食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910090653.6 (22)申请日 2019.01.30 (71)申请人 宁波大学 地址 315211 浙江省宁波市江北区风华路 818号 (72)发明人 苏秀榕周君芦晨阳韩姣姣 李晔 (74)专利代理机构 宁波奥圣专利代理事务所 (普通合伙) 33226 代理人 何仲 (51)Int.Cl. C12Q 1/6851(2018.01) C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/10(2006.01) C12Q 1/14(。

2、2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/63(2006.01) C12R 1/445(2006.01) C12R 1/42(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/37(2006.01) (54)发明名称 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂 盒 (57)摘要 本发明公开了一种食源性致病菌的高通量 定量检测试剂盒， 特点是包括9种食源性致病菌 的LAMP检测引物组， 特点是基因序列如SEQID NO.1NO.36所示， 还包括样品模板、 10反应缓 冲液、。

3、 MgSO4、 dNTP、BstDNA聚合酶和双蒸水， 优点 是特异性强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 成本 低和无假阴性结果。 权利要求书1页 说明书6页 序列表8页 附图3页 CN 110093402 A 2019.08.06 CN 110093402 A 1.一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒， 其特征在于： 包括9种食源性致病菌的 LAMP检测引物组， 其基因序列如下表所示： 。 2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒， 其特征在于： 所 述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下： 样品模板DNA 1 L， 2.5 L 10 反应缓冲液， 。

4、1.5 L浓度为100mM 的MgSO4， 3.5 L 浓度为10mM 的dNTP， 1 L浓度为8 U/ l Bst DNA 聚合酶， 1 L FIP/BIP引物组溶液， 1 L F3/B3引物组溶液和4 L甜菜碱， 然后用双 蒸水补足25 L； 其中所述的FIP/BIP 引物组溶液分别为权利要求1所述的单增李斯特菌、 副 溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏菌属、 志贺氏 菌属和致病性大肠杆菌的FIP/BIP引物组溶液， 各引物终浓度均为40 M， 所述的F3/B3引物 组溶液分别为权利要求1所述的单增李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色。

5、葡萄球菌、 蜡 样芽孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏菌属、 志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的F3/B3引物组溶 液， 各引物终浓度均为5 M。 3.根据权利要求2所述的一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒， 其特征在于： 所 述的检测试剂盒还包括显色剂， 所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶 液或者SYBR-Green I， 其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75 M， 氯化锰浓度为 500 M； 所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150 M， 所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者所述的羟基 萘酚蓝溶液的添加量为1 L/孔， 所述的SYBR-Green I显色剂的添加量为5 L/孔。 权利。

6、要求书 1/1 页 2 CN 110093402 A 2 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种食源性致病菌检测试剂盒， 尤其是涉及一种食源性致病菌的高通 量定量检测试剂盒。 背景技术 0002 食源性致病菌是可以引起食物中毒或以食品为传播媒介的致病性细菌。 致病性细 菌直接或间接污染食品及水源， 人经口感染可导致肠道传染病的发生及食物中毒以及畜禽 传染病的流行。 食源性致病菌是导致食品安全问题的重要来源。 可以引起食物中毒或以食 品为传播媒介的致病菌主要有痢疾杆菌， 致病性大肠杆菌、 沙门氏菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡 萄球菌、 单增李斯特菌、 副溶血弧菌、。

7、 蜡样芽胞杆菌、 志贺氏菌。 传统的微生物检验方法是培 养分离法， 依靠培养基进行培养、 分离及生化鉴定。 试剂盒法： 在检测装置的样品孔中加入 一部分富集培养物， 样品沿检测装置流动， 出现易于区分的可见结果。 如果只在对照区形成 一个条带， 则样品为阴性； 在对照区和检测区同时出现条带， 则可初步鉴定样品为阳性。 测 试片法： 将选择性培养基中加入专一性的酶显色剂， 并将其加载中纸片上， 通过培养， 如果 样品中含有金黄色葡萄球菌， 即可在纸片上呈现紫红色的菌落。 微生物专有酶法： 产生 -半 乳糖苷酶可以分解液体培养基中的酶底物4-甲基伞形酮- -D-半乳糖苷， 使4-甲基伞 形酮游离，。

8、 因而在366nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。 试纸片法： 试纸片为预先制备好的培 养基系统， 它含有标准培养基、 冷水可溶性凝胶和指示剂， 便于菌落计数。 细菌总数测试片 检样后37培养 （483） h， 阳性菌落在测试片上为红色或粉红色， 与测试片底色有较大反 差， 容易判别计数。 但这些方法只能半定性或者细菌总数。 因此， 亟需一种食源性致病菌的 高通量定量检测试剂盒， 实现快速定量检测。 发明内容 0003 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 成本低、 无假阴性结果的食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒。 0004 本发明解决上述技术问题所采用的。

9、技术方案为： 一种食源性致病菌的高通量定量 检测试剂盒， 包括9种食源性致病菌的LAMP检测引物组， 其基因序列如下表1所示： 表 1 说明书 1/6 页 3 CN 110093402 A 3 。 0005 所述的检测试剂盒的LAMP反应体系及各成分的终浓度如下： 样品模板DNA 1 L， 2.5 L 10反应缓冲液， 1.5 L浓度为100mM 的MgSO4， 3.5 L 浓度为10mM 的dNTP， 1 L浓度 为8 U/ l Bst DNA 聚合酶， 1 L FIP/BIP引物组溶液， 1 L F3/B3引物组溶液和4 L甜菜碱， 然后用双蒸水补足25 L； 其中所述的FIP/BIP 引。

10、物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏菌属、 志贺 氏菌属和致病性大肠杆菌的FIP/BIP引物组溶液， 各引物终浓度均为40 M， 所述的F3/B3引 物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽 孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏菌属、 志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的F3/B3引物组溶液， 各 引物终浓度均为5 M。 0006 所述的检测试剂盒还包括显色剂， 所述的显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟 基萘酚蓝溶液或者SYBR-Green I， 其中钙黄绿素/氯化锰溶液。

11、中钙黄绿素浓度为75 M， 氯化 锰浓度为 500 M； 所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150 M， 所述的钙黄绿素/氯化锰溶液或者 所述的羟基萘酚蓝溶液的添加量为1 L/孔， 所述的SYBR-Green I显色剂的添加量为5 L/ 孔。 说明书 2/6 页 4 CN 110093402 A 4 0007 与现有技术相比， 本发明的优点在于： 本发明一种食源性致病菌的高通量定量检 测试剂盒设计的引物特异强， 可进行快速扩增， 通过荧光染料根据双链DNA的多少来确定病 原模板的量， 从而达到定量检测， 时间在2-3h就完成了整个检测， 具有特异性强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 成本低、 无假。

12、阴性结果的优点。 附图说明 0008 图1为9种食源性致病菌LAMP特异性检测结果， 其中左侧为电泳图， 右侧为可视化 检测图， A： 单增李斯特菌检测结果； B： 副溶血弧菌检测结果； C： 霍乱弧菌检测结果； D： 金黄 色葡萄球菌检测结果； E： 蜡样芽孢杆菌检测结果； F： 奇异变形杆菌检测结果； G： 沙门氏菌属 检测结果； H： 志贺氏菌属检测结果； I： 致病性大肠杆菌检测结果； 0： DNA Marker； 1： 单增李 斯特菌； 2： 副溶血弧菌； 3： 霍乱弧菌； 4： 金黄色葡萄球菌； 5： 蜡样芽孢杆菌； 6： 奇异变形杆 菌； 7： 沙门氏菌属； 8： 志贺氏菌属； 。

13、9： 致病性大肠杆菌； 10： 阴性对照； 图2为9种食源性致病菌LAMP灵敏度检测结果图； 其中左侧为电泳图， 右侧为可视化检 测图， A： 单增李斯特菌检测结果； B： 副溶血弧菌检测结果； C： 霍乱弧菌检测结果； D： 金黄色 葡萄球菌检测结果； E： 蜡样芽孢杆菌检测结果； F： 奇异变形杆菌检测结果； G： 沙门氏菌属检 测结果； H： 志贺氏菌属检测结果； I： 致病性大肠杆菌检测结果； 0： DNA Marker； 1： 阴性对照； 8-2： 分别为10倍浓度梯度稀释的质粒模板； 图3为样品检测实例图， 其中A为羟基萘酚蓝作为指示剂的微流控生物芯片检测结果， B 为羟基萘酚蓝作。

14、为指示剂的微流控生物芯片检测结果； 1： 单增李斯特菌； 2： 副溶血弧菌； 3： 霍乱弧菌； 4： 金黄色葡萄球菌； 5： 蜡样芽孢杆菌； 6： 奇异变形杆菌； 7： 沙门氏菌属； 8： 志贺氏 菌属； 9： 致病性大肠杆菌； 10： 阴性对照。 具体实施方式 0009 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 0010 具体实施例一 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒， 包括9种食源性致病菌的LAMP检测引物 组， 其基因序列如下表1所示： 表 1 说明书 3/6 页 5 CN 110093402 A 5 。 0011 上述基因靶位点设计： 选种间特异、 种内保守的基因设计引物， 。

15、是因为外部引物F3 同样有机会与模板上的F3c结合并延伸， 置换出完整的FIP连接的互补单链。 此时， FIP上的 F1c就能实现与此单链上Fl的互补， 通过自我碱基配对形成环状结构。 同样的， 下游引物BIP 和B3存在类似于引物FIP和F3的合成， 这就为形成哑铃状的单链结构提供了可能。 此时， 3 端的Fl区段在具有链置换能力的DNA聚合酶作用下， 就会以自身为模板， 进行DNA合成， 形成 茎环状结构。 0012 依 据 上 述 选 择 9 种 食 源 性 致 病 菌 的 特 异 性 基 因 片 段 为 靶 目 标 ， 应 用 PRIMEREXPLORER V5软件设计引物， 引物的合。

16、成由上海生工生物工程有限公司完成。 将引物 与靶目标比对， 进行大量筛选试验和分析， 得到特异、 敏感、 稳定的上述F3、 B3、 FIP、 BIP 的 LAMP检测引物组； 将设计合成的4条引物进行反应时间和温度优化实验后， 确定扩增效率和 特异性最好的反应条件。 0013 具体实施例二 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒， 其LAMP反应体系及各成分的终浓度如 下： 样品模板DNA 1 L， 2.5 L 10反应缓冲液， 1.5 L浓度为100mM 的MgSO4， 3.5 L 浓度 为10mM 的dNTP， 1 L浓度为8 U/ l Bst DNA 聚合酶， 1 L FIP/BIP引物。

17、组溶液， 1 L F3/B3 说明书 4/6 页 6 CN 110093402 A 6 引物组溶液和4 L甜菜碱， 然后用双蒸水补足25 L； 其中FIP/BIP 引物组溶液分别为表1所 示的单增李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 奇异变形杆 菌、 沙门氏菌属、 志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的9种食源性致病菌的FIP/BIP引物组溶液， 各引物终浓度均为40 M， F3/B3引物组溶液分别为表1所示的单增李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏菌属、 志贺氏菌属和致病 性大肠杆菌的9种食源性致病菌的F3/B。

18、3引物组溶液， 各引物终浓度均为5 M。 0014 上述检测试剂盒还包括显色剂， 显色剂为钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝 溶液或者SYBR-Green I， 其中钙黄绿素/氯化锰溶液中钙黄绿素浓度为75 M， 氯化锰浓度为 500 M； 所述的羟基萘酚蓝溶液浓度为150 M， 钙黄绿素/氯化锰溶液或者羟基萘酚蓝溶液的 添加量为1 L/孔， SYBR-Green I显色剂的添加量为5 L/孔。 还设置有阴性对照为水， 阳性对 照为双链的DNA。 0015 具体实施例三 一种利用上述具体实施例二检测试剂盒进行食源性致病菌的高通量定量检测的方法， 包括以下步骤： 取待检样品， 按照市售细菌DNA。

19、提取试剂盒提取样品模板DNA， 取样品模板DNA 1 L， 按 照LAMP反应体系组成加入2.5 L 10反应缓冲液， 1.5 L MgSO4， 3.5 L dNTP， 1 L Bst DNA 聚合酶， 1 L FIP/BIP引物组溶液， 1 L F3/B3引物组溶液和4 L甜菜碱， 然后用双蒸水补足 25 L后混匀， 取混合液20 L加至样品检测芯片的每个加样孔 （其中引物组溶液分别为单增 李斯特菌、 副溶血弧菌、 霍乱弧菌、 金黄色葡萄球菌、 蜡样芽孢杆菌、 奇异变形杆菌、 沙门氏 菌属、 志贺氏菌属和致病性大肠杆菌的9种食源性致病菌的引物组溶液， 每一种食源性致病 菌的引物组溶液相应加到。

20、一个加样孔中， 加上加阴性对照的加样孔， 参与反应的加样孔一 共为9个） ， 再在每个孔中加入1 L显色剂， 打开仪器电源开关， 待屏幕自检完成， 打开反应室 盖， 将芯片放入仪器反应室内， 盖上反应室盖， 屏幕上点击 “开始” 按钮， 仪器自动进行， 等待 反应结束， 仪器提示后进入检测菜单界面， 选择检测， 仪器会自动读取芯片反应室的颜色数 据 （使用羟基萘酚蓝作为显色剂时阳性为蓝色， 阴性为紫罗兰色； 使用钙黄绿素为显色剂 时， 绿色为阳性， 黄色为阴性） 并按照RGB值进行浓度换算， 最后给出每个孔样品中所含细菌 核酸的拷贝数。 0016 若是使用SYBR-Green I显色液时， 取。

21、混合液20 L加至样品检测芯片的每个加样 孔。 打开仪器电源开关， 待屏幕自检完成， 打开反应室盖， 将芯片放入仪器反应室内， 盖上反 应室盖， 屏幕上点击 “开始” 按钮， 仪器自动进行， 等待反应结束， 取出芯片， 每个加样孔加5 L的SYBR-Green I的工作液。 进入仪器检测菜单界面， 选择检测， 仪器会自动读取芯片反应 室的颜色数据 （绿色为阳性， 橙色为阴性） 并按照RGB值进行浓度换算， 最后给出每个样品中 所含细菌核酸的拷贝数。 0017 图1为左侧为9种食源性致病菌的LAMP反应后的电泳图谱， 右侧为采用上述方法使 用SYBR-Green I染料后的9种食源性致病菌的LA。

22、MP反应结果， 绿色的为阳性， 橙色的为阴 性。 由图1可知， 样品检测芯片中只有对应的食源性致病菌LAMP检测引物为阳性， 空白对照 及其余非目的菌检测结果均为阴性。 0018 具体实施例四 灵敏度试验： 将分别含有9种食源性致病菌特异片段的质粒10倍梯度稀释， 取各稀释度 说明书 5/6 页 7 CN 110093402 A 7 进行LAMP扩增反应， 9种病原微生物LAMP 方法的检测限为10-70 copies / L。 如图2所示， 图中8为原始浓度， 8-2分别为10倍稀释的模板， 进行LAMP反应后， 分别用电泳和使用SYBR- Green I染料染色观察结果。 初始浓度A ： 。

23、3.75107 copies / L、 B： 2.44107 copies / L、 C： 5.98107 copies / L、 D： 3.07107 copies / L、 E： 1.55107 copies / L、 F： 3.41 107 copies / L、 G： 3.98107 copies / L、 H： 4.01107 copies / L、 I： 6.22107 copies / L。 0019 具体实施例五 将疑似待测食物样品2例按照相关国标方法进行样品前处理， 制备DNA模板， 样品经 LAMP反应 （离心式微流控生物芯片） 检测后， A样品使用羟基萘酚蓝进行显示， B。

24、通过SYBR- Green I染料染色。 如图3所示， 结果显示样品A中含有单增李斯特菌和霍乱弧菌， B样品中， 含有霍乱弧菌和奇异变形杆菌。 经生理生化试验验证， 以上两个样品中含有检出的致病菌。 0020 上述说明并非对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。 本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内， 做出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护 范围。 说明书 6/6 页 8 CN 110093402 A 8 序列表 宁波大学 一种食源性致病菌的高通量定量检测试剂盒 36 PatentIn version 3.3 1 20 DNA 人工序列 单增李斯特菌secG-F。

25、3 1 CGGTCTTACTCATCATCGTA 20 2 20 DNA 人工序列 单增李斯特菌secG-B3 2 CAAAGTATGCCAGTGCAATT 20 3 45 DNA 人工序列 单增李斯特菌secG-FIP 3 CTCAGCTCCACCAGAGATGGATTACAGTTATCATACTTCAACCAG 45 4 47 DNA 人工序列 单增李斯特菌secG-BIP 4 TATTCGGTAAGCAAAAAGCAAGAGGAAGAAAACAACGGATAGAACGA 47 序列表 1/8 页 9 CN 110093402 A 9 5 20 DNA 人工序列 副溶血弧菌norM-F3 。

26、5 GTGATGTGTCTTTGGGTATG 20 6 19 DNA 人工序列 副溶血弧菌norM-B3 6 AGAAAACGCTCTTGGACTT 19 7 44 DNA 人工序列 副溶血弧菌norM-FIP 7 CGCTACATGACAAGTAACGCCTAAGACATAAAACTGAATACGCT 44 8 42 DNA 人工序列 副溶血弧菌norM-BIP 8 GACAGTTCAATTTCTTGCCGTCAACTTCACCTGATTTGCTCT 42 9 20 DNA 人工序列 霍乱弧菌murP-F3 9 序列表 2/8 页 10 CN 110093402 A 10 CGCAGCAGA。

27、AAAAGCAGATG 20 10 20 DNA 人工序列 霍乱弧菌murP-B3 10 GCCCTTTGCCAAACACTTTG 20 11 41 DNA 人工序列 霍乱弧菌murP-FIP 11 GCGGGGTAAAAATGGTGGCAAAAGAGCAAGCAAACCAGTGC 41 12 39 DNA 人工序列 霍乱弧菌murP-BIP 12 CAGGCTTGCTGCTGGGCATTCATAAACTCGCTCGGGGTT 39 13 23 DNA 人工序列 金黄色葡萄球菌tnpG-F3 13 CGTCTCATTAAACAATTTGGTAA 23 14 21 DNA 人工序列 金黄色葡萄球。

28、菌tnpG-B3 序列表 3/8 页 11 CN 110093402 A 11 14 CATTCAATGCCTTTGAGTGTA 21 15 49 DNA 人工序列 金黄色葡萄球菌tnpG-FIP 15 CAGTCCGGTTTAAGTTTAAAAGCTTCTCAAAAGGTAATTACAGATCAGG 49 16 49 DNA 人工序列 金黄色葡萄球菌tnpG-BIP 16 TGAATAACCTCATTGAGCAAGATCAGTATTGATACTTTGATATCTTGTC 49 17 18 DNA 人工序列 蜡样芽孢杆菌glgA-F3 17 TCGCGGAATACAGTACGT 18 18 2。

29、2 DNA 人工序列 蜡样芽孢杆菌glgA-B3 18 CGAGAAGACAATATTCTGTGTG 22 19 48 DNA 人工序列 序列表 4/8 页 12 CN 110093402 A 12 蜡样芽孢杆菌glgA-FIP 19 GCGCGTTTATTTTCACTCTTTTCATGAAACGGATTCGTATATTAAGGC 48 20 44 DNA 人工序列 蜡样芽孢杆菌glgA-BIP 20 TTGGTTTGCCAGAAAAAGAGGAACTAAATCAAGACCTTTTTGCT 44 21 23 DNA 人工序列 奇异变形杆菌qnrD-F3 21 AAGACAAATCTTAGTTA。

30、CGCTAA 23 22 21 DNA 人工序列 奇异变形杆菌qnrD-B3 22 CCCGTTAAATCACAACCAGTA 21 23 47 DNA 人工序列 奇异变形杆菌qnrD-FIP 23 CCAGTTATCACAGTGCCATTCCACTAGAGTCATATTAGAAAAGTGCG 47 24 39 DNA 人工序列 序列表 5/8 页 13 CN 110093402 A 13 奇异变形杆菌qnrD-BIP 24 CGTGTTTCGTGGCTCCGATCAGCCAAAGACCAATCAAAC 39 25 18 DNA 人工序列 沙门氏菌属lcmP-F3 25 AGCTCAGCGCT。

31、TACTGAA 18 26 18 DNA 人工序列 沙门氏菌属lcmP-B3 26 TCCGTTCTGTACGTCTGG 18 27 45 DNA 人工序列 沙门氏菌属lcmP-FIP 27 TTGGTAATTTCCCCCCTTCTAAAGCAGTATCCATCTACCTTCCTG 45 28 48 DNA 人工序列 沙门氏菌属lcmP-BIP 28 TGGTTGAAAGGGATTGACAGAGGGAATAATACTTTCAATGCAAGTTCC 48 29 22 DNA 序列表 6/8 页 14 CN 110093402 A 14 人工序列 志贺氏菌属actX-F3 29 TTATCCCGG。

32、AGCGGTATC 18 30 19 DNA 人工序列 志贺氏菌属actX-B3 30 CCAAAACTGACCAGTCCAT 19 31 43 DNA 人工序列 志贺氏菌属actX-FIP 31 TCCCCTGTATGCACTACAGTCTTACTACAATCCAGTTATACGC 43 32 39 DNA 人工序列 志贺氏菌属actX-BIP 32 ATCATGCCAATGTTTCCCGGTTTTCATCCGGGTAAAGCA 39 33 22 DNA 人工序列 致病性大肠杆菌espP-F3 33 GATGGCTGATATTAACCAACAA 22 34 18 序列表 7/8 页 15 C。

33、N 110093402 A 15 DNA 人工序列 致病性大肠杆菌espP-B3 34 TTACTGTATGCTGCGTGG 18 35 47 DNA 人工序列 致病性大肠杆菌espP-FIP 35 CATAGACGAACAGTGCTGAACCGTTTGATGAGTTTAATAACATTGCC 47 36 43 DNA 人工序列 致病性大肠杆菌espP-BIP 36 ACCAAAAGAAAAAGTGGGTTGTCGTTTTTGCCATTGGCGTAAT 43 序列表 8/8 页 16 CN 110093402 A 16 图1 说明书附图 1/3 页 17 CN 110093402 A 17 图2 说明书附图 2/3 页 18 CN 110093402 A 18 图3 说明书附图 3/3 页 19 CN 110093402 A 19 。