的， 步骤(6)中乙醇的质量浓度为8085； 步骤(6)中所述的离心是4000 4500g， 离心58min。 0028 优选的， 步骤(7)中所述在超声处理时间为1015h； 所述超声处理温度为7585 。 0029 优选的， 步骤(8)中所。

16、述透析袋的大小为30003500Da。 0030 相对于现有技术， 本发明的优点在于： 0031 (1)本发明制备的黑莓多糖重均分子量在18万Da到59万Da之间； 所述低分子量黑 莓多糖在溶液中的颗粒粒径在4001000nm之间， 分散指数在0.180.29之间； 所述低分子 量黑莓多糖由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸组成， 且其重量百分比分 别为： 9.811.2、 3.13.6、 2.73.3、 81.983.5以及0.400.42之间； 同时 兼具抗氧化活性和降血糖活性； 0032 (2)本发明制备方法所用试剂绿色环保、 设备简单、 成本低廉， 操作容易， 对。

17、中小型 企业工业化生产极其有利。 0033 (3)本发明制备方法相比于酶法和化学法， 本发明方法耗费低且绿色环保高效； 相 说明书 2/9 页 5 CN 110066349 A 5 比于其它物理法如微波法和辐射法， 本发明所需装置设备更为简单且操作容易， 同时降解 过程中不破坏多糖的单元结构， 保留多糖的生物活性。 0034 (4)本发明制备的低分子量的黑莓活性多糖， ABTS自由基清除活性IC50在1.47 1.62mg/mL之间， 对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50在1.111.59mg/mL之间。 附图说明 0035 图1为本发明实施例1、 2、 3所述制备条件下的黑莓多糖在不同NaOH浓。

18、度溶液中的 螺旋-卷曲转变分析。 0036 图2为本发明实施例1、 2、 3所述制备条件下黑莓多糖对ABTS自由基清除活性半抑 制浓度IC50值。 0037 图3为本发明实施例1、 2、 3所述制备条件下黑莓多糖对 -葡萄糖苷酶抑制活性半 抑制浓度IC50值。 具体实施方式 0038 为了更好的理解本发明， 下面结合实施例进一步说明本发明， 但本发明的保护范 围并不仅局限于实施列表述的范围。 0039 检测方法 0040 (1)多糖含量的测定 0041 采用苯酚-硫酸法测定样品中糖含量： 精确称量105烘干至恒重的葡萄糖10mg， 溶于去离子水， 用容量瓶定容至100mL， 配成100ug/m。

19、L的葡萄糖标准液， 分别移取0、 0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1mL葡萄糖标准液并用去离子水补水至1mL， 然后加入5苯酚0.5mL及浓硫酸 2.5mL， 充分混匀后， 避光静置20min， 用酶标仪在490nm处测定其吸光值A490。 以葡萄糖浓度 为横坐标， 以A490为纵坐标， 绘制标准曲线。 精确称取适量多糖样品， 配成100ug/mL多糖溶 液， 准确吸取1mL多糖溶液， 按上述操作步骤测定吸光值， 用标准曲线计算多糖样品中的糖 含量。 0042 (2)还原糖含量测定 0043 采用DNS法测定多糖样品中还原糖含量： 精确称量105烘干至恒重的葡萄糖 10mg， 配成1m。

20、g/mL的葡萄糖标准液， 分别移取0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mL葡萄糖标准液并用 去离子水补水至0.5mL， 然后加入1mL DNS试剂(提前一周配置好)， 充分混匀后， 煮沸5min， 冷却至室温后加去离子水至5ml， 用酶标仪在540nm下测定其吸光值A540。 以葡萄糖浓度为横 坐标， 以A540为纵坐标， 绘制标准曲线。 精确称取适量多糖样品， 配成1mg/mL多糖溶液， 准确 吸取0.5mL多糖溶液， 按上述操作步骤测定吸光值， 用标准曲线计算多糖样品中的糖含量。 0044 (3)蛋白质含量测定 0045 采用考马斯亮蓝法测定多糖样品中蛋白质含量。 精确称量。

21、牛血清蛋白5mg， 配成 50ug/mL标准蛋白溶液， 分别移取0、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5mL蛋白标准液并用去离子水补水 至0.5mL， 然后加入2.5mL考马斯亮蓝溶液， 充分混匀后， 避光反应10min， 在595nm处测定其 吸光值A595。 以蛋白质浓度为横坐标， 以A595为纵坐标， 绘制标准曲线。 精确称取适量多糖样 品， 配成2mg/mL多糖溶液， 准确吸取0.5mL多糖溶液， 按上述操作步骤测定吸光值， 用标准曲 线计算多糖样品中的蛋白含量。 说明书 3/9 页 6 CN 110066349 A 6 0046 (4)分子量分布 0047 采用高效液相色。

22、谱仪测定样品的分子量分布及均一性。 称取2mg多糖样品溶解在 2mL的磷酸二氢钾缓冲液(0.02M)中， 过0.22 m的水膜， 进行分析。 标准曲线采用普鲁兰标准 品(分子量分别为642000、 337000、 194000、 21100、 9600、 6100Da)。 液相工作条件： 色谱柱为 TSK-gel G5000PWXL(7.8300mm I.D.,10 m)和TSK-gel G3000PWXL(7.8300mm I.D.,7 m)凝胶柱串联使用； 检测器： Agilent 1260示差检测器； 流动相： 0.02M磷酸二氢钾缓冲液 (pH6.0)； 柱温： 350.1； 检测器温。

23、度： 450.1； 流速： 0.6mL/min； 进样量： 20 L。 0048 (5)单糖组成及糖醛酸含量测定 0049 采用离子色谱(IC)检测多糖样品中的单糖和糖醛酸组成。 水解样品： 用5mL 2mol/ L的三氟乙酸(TFA)试剂将10mg样品充分溶解， 然后转移到10mL安瓿管中， 用酒精喷灯将安 瓿瓶的瓶口密封后， 于105-110的干燥箱内反应6h。 水解完成后敲碎安瓿管口， 将样品倒 入旋蒸瓶中， 50下旋蒸除去过量的TFA， 往旋蒸瓶中加入4mL色谱纯甲醇， 溶解后， 减压浓 缩至完全干燥， 重复操作五次。 最后用超纯水溶解残渣， 并定容至100mL。 取1mL样品溶液透 。

24、过0.22 m水膜， 注入液相瓶中， 进行IC检测， 根据标准曲线计算出样品中单糖和糖醛酸的组 成。 标准曲线采用单糖及糖醛酸标准品绘制(岩藻糖、 阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 木糖、 果 糖、 甘露糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖醛酸)。 离子色谱工作条件为： 色谱柱： CarboPacTM PA20分析 柱、 CarboPacTM PA1保护柱； 检测器： 脉冲安培检测器(PAD)； 柱温： 30； 进量样： 10 L； 流动 相： A液为超纯水， B液为200mM NaOH溶液， C液为500mM CH3COONa溶液， D液为20mM NaOH溶 液； 流速： 0.5mL/min； 洗脱程。

25、序： B液(0-2min)， 90的A液与10的D液(3-20min)， B液(20- 30min)。 0050 (6)粒径及分散性指数测定 0051 多糖溶液中颗粒的平均粒径及分散性指数采用动态光衍射(DLS)技术测定。 将多 糖样品配成0.5mg/mL的溶液， 然后用Malvern Nano ZS仪器分析： He-Ne(633nm)作为激光 器、 散射角为173 、 测试温度为25。 0052 (7)红外光谱分析 0053 称取3mg的多糖样品经过KBr压片， 采用傅里叶红外光谱仪在400-4000cm-1波数范 围内进行扫描得到扫描图谱。 0054 (8)三股螺旋结构测定 0055 采用。

26、刚果红试剂法对黑莓多糖的三股螺旋结构进行鉴定。 将多糖用蒸馏水配制成 1mg/ml的溶液， 同时配制刚果红试剂(100 M)， 等体积充分混匀多糖溶液与刚果红试剂， 用 NaOH溶液(4M)调节混合液的NaOH浓度在0-0.5M范围。 在200-600nm波长范围内， 进行光谱扫 描， 测定不同NaOH浓度样品最大吸收波长， 且以具有三股螺旋结构的凝胶多糖(curdlan)作 为对照。 0056 (9)ABTS自由基清除活性测定 0057 ABTS溶液配置： 7mM ABTS溶液和2.45mM K2S2O8按1:1的比例配置， 避光反应12h后 生成。 用ABTS+工作液配置： ABTS溶液加。

27、水稀释到在732nm波长下吸光度为0.700.02。 在96 孔酶标板中加入30 L多糖样品溶液和225 LABTS+工作液， 振荡混匀， 避光反应30min， 用酶 标仪于732nm波长下测定吸光度A732。 去离子水作空白对照， 维生素C(Vc)作阳性对照。 ABTS 自由基清除率计算公式如下： 说明书 4/9 页 7 CN 110066349 A 7 0058 ABTS自由基清除率()1-(A0-A1)/A2100 0059 其中， A0表示30 L样品溶液与225 L ABTS+工作液混合反应后的吸光值； A1表示30 L样品溶液与225 L去离子水混合的吸光值； A2表示30 L去离。

28、子水与225 L ABTS+工作液混 合的吸光值。 0060 (10) -葡萄糖苷酶抑制活性 0061 在96孔酶标板中分别添加50 L不同浓度的多糖溶液、 50 L -葡萄糖苷酶(0.25U/ mL)， 振荡混匀， 37孵育6min， 继续加入100 L 4-硝基酚-a-D呋喃葡萄糖苷(pNPG， 5mM)， 孵 育10min。 最后， 加入1mL的0.2M的Na2CO3溶液终止反应。 用酶标仪检测反应液在405nm处的吸 光值A405。 去离子水作为空白对照， 阿卡波糖作为阳性对照。 计算公式如下： 0062 抑制率()1-(AsampleAblank)/Acontrol100 0063 。

29、式中： Acontrol为没有多糖样品， 只添加 -葡萄糖苷酶的吸光度； Asample表示添 加多糖溶液和 -葡萄糖苷酶的吸光度； Ablank表示有多糖溶液， 没有 -葡萄糖苷酶的吸光 度。 0064 实施例1 0065 一种低分子量黑莓多糖的制备方法， 包括以下步骤： 选取黑莓鲜果， 清洗干净后， 在45下烘干24h， 粉碎后过60目筛， 得到黑莓粉。 0066 精确称取50g黑莓粉， 加入3倍黑莓粉质量的95(体积百分比)乙醇， 在75条件 下， 加热并搅拌4h， 离心后过滤， 将滤渣在45条件下烘干24h。 0067 向烘干的黑莓滤渣中加入30倍黑莓滤渣质量的去离子水， 在85条件下。

30、加入并搅 拌4h， 5000g离心10min后收集滤液， 重复操作2次， 合并两次滤液并减压浓缩至200ml， 加入 1/4浓缩液体积的Sevag试剂(正丁醇： 氯仿1:4， v/v)， 200r/min下振荡20min， 5000g离心 10min后收集上清液， 再经Sevag法脱蛋白， 重复12次。 0068 将脱蛋白后的提取液旋转蒸发除去多余的Sevag试剂， 并向其中加入16倍脱蛋白 后提取液质量的AB-8大孔树脂， 在200r/min下振荡8h， 过滤后收集滤液。 0069 加入无水乙醇使溶液中乙醇最终的质量浓度为80， 在4下静置24h， 离心并收 集沉淀。 0070 用去离子水溶。

31、解沉淀物， 在3000Da的透析袋下透析48h， 将透析液在-55下冷冻 干燥， 得到黑莓多糖， 记录为BBP。 0071 实施例2 0072 一种低分子量黑莓多糖的制备方法， 包括以下步骤： 选取黑莓鲜果， 清洗干净后， 在45下烘干12h， 粉碎后过60目筛， 得到黑莓粉。 精确称取50g黑莓粉， 加入3倍黑莓粉质量 的95(体积白分比)乙醇， 在75条件下， 加热并搅拌4h， 离心后过滤， 将滤渣在45条件 下烘干12h。 向烘干的黑莓滤渣中加入30倍黑莓滤渣质量的去离子水， 在85条件下加入并 搅拌2h， 5000g离心10min后收集滤液， 重复操作2次， 合并两次滤液并减压浓缩至2。

32、00ml， 加 入1/4浓缩液体积的Sevag试剂(正丁醇： 氯仿1:4， v/v)， 200r/min下振荡20min， 离心 10min后收集上清液， 再经Sevag法脱蛋白， 重复12次。 将脱蛋白后的提取液旋转蒸发除去多 余的Sevag试剂， 并向其中加入17倍脱蛋白后提取液质量的AB-8大孔树脂， 在200r/min下振 荡8h， 过滤后收集滤液。 加入无水乙醇使溶液中乙醇最终的质量浓度为80， 在4下静置 24h， 4000g离心5min后收集沉淀。 用去离子水溶解沉淀物， 在超声功率为150w， 超声温度为 说明书 5/9 页 8 CN 110066349 A 8 70条件下超声。

33、处理12h， 然后经3000Da的透析袋下透析24h， 将透析液在-55下冷冻干 燥， 得到黑莓多糖， 记录为BBP-12 0073 实施例3 0074 一种低分子量黑莓多糖的制备方法， 包括以下步骤： 选取黑莓鲜果， 清洗干净后， 在60下烘干24h， 粉碎后过100目筛， 得到黑莓粉。 精确称取50g黑莓粉， 加入4倍黑莓粉质 量的95乙醇， 在75条件下， 加热并搅拌4h， 离心后过滤， 将滤渣在60条件下烘干24h。 向烘干的黑莓滤渣中加入40倍黑莓滤渣质量的去离子水， 在85条件下加入并搅拌4h， 离 心后收集滤液， 重复操作2次， 合并两次滤液并减压浓缩至200ml， 加入1/4浓。

34、缩液体积的 Sevag试剂(正丁醇： 氯仿1:4， v/v)， 200r/min下振荡20min， 5000g离心10min后收集上清 液， 再经Sevag法脱蛋白， 重复12次。 将脱蛋白后的提取液旋转蒸发除去多余的Sevag试剂， 并向其中加入18倍脱蛋白后提取液质量的AB-8大孔树脂， 在300r/min下振荡12h， 过滤后收 集滤液。 加入无水乙醇使溶液中乙醇最终的质量浓度为85， 在4下静置24h， 5000g离心 10min后收集沉淀。 用去离子水溶解沉淀物， 在超声功率为300w， 超声温度为90条件下超 声处理24h， 然后经3500Da的透析袋下透析48h， 将透析液在-8。

35、0下冷冻干燥， 得到黑莓多 糖， 记录为BBP-24。 0075 对实施例1、 2、 3所述中不同制备方式下的黑莓多糖BBP、 BBP-12、 BBP-24根据本具 体实施方式界定的测试方法进行多糖得率测定、 总糖含量测定、 还原糖含量测定、 蛋白质含 量测定、 分子量分布测定、 粒径及分散性测定、 抗氧化活性和 -葡萄糖苷酶抑制活性分析。 0076 通过检测， 不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12和BBP-24总糖含量分别为56 0.56、 550.31和56.480.88； 还原糖含量分别为2.970.32、 3.540.41及 4.120.57； 蛋白质含量分别为1.770.0。

36、4、 1.760.05和1.860.04； 其中实施 例1、 实施列2和实施列3之间总糖含量以及蛋白质含量无显著差异； 但实施例1至实施例3制 备的多糖中， 还原糖含量呈上升趋势。 0077 对实施例1、 实施例2、 实施例3不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12、 BBP-24的 分子量分析结果如下： 多糖BBP的出峰时间在21.249min处， 根据标准曲线计算其分子量大 小为5.91105Da； 多糖BBP-12的出峰时间在22.272min处， 根据标准曲线计算其分子量大 小为3.26105Da； BBP-24的出峰时间在23.447min处， 根据标准曲线计算其分子量大小为 。

37、1.77105Da， 实施例1至实施例3制备的多糖， 分子量依次下降。 0078 对实施例1、 2、 3所述中不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12、 BBP-24的单糖及 糖醛酸组成如表1所示。 0079 表1 说明书 6/9 页 9 CN 110066349 A 9 0080 0081 表1中黑莓多糖BBP、 BBP-24的单糖及糖醛酸分析结果表明， 实施例1、 实施例2中不 同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-24均由阿拉伯糖、 半乳糖、 葡萄糖、 半乳糖醛酸、 葡萄糖 醛酸组成。 其中， BBP中的比例分别为9.79、 3.04、 3.22、 83.53、 0.42； BB。

38、P-12中的 比例分别为11.23、 3.46、 3.01、 81.86、 0.41； BBP-24中的比例分别为10.67、 3.68、 2.71、 82.55、 0.39。 0082 实施例1、 实施例2、 实施例3不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-24在溶液中颗粒 的粒径大小分布如表2所示。 0083 表2 0084 0085 表2中黑莓多糖BBP、 BBP-12、 BBP-24在溶液中颗粒的粒径大小及分散性指数分析 结果表明， 实施例1、 2、 3所述中不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12和BBP-24在溶液中 的颗粒大小分别为1070.519nm、 598.66.6。

39、nm、 395.45.56nm； BBP、 BBP-12和BBP-24在 溶液中的分散性指数分别为0.2930.022、 0.2140.016、 0.1720.015， 表明实施例1至 实施例3制备的多糖粒径逐步减小， 在溶液中的分散性逐步提高。 0086 实施例1、 实施例2、 实施例3不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12和BBP-24的红 外光谱分析如表3所示。 0087 表3 说明书 7/9 页 10 CN 110066349 A 10 0088 0089 表3中黑莓多糖BBP、 BBP-12和BBP-24的红外光谱分析结果表明， 不同制备条件下 的黑莓多糖BBP、 BBP-1。

40、2和BBP-24在4000400cm-1范围内出现了明显的多糖分子吸收峰。 BBP、 BBP-12和BBP-24在3361、 3340、 3294cm-1附近呈现O-H伸缩振动峰； 在2937、 2938及 2935cm-1处呈现C-H伸缩振动峰； 在1745、 1745、 1746cm-1处呈现CO收缩振动峰； 在1631、 1618及1614cm-1处出现强吸收峰， 表明3种多糖均存在羧基基团； 在1442、 1441及1443cm-1左 右处呈现出C-H变角振动峰； 在1235、 1239和1235cm-1处呈现C-O-H伸缩振动峰； 3种多糖在 1100cm-1附近呈现出C-O-H伸缩。

41、振动峰， 同时， 也表明这3种多糖， 均为吡喃糖； 在919、 913及 921cm-1处呈现较强吸收峰， 进一步证明了3种多糖中吡喃葡萄糖基的存在， 三种多糖的红外 光谱分析结果表明超声降解并未破坏黑莓多糖的基本结构。 0090 实施例1、 实施例2、 实施例3不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-24的三股螺旋结 构分析如图1所示。 0091 结果表明， 随着NaOH浓度的增加， BBP、 BBP-12、 BBP-24三种多糖与刚果红混合溶液 最大吸收波长逐渐增加， 与阳性对照凝胶多糖表现出相同的趋势， 表明三种多糖在碱性环 境下均存在三股螺旋结构， 三股螺旋结构分析结果表明超声降解并。

42、未破坏黑莓多糖的三股 螺旋结构。 0092 实施例1、 2、 3不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 BBP-12、 BBP-24的ABTS自由基清除 活性如图2所示。 0093 结果表明， 实施例1中的多糖BBP其ABTS自由基清除活性IC50为1.62mg/mL， 实施例2 中的多糖BBP-12对ABTS自由基清除活性IC50值为1.56mg/mL， 而实施例3中的多糖BBP-24对 ABTS自由基清除活性IC50值为1.47mg/mL， 实施例1至实施例3中的黑莓多糖对ABTS自由基清 除活性IC50值稍有降低。 0094 实施例1、 实施例2、 实施例3中不同制备条件下的黑莓多糖BBP、 。

43、BBP-12、 BBP-24对 -葡萄糖苷酶抑制活性如图3所示。 说明书 8/9 页 11 CN 110066349 A 11 0095 结果表明， 实施例1中的多糖BBP对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为1.59mg/mL， 实 施例2中的多糖BBP-12对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为1.32mg/mL， 实施例3中的多糖BBP- 24对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值为1.11mg/mL， 而临床药物阿卡波糖在同等 -葡萄糖苷酶 活力下对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值3.35mg/mL， 实施例1、 实施例2和实施例3制备的黑莓 多糖a-葡萄糖苷酶抑制活性分别是阿卡波糖的2.11。

44、倍、 2.54倍和3.02倍， 实施例1至实施例 3中的黑莓多糖对 -葡萄糖苷酶抑制活性呈上升趋势。 0096 黑莓， 作为一种药食同源水果， 具有防衰老、 提高免疫力、 促进脑代谢、 降血压、 降 血脂和抗心律失常等功效。 其中， 多糖作为一种重要的生物活性物质， 在黑莓发挥生理功效 中起着重要作用， 而分子量大小对多糖生物活性的发挥起着重要作用。 0097 对比当前研究， Yu Yang等人(Xu,Y.； Guo,Y.； Duan,S.； Wei,H.； Liu,Y.； Wang,L.； Huo,X.； Yang,Y.,Effects of ultrasound irradiation o。

45、n the characterization and bioactivities of the polysaccharide from blackcurrant fruits.Ultrason Sonochem 2018,49,206-214.)采用40乙醇(m/v)对黑加仑果实提取液进行醇沉， 并研究 了超声降解对黑加仑果实多糖对 -葡萄糖苷酶抑制活性的影响， 该研究仅采用40乙醇 (m/v)进行醇沉并未使多糖完全沉淀出， 造成了果实原料资源的浪费， 不符合经济绿色发展 的要求， 且该多糖及降解后的多糖对 -葡萄糖苷酶抑制活性弱于临床药物阿卡波糖， 使其 应用受到限制。 0098 而本发明采。

46、用80乙醇(m/v)对黑莓提取液进行醇沉， 使提取液中的多糖可以完 全沉淀出， 并在不破坏多糖基本结构的基础上(分子量、 粒径、 红外光谱以及三股螺旋结构 数据证明)， 对黑莓多糖进行超声处理， 从而得到低分子量的黑莓多糖。 实施列1、 实施例2和 实施例3制备的多糖对ABTS自由基清除活性IC50值分别达到1.62、 1.56和1.47mg/mL， 由此说 明， 低分子量的黑莓多糖更有利于抗氧化性能的提升。 0099 实施列1、 实施例2和实施例3制备的低分子量黑莓多糖对 -葡萄糖苷酶抑制活性 IC50值分别达到1.59mg/mL、 1.32mg/mL和1.11mg/mL， 而临床药物阿卡波。

47、糖在同等 -葡萄糖 苷酶活力下对 -葡萄糖苷酶抑制活性IC50值3.35mg/mL， 实施例1、 实施例2、 实施例3制备的 黑莓多糖a-葡萄糖苷酶抑制活性分别是阿卡波糖的2.11倍、 2.54倍和3.02倍， 可见本发明 制得的低分子量黑莓多糖对a-葡萄糖苷酶表现出更强抑制活性， 已经远远超过临床应用的 药物阿卡波糖， 表现出非常优异的 -葡萄糖苷酶抑制活性。 0100 公开号CN 104987431 A的中国专利中， 采用冻融破壁技术联合传统水提法制备的 桑葚多糖， 其 -葡萄糖苷酶抑制活性仅相当于阿卡波糖的70； 公开号CN 102775512 A的 中国发明专利中， 缘管浒苔多糖(IC。

48、50值为0.36mg/mL)对 -葡萄糖苷酶抑制活性是阿卡波糖 (IC50值为0.46mg/mL)的1.28倍， 而本发明制备的低分子量黑莓多糖 -葡萄糖苷酶抑制活性 是阿卡波糖的2.113.02倍， 已经明显高于桑葚多糖和缘管浒苔的 -葡萄糖苷酶抑制活 性。 因此， 本发明技术制备的低分子量黑莓多糖可以作为控制餐后血糖以及糖尿病辅助治 疗的良好选择； 尤其是本发明整个技术流程均符合绿色环保要求， 特别适合工业化生产。 0101 本发明的实施方式并不受所述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实 质与原理下所作的改变、 修饰、 替代、 组合、 简化， 均应为等效的置换方式， 都包含在本发明 的保护范围之内。 说明书 9/9 页 12 CN 110066349 A 12 图1 图2 说明书附图 1/2 页 13 CN 110066349 A 13 图3 说明书附图 2/2 页 14 CN 110066349 A 14 。