复合微生物菌剂及其在草莓种植中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910277274.8 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 云南忱朋科技发展有限公司 地址 650224 云南省昆明市盘龙区江东花 城E座1单元301室 (72)发明人 朱亚力童江云陈杉艳董琼娥 屠怀组 (74)专利代理机构 北京中政联科专利代理事务 所(普通合伙) 11489 代理人 李春玲 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C05G 3/04(2006.01) A01N 63/00(2。

2、006.01) A01P 1/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/10(2006.01) C12R 1/145(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/07(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 复合微生物菌剂及其在草莓种植中的应用 (57)摘要 本发明提供了一种复合微生物菌剂， 其包括 地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏 菌、 红蝽菌和解淀粉芽孢杆菌。 还提供了用于制 备该复合微生物菌剂的方法以及该复合微生物 菌剂在草莓种植中的应用。

3、。 本发明的复合微生物 菌剂可以实现对草莓根部病原菌明显抑制和降 解的作用， 同时对草莓的生长和物质代谢也具有 明显的正向影响及促进作用， 可以大大促进草莓 果实品质的提高。 权利要求书1页 说明书11页 CN 110106106 A 2019.08.09 CN 110106106 A 1.复合微生物菌剂， 其包括地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏菌、 红蝽菌和 解淀粉芽孢杆菌。 2.如权利要求1所述的复合微生物菌剂， 其包括地衣芽孢杆菌0.4106CFU/ml， 丁酸 梭菌0.4108CFU/ml， 乳酸杆菌0.4108CFU/ml， 奥尔森氏菌0.4106CFU/ml， 红蝽。

4、 菌0.4106CFU/ml， 和解淀粉芽孢杆菌0.4106CFU/ml。 3.如权利要求1或2所述的复合微生物菌剂， 其还包括有机酸。 4.如权利要求3所述的复合微生物菌剂， 其中， 所述有机酸包括选自由甲酸、 乙酸和/或 乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。 5.如权利要求4所述的复合微生物菌剂， 其中， 当存在时， 甲酸含量为1.06.0mmol/L， 乙酸含量为1.06.0mmol/L， 以及乳酸含量为2.06.0mmol/L。 6.复合微生物菌剂的制备方法， 其包括以下步骤： (1)制备复合菌种A： 将地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏菌、 红蝽菌菌种在 厌氧发酵营养液。

5、中搅拌均匀， 发酵得到复合菌种A； (2)制备复合菌液B： 将步骤(1)中制备得到的复合菌种A在厌氧发酵营养液中搅拌均 匀， 发酵得到复合菌液B； (3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液： 将解淀粉芽孢杆菌菌种接种于培养基中， 培养得到解淀 粉芽孢杆菌菌液； (4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得 到所述复合微生物菌剂。 7.如权利要求6所述的复合微生物菌剂的制备方法， 步骤(3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液 包括： 将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上， 恒温培养后待用； 将上述经固体培养的解淀粉芽孢杆菌菌种接种于NB液体培养基中， 振荡培养得到。

6、解淀粉芽 孢杆菌菌液。 8.如权利要求1-5所述的复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其中， 在土壤准备阶段施用所述复合微生物菌剂。 10.如权利要求8所述的应用， 其中， 在生长阶段施用所述复合微生物菌剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110106106 A 2 复合微生物菌剂及其在草莓种植中的应用 技术领域 0001 本发明属于微生物及农业技术领域， 涉及复合微生物菌剂制备与应用， 具体涉及 用于解决草莓栽培管理中的多种问题的复合微生物菌剂及其制备和应用方法。 背景技术 0002 草莓， 蔷薇科草莓属的一种多年生草本果树， 色泽艳丽， 香气浓郁， 营养价。

7、值高， 被 誉为 “水果皇后” ， 是最受消费者喜爱的一类低糖、 低热量浆果。 近年来， 我国草莓产业发展 迅速， 据统计， 2017年我国草莓种植面积230万亩， 总产量460万吨， 总产值600亿元， 小草莓 已然形成了大产业。 但由于草莓栽培管理过程中为了片面追求高产而过量施用化学肥料和 化学农药， 导致我国草莓种植区域连作障碍日趋明显， 连作障碍的直接后果是死苗率达到 50以上， 产量和品质急剧下降， 有些地区几乎绝收， 造成严重的经济损失。 目前， 生产上最 常用的是化学药剂消毒的方法来防治草莓连作障碍， 虽然化学药剂消毒能杀死连作土中的 有害微生物， 但同时也杀死了土壤中有益微生物。

8、， 从而破坏作物根际微生物种群的动态平 衡， 造成土壤结构遭到破坏且对环境产生二次污染的不良影响， 同时还会导致草莓植株生 长不良或出现弱株， 效果并不理想。 0003 现已公开了的一些以微生物发酵液为主要成分的农用复合微生物菌剂产品， 例 如： CN 102424635 B和CN 108504598 A等。 这些发明为在草莓种植管理中解决由于重茬种 植所引起的草莓根部土传性病害， 改善草莓生长的土壤环境， 提高草莓种植中的栽种成活 率， 以及提高草莓果实品质等方面都带来了明显的效果。 但是现有的技术方案， 如上所列举 的两种， 均存在以下技术缺陷。 首先产品发酵过程较长， 一般需要510天的。

9、生产周期。 在使 用中多用于农作物栽种前的土壤准备期。 而在类似草莓等植物的生长管理期中较难应用， 进而对草莓生长的过程的改善， 对草莓产量和果实品质的影响微弱。 因此亟需新型技术能 克服上述缺陷。 发明内容 0004 为克服现有技术的缺陷， 发明人经过不断的改进和反复试验， 发明人终于发现， 含 有如下菌种： 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) 、 乳酸杆菌(Lactobacillus) 、 奥尔森氏 菌(Olsenella) 、 红蝽菌 (Coriobacterium)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus a。

10、myloliquefaciens)等菌种的复合菌液 对草莓根部病原菌有明显抑制和降解作用， 同时对草莓的生长和物质代谢有明显的正向影 响及促进作用， 可以大大促进草莓果实品质的提高。 0005 因此， 在本发明的第一方面， 提供了复合微生物菌剂， 其包括地衣芽孢杆菌、 丁酸 梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏菌、 红蝽菌和解淀粉芽孢杆菌。 0006 在一些优选实施方案中， 本发明的复合微生物菌剂包括地衣芽孢杆菌0.4 106CFU/ml， 丁酸梭菌0.4108CFU/ml， 乳酸杆菌0.4108CFU/ml， 奥尔森氏菌0.4 106CFU/ml， 红蝽菌0.4106CFU/ml， 和解淀粉芽孢杆菌。

11、0.4106CFU/ml。 说明书 1/11 页 3 CN 110106106 A 3 0007 在一些实施方案中， 本发明的复合微生物菌剂还包括有机酸。 优选为， 所述有机酸 包括选自由甲酸、 乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。 0008 在一些实施方案中， 在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 甲酸含量为1.0 6.0mmol/L， 乙酸含量为1.06.0mmol/L， 以及乳酸含量为2.06.0mmol/L。 0009 在本发明的第二方面， 提供了本发明的复合微生物菌剂的制备方法， 该方法包括 以下步骤： (1)制备复合菌种A： 将地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森。

12、氏菌、 红蝽菌菌种在 厌氧发酵营养液中搅拌均匀， 发酵得到复合菌种A； (2)制备复合菌液B： 将步骤(1)中制备得到的复合菌种A在厌氧发酵营养液中搅拌均 匀， 发酵得到复合菌液B； (3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液： 将解淀粉芽孢杆菌菌种接种于培养基中， 培养得到解淀 粉芽孢杆菌菌液； (4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得 到所述复合微生物菌剂。 0010 在一些实施方案中， 培养解淀粉芽孢杆菌菌液包括： 将解淀粉芽孢杆菌菌种在 无菌条件下接种于NA固体培养基上， 恒温培养后待用； 将上述经固体培养的解淀粉芽孢 杆菌菌种接种于NB液体培养基中， 振荡。

13、培养得到解淀粉芽孢杆菌菌液。 0011 在本发明的第三方面， 提供了本发明的复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。 0012 在一些实施方案中， 在土壤准备阶段应用本发明的复合微生物菌剂， 包括： 在土壤 中施放了一定量的有机底肥并翻耕后， 将复合微生物菌剂稀释后得到的复合微生物菌剂稀 释液浇灌于土壤中。 0013 在一些实施方案中， 在生长阶段应用本发明的复合微生物菌剂， 包括： 每间隔13 周， 将复合微生物菌剂稀释后得到的复合微生物菌剂稀释液对草莓实施根部滴灌。 0014 本发明提供了一种着重解决草莓种植过程中的根部病害， 和提高草莓果实品质的 复合微生物菌剂及其制备和应用方法。 在多种菌株。

14、混合后， 通过严格控温、 控氧、 基质调控 以及对发酵液酸碱度控制等手段， 筛选富集健康土壤新陈代谢和植物生长代谢所需的好 氧-兼气-厌氧生态菌群和次生代谢产物。 发酵所得到的复合微生物菌剂发酵液中除富含多 种土壤益生菌外， 还含多种有益酶、 菌体蛋白、 氨基酸、 有机酸以及其它复合微生物共代谢 产物。 本发明的复合微生物菌剂通过大量有活性的、 协同作用能力强的好氧、 厌氧及兼性厌 氧复合微生物菌群的作用， 可以高效地重构原始土壤所具有的好氧-兼性厌氧-厌氧生态微 循环， 快速激活土壤微生物区系， 恢复土壤健康环境， 降解重茬残根和毒素， 促进分解与合 成作物生长所需的养分， 以达到抑制草莓等。

15、植物所感染的土传病虫害等目的。 0015 除了抵御草莓生长中的根部病害外， 本发明的复合微生物菌剂还可以方便地应用 于草莓生长管理的其它阶段， 从而有效地解决长期防治根系病害， 促进根系和植株健康生 长， 明显提高草莓果实品质等效果。 具体实施方式 0016 应理解， 本文公开的方法的不同应用可以根据本领域的具体需求而改变。 还应理 解， 本文中使用的术语仅仅是为了描述本发明的具体实施方案， 而不是意图进行限制。 说明书 2/11 页 4 CN 110106106 A 4 0017 本 发 明 提 供 了 复 合 微 生 物 菌 剂 ， 其 包 括 地 衣 芽 孢 杆 菌 ( B a c i 。

16、l l u s licheniformis)、 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、 乳酸杆菌(Lactobacillus)、 奥尔森 氏 菌(Olsenella) 、 红蝽菌(Coriobacterium) 和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。 可以用于本发明的微生物菌的来源没有特别限制， 例如可以商购从 市场上获得。 0018 当在本发明中使用时， 术语 “地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)” 是指一种 革兰氏阳性的嗜热细菌， 在土壤中常见。 地衣芽孢杆菌无毒， 能分泌出活性强的蛋白质分解 酵素， 用以快速。

17、地分解水中的有机氮化物， 亦能分解其它有机物， 在水质净化上能担任重要 的分解角色。 0019 当在本发明中使用时， 术语 “丁酸梭菌(Clostridium butyricum)” 是指是一种梭 状芽孢杆菌， 也称为丁酸菌、 酪酸梭菌、 酪酸菌、 宫入菌， 分类归属于梭菌属， 为革兰氏阳性 厌氧杆菌。 0020 当在本发明中使用时， 术语 “乳酸杆菌(Lactobacillus)” 是指是一类杆状或球状 的革兰氏阳性菌， 可发酵碳水化合物(主要指葡萄糖)并产生大量乳酸， 在自然界分布广泛， 是动物和人肠道等处重要的生理性菌群之一。 该类群细菌绝大多数对动物和人无毒、 无害， 负担着动物体内重。

18、要的生理功能。 在乳酸菌中， 乳酸杆菌是最大的一个属。 在本发明的复合 微生菌剂中可以包含任一种、 两种或更多种乳酸杆菌。 在本文中述及乳酸杆菌含量时指一 种、 两种或更多种乳酸杆菌的总含量。 0021 当在本发明中使用时， 术语 “奥尔森氏菌(Olsenella)” 是指一类厌氧革兰氏阳性 菌， 也称为欧陆森氏菌。 在本发明的复合微生菌剂中可以包含任一种、 两种或更多种奥尔森 氏菌。 在本文中述及奥尔森氏菌含量时指一种、 两种或更多种奥尔森氏菌的总含量。 0022 当在本发明中使用时， 术语 “红蝽菌(Coriobacterium)” 是指一类放线菌， 为非运 动性的革兰氏阳性菌， 通常栖息。

19、在萤火虫(Pyrrhocoris apterus)的胃肠道中。 在本发明的 复合微生菌剂中可以包含任一种、 两种或更多种红蝽菌。 在本文中述及红蝽菌含量时指一 种、 两种或更多种红蝽菌的总含量。 0023 当在本发明中使用时， 术语 “解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)” 是 指芽孢杆菌属中的一种细菌， 是BamH1限制酶的来源。 解淀粉芽孢杆菌用于农业、 水产养殖 和水培， 以对抗根病原体以及提高对盐胁迫的根耐受性， 此外， 还被认为是促进生长的根际 细菌， 具有快速定殖根的能力。 0024 当在本发明中使用时， 在复合微生物菌剂中， 地衣芽孢杆菌的含量为。

20、0.4 106CFU/ml， 优选为0.6106CFU/ml， 更优选为0.8106CFU/ml， 最优选为1.0 106CFU/ml。 丁酸梭菌的含量为0.4108CFU/ml， 优选为0.6108CFU/ml， 更优选为 0.8108CFU/ml， 最优选为1.0108CFU/ml。 乳酸杆菌的含量为0.4108CFU/ml， 优选 为0.6108CFU/ml， 更优选为0.8108CFU/ml， 最优选为1.0108CFU/ml。 奥尔森氏 菌的含量为0.4106CFU/ml， 优选为0.6106CFU/ml， 更优选为0.8106CFU/ml， 最 优选为1.0106CFU/ml。 红。

21、蝽菌的含量为0.4106CFU/ml， 优选为0.6106CFU/ml， 更优选为0.8106CFU/ml， 最优选为1.0106CFU/ml。 解淀粉芽孢杆菌的含量为0.4 106CFU/ml， 优选为0.6106CFU/ml， 更优选为0.8106CFU/ml， 最优选为1.0 106CFU/ml。 说明书 3/11 页 5 CN 110106106 A 5 0025 在本发明的复合微生物菌剂中还可以包括有机酸成分。 可以用在本发明的复合微 生物菌剂中的有机酸一般为C1-C8的一元、 二元或更多元的有机酸， 其上可任选地具有一 个、 两个或更多个取代基， 例如羟基、 氨基、 卤素等。 在优。

22、选的实施方案中， 所述有机酸是任 选地具有一个、 两个或更多个取代基的C1-C4的一元、 二元或更多元的有机酸， 例如但不限 于甲酸、 乙酸、 丙酸、 丁酸、 乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 乳酸等。 在优选的实施方案中， 所述有机 酸包括选自由甲酸、 乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。 0026 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 每一种有机酸的含量为1.012.0mmol/ L， 优选为1.010.0mmol/L， 更优选为1.08.0mmol/L， 最优选为1.06.0mmol/L。 在具体 的实施方案中， 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 甲酸的含量为1.010.0mm。

23、ol/L， 优选为1.08.0mmol/L， 更优选为1.06.0mmol/L， 再更优选为1.04.0mmol/L， 例如1.0 3.2mmol/L。 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 乙酸的含量为1.010.0mmol/L， 优 选为1.08.0mmol/L， 更优选为1.06.0mmol/L， 再更优选为1.04.0mmol/L， 例如1.6 3.5mmol/L。 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 乳酸的含量为1.010.0mmol/L， 优选 为1.08.0mmol/L， 更优选为2.06.0mmol/L， 再更优选为3.06.0mmol/L， 例如3.0 5.5mmol/L。。

24、 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 有机酸的总含量为1.020.0mmol/L， 优选为1.018.0mmol/L， 更优选为1.016.0mmol/L， 最优选为1.014.0mmol/L。 0027 本发明提供了复合微生物菌剂的制备方法， 包括如下步骤： (1)制备复合菌种A； (2)制备复合菌液B； (3)制备解淀粉芽孢杆菌菌液； (4)将步骤(2)中制备的复合菌液B与步 骤(3)中制备的解淀粉芽孢杆菌菌液相混合得到本发明的复合微生物菌剂。 0028 在步骤(1)中， 将商购获得的地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏菌、 红 蝽菌菌种接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀。 在本文。

25、中， 菌种的加入量以每100L发酵营养液 中加入的菌种重量(g)计算， 例如5表示每100L发酵营养液中接入5g菌种。 地衣芽孢杆菌 以46的量接入， 优选为4.25.8， 更优选为4.45.6， 再更优选为4.65.4， 最 优选为4.85.2， 例如4.8、 4.9、 5.0、 5.1、 5.2， 或上述范围内的任意数值。 丁 酸梭菌以6.58.5的量接入， 优选为6.78.3， 更优选为6.98.1， 再更优选为7.1 7.9， 最优选为7.37.7， 例如7.3、 7.4、 7.5、 7.6、 7.7， 或上述范围内的任 意数值。 乳酸杆菌以14.516.5的量接入， 优选为14.71。

26、6.3， 更优选为14.9 16.1， 再更优选为15.115.9， 最优选为15.315.7， 例如15.3、 15.4、 15.5、 15.6、 15.7， 或上述范围内的任意数值。 奥尔森氏菌以14.016.0的量接入， 优选为 14.215.8， 更优选为14.415.6， 再更优选为14.415.6， 再更优选为14.6 15.4， 最优选为14.815.2， 例如14.8、 14.9、 15.0、 15.1、 15.2， 或上述范围 内的任意数值。 红蝽菌以3.05.0的量接入， 优选为3.24.8， 更优选为3.44.6， 再更优选为3.44.6， 再更优选为3.64.4， 最优。

27、选为3.84.2， 例如3.8、 3.9、 4.0、 4.1、 4.2， 或上述范围内的任意数值。 0029 在发酵容器内， 温度通常保持在3040， 优选为3238， 更优选为3436， 例如为34、 35或36， 或上述范围内的任意数值。 发酵时间通常为6084小时， 优选为 6480小时， 更优选为6876小时， 最优选为7074小时， 例如70、 71、 72、 73和74小时， 或上 述范围内的任意数值。 此外， 还可以通过发酵容器内的pH值和氧化还原电位值来判断发酵 是否完成。 例如当发酵容器内pH4.55.0， 且氧化还原电位值(ORP)达到-100-200mV， 说明书 4/1。

28、1 页 6 CN 110106106 A 6 即可认为发酵已完成。 0030 在步骤(1)中使用的用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液可以是本领域中常用 的厌氧发酵营养液， 其中通常包括但不限于选自以下组的组分： 糖蜜、 氢氧化钠、 碳酸氢铵、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 硫酸镁、 硫酸亚铁、 硫酸锰、 氯化钙、 碳酸钙， 以及纯净水。 0031 当在本发明的用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液中使用时， 上述组分的含量 可以相互独立地如下所示， 其中组分含量以重量份计： 纯净水1500020000重量份， 糖蜜 30005000重量份， 氢氧化钠180.0220.0重量份， 碳酸氢铵50.070。

29、.0重量份， 磷酸二氢 钾0.61.0重量份， 磷酸氢二钾0.61.0重量份， 硫酸镁1.01.5重量份， 硫酸亚铁0.4 0.6重量份， 硫酸锰0.200.30重量份， 氯化钙0.150.20重量份， 碳酸钙80120重量份。 在一些具体实施方案中， 上述组分的具体含量可以相互独立地如下所示： 纯净水16000重量 份， 例如16L； 糖蜜4000重量份， 例如4kg； 氢氧化钠200重量份， 例如200g； 碳酸氢铵64重量 份， 例如64g； 磷酸二氢钾0.8重量份， 例如0.8g； 磷酸氢二钾0.8重量份， 例如0.8g； 硫酸镁 1.3重量份， 例如1.3g； 硫酸亚铁0.5重量份，。

30、 例如0.5g； 硫酸锰0.25重量份， 例如0.25g； 氯化 钙0.16重量份， 例如0.16g； 以及碳酸钙100重量份， 例如100g。 0032 所述用于制备复合菌种A的厌氧发酵营养液按以下制备： 将组成成分混合搅拌均 匀， 加热至100并持续煮沸46分钟， 例如5分钟后注入厌氧发酵容器内， 冷却至3040 ， 优选为3238， 更优选为3436， 例如34、 35或36， 或上述范围内的任意数 值。 0033 在发酵完成以后， 在所制得的复合菌种A中活菌菌群总数10.0108CFU/ml， 其 中作为优势菌种的菌群数量各自独立地为： 地衣芽孢杆菌1.0108CFU/ml， 优选为1。

31、.2 108CFU/ml， 更优选为1.4108CFU/ml， 最优选为1.6108CFU/ml； 丁酸梭菌2.5 108CFU/ml， 优选为2.7108CFU/ml， 更优选为2.9108CFU/ml， 最优选为3.1 108CFU/ml； 乳酸杆菌2.5108CFU/ml， 优选为2.7108CFU/ml， 更优选为2.9 108CFU/ml， 最优选为3.2108CFU/ml； 奥尔森氏菌0.5108CFU/ml， 优选为0.7 108CFU/ml， 更优选为0.9108CFU/ml， 最优选为1.1108CFU/ml； 红蝽菌0.4 108CFU/ml， 优选为0.6108CFU/m。

32、l， 更优选为0.6108CFU/ml， 最优选为1.0 108CFU/ml。 在所制得的复合菌种A中还可以包含其他非优势菌种， 其中优势菌种所占菌群 总数的比例60。 0034 在步骤(2)中， 将步骤(1)中制备的复合菌种A接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀， 其 中将pH调节至6.58.0， 优选为7.07.5， 例如7.0、 7.1、 7.2、 7.3、 7.4或7.5， 或上述范围内 的任意数值。 0035 在发酵容器内， 温度通常保持在3442， 优选为3640， 更优选为38。 发酵 时间通常为812小时， 优选为911小时， 更优选为10小时。 此外， 还可以通过发酵容器内 的pH值。

33、和氧化还原电位值来判断发酵是否完成。 例如当发酵容器内pH5.05.5， 且氧化 还原电位值(ORP)达到-100-200mV， 即可认为发酵已完成。 0036 在步骤(2)中使用的厌氧发酵营养液可以是本领域中常用的厌氧发酵营养液， 其 中通常包括但不限于选自以下组的组分： 糖蜜(优选为糖蜜的含糖量45)、 氢氧化钠、 碳 酸氢铵、 磷酸二氢钾、 磷酸氢二钾、 硫酸镁、 硫酸亚铁、 硫酸锰、 氯化钙， 以及纯净水。 0037 当在本发明的用于制备复合菌液B的厌氧发酵营养液中使用时， 上述组分的含量 说明书 5/11 页 7 CN 110106106 A 7 可以相互独立地如下所示： 纯净水90。

34、01100重量份， 糖蜜100140重量份， 氢氧化钠0.9 1.1重量份， 碳酸氢铵3.03.8重量份， 磷酸二氢钾0.20.6重量份， 磷酸氢二钾0.20.6 重量份， 硫酸镁0.0850.095重量份， 硫酸亚铁0.240.25重量份， 硫酸锰0.010.015重 量份， 氯化钙0.0040.008重量份。 在一些具体实施方案中， 上述组分的具体含量可以相互 独立地如下所示： 纯净水1000重量份， 例如1000L； 糖蜜120重量份， 例如120kg； 氢氧化钠1重 量份， 例如1kg； 碳酸氢铵3.4重量份， 例如3.4kg； 磷酸二氢钾0.4重量份， 例如0.4kg； 磷酸氢 二钾。

35、0.4重量份， 例如0.4kg； 硫酸镁0.088重量份， 例如88g； 硫酸亚铁0.245重量份， 例如 245g； 硫酸锰0.013重量份， 例如13g； 氯化钙0.006重量份， 例如6g。 0038 所述用于制备复合菌液B的厌氧发酵营养液按以下制备： 将组成成分混合搅拌均 匀， 加热至100并持续煮沸46分钟， 例如5分钟后注入厌氧发酵容器内， 冷却至3045 ， 优选为3242， 更优选为3640， 例如36、 37、 38、 39或40， 或上述范围内 的任意数值。 0039 在发酵完成以后， 在所制得的复合菌液B中活菌菌群总数2.0108CFU/ml， 其中 作为优势菌种的菌群数。

36、量各自独立地为： 地衣芽孢杆菌0.7106CFU/ml， 优选为0.8 106CFU/ml， 更优选为0.9106CFU/ml， 最优选为1.0106CFU/ml； 丁酸梭菌0.7 108CFU/ml， 优选为0.8108CFU/ml， 更优选为0.9108CFU/ml， 最优选为1.0 108CFU/ml； 乳酸杆菌0.7108CFU/ml， 优选为0.8108CFU/ml， 更优选为0.9 108CFU/ml， 最优选为1.0108CFU/ml； 奥尔森氏菌0.7106CFU/ml， 优选为0.8 106CFU/ml， 更优选为0.9106CFU/ml， 最优选为1.0106CFU/ml；。

37、 红蝽菌0.7 106CFU/ml， 优选为0.8106CFU/ml， 更优选为0.9106CFU/ml， 最优选为1.0 106CFU/ml。 在所制得的复合菌液B中还可以包含其他非优势菌种， 其中优势菌种所占菌群 总数的比例60。 0040 在经过步骤(2)的发酵以后， 在所得的复合菌液B中还可以包括有机酸成分。 所述 有机酸一般为C1-C8的一元、 二元或更多元的有机酸， 其上可任选地具有一个、 两个或更多 个取代基， 例如羟基、 氨基、 卤素等。 在优选的实施方案中， 所述有机酸是任选地具有一个、 两个或更多个取代基的C1-C4的一元、 二元或更多元的有机酸， 例如但不限于甲酸、 乙酸。

38、、 丙 酸、 丁酸、 乙二酸、 丙二酸、 丁二酸、 乳酸等。 在优选的实施方案中， 所述有机酸包括选自由甲 酸、 乙酸和/或乳酸组成的组中的一种或多种的混合物。 0041 当在所得的复合菌液B中存在时， 每一种有机酸的含量为1.012.0mmol/L， 优选 为1.010.0mmol/L， 更优选为1.08.0mmol/L， 最优选为1.06.0mmol/L。 在具体的实施 方案中， 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 甲酸的含量为1.010.0mmol/L， 优选为 1.08.0mmol/L， 更优选为1.06.0mmol/L， 再更优选为1.04.0mmol/L， 例如1.0 3.2mm。

39、ol/L。 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 乙酸的含量为1.010.0mmol/L， 优选 为1.08.0mmol/L， 更优选为1.06.0mmol/L， 再更优选为1.04.0mmol/L， 例如1.6 3.5mmol/L。 当在本发明的复合微生物菌剂中存在时， 乳酸的含量为1.010.0mmol/L， 优选 为1.08.0mmol/L， 更优选为2.06.0mmol/L， 再更优选为3.06.0mmol/L， 例如3.0 5.5mmol/L。 当在所得的复合菌液B中存在时， 有机酸的总含量为1.020.0mmol/L， 优选为 1.018.0mmol/L， 更优选为1.016.0m。

40、mol/L， 最优选为1.014.0mmol/L。 0042 在步骤(3)中， 制备解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌液。 首先将 说明书 6/11 页 8 CN 110106106 A 8 解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上。 在本发明中使用时， 所述NA固 体培养基代表加葡萄糖的营养琼脂培养基。 所述NA固体培养基可以使用本领域中常用的固 体培养基， 其中可以包括但不限于选自以下组的一种或更多种成分： 葡萄糖、 蛋白胨、 牛肉 膏、 琼脂， 和/或其他可用于菌种培养的成分， 例如氯化钠。 在一些实施方案中， 优选的NA固 体培养基成分。

41、为： 葡萄糖2.5g/L， 蛋白胨5g/L， 牛肉膏3g/L， 琼脂18g/L， pH 7.07.2。 培养 温度通常保持恒温在2832， 例如28、 29、 30、 31和32， 或上述范围内的任意数 值。 培养时长通常为7074小时， 例如70、 71、 72、 73和74小时， 或上述范围内的任意数值。 0043 其次， 将经固体培养基培养的解淀粉芽孢杆菌菌种接种于NB液体培养基中进行振 荡培养。 在本发明中使用时， 所述NB液体培养基代表加葡萄糖的营养肉汤培养基。 所述NB液 体培养基可以使用本领域中常用的液体培养基， 其中可以包括但不限于选自以下组的一种 或更多种成分： 葡萄糖、 蛋。

42、白胨、 牛肉膏， 和/或其他可用于菌种培养的成分， 例如氯化钠。 在 一些实施方案中， 优选的NB液体培养基成分为： 葡萄糖2.5g/L， 蛋白胨5g/L， 牛肉膏3g/L， pH 7.07.2。 在一些实施方案中， 所述NB液体培养基在115125的温度下灭菌2535分 钟。 0044 将经固体培养基培养的解淀粉芽孢杆菌菌种以5.010.0， 优选6.0 9.0， 更优选为7.08.0， 例如8.0的接种量接种于NB液体培养基中。 培养温度通常 保持恒温在2832， 例如28、 29、 30、 31和32， 或上述范围内的任意数值。 培养 时长通常为2226小时， 例如22、 23、 24、。

43、 25和26小时， 或上述范围内的任意数值。 振荡速度 通常为180220r/min， 例如180、 190、 200、 210和220r/min， 或上述范围内的任意数值。 0045 在发酵完成得到的解淀粉芽孢杆菌菌液中解淀粉芽孢杆菌1.4108CFU/ml， 优 选为1.6108CFU/ml， 更优选为1.8108CFU/ml， 最优选为2.0108CFU/ml。 0046 在步骤(4)中， 将步骤(2)制备的复合菌液B与步骤(3)制备的解淀粉芽孢杆菌菌液 相混合即得到本发明所述的复合微生物菌剂。 所述复合菌液B和所述解淀粉芽孢杆菌菌液 的混合比例通常为200:150:1， 优选为160:。

44、170:1， 更优选为140:180:1， 最优选为 120:180:1， 例如120:1、 110:1、 100:1、 90:1和80:1， 或上述范围内的任意数值。 0047 本发明提供了所述复合微生物菌剂在草莓种植中的应用。 本发明的复合微生物菌 剂可以在草莓种植的任意阶段进行施用以实现对草莓根部病原菌明显抑制和降解的作用， 同时对草莓的生长和物质代谢也具有明显的正向影响及促进作用， 可以大大促进草莓果实 品质的提高。 本专利所述复合生物菌剂产品具有各优势菌种间协同及互补性强， 所得到的 次生代谢产物丰富。 本专利所述复合微生物菌剂产品的生产工艺方法简单， 便于大规模生 产操作。 其中除。

45、解淀粉芽孢杆菌外， 其它菌种均可混合发酵， 且发酵时间较其它同类产品 短， 因而生产效率较高， 综合生产成本较低。 0048 例如可以在土壤准备阶段进行施用。 在一些实施方案中， 以每亩20L的用量， 复合 菌剂稀释200倍。 在清除了上一茬的残根和杂草， 施放了一定量的有机底肥并翻耕后， 将复 合菌剂稀释液浇灌于土壤中。 在土壤表面覆盖塑料地膜， 并将大棚密闭。 记录地膜下15cm 20cm土壤的温度。 当日平均温度累加至600时可掀去地膜。 待土壤湿度达到栽种幼苗时即 可实施草莓苗栽种。 0049 例如可以在生长阶段进行施用。 在一些实施方案中， 每隔2周， 以每亩10L的用量， 稀释10。

46、0倍对草莓实施根部滴灌。 说明书 7/11 页 9 CN 110106106 A 9 0050 为了使本发明的目的、 技术方案及优点更加清楚明白， 结合以下实施例， 对本发明 进一步地详细说明。 应当理解， 此处所描述的实施例仅仅用以解释本发明， 而不是限定本发 明。 实施例 0051 下面通过本发明的实施案例对本发明的技术方案进行完整详细的描述。 0052 在此所述的实施案例仅为本发明的部分实施例。 基于本发明中的实施例， 凡除本 发明团队人员外的其他人在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例， 都属 于本发明保护的范畴。 0053 实施例1.复合微生物菌剂的制备 如下制备复合微生。

47、物菌剂： (1)制备用于复合菌种A制备的厌氧发酵营养液： 将纯净水16L、 糖蜜4kg、 氢氧化钠 200g、 碳酸氢铵64g、 磷酸二氢钾0.8g、 磷酸氢二钾0.8g、 硫酸镁1.3g、 硫酸亚铁0.5g、 硫酸锰 0.25g、 氯化钙0.16g和碳酸钙100g相互混合为发酵营养液， 将发酵营养液加热至100并持 续煮沸5分钟后注入厌氧发酵容器内， 冷却至35。 (2)制备复合菌种A： 将地衣芽孢杆菌、 丁酸梭菌、 乳酸杆菌、 奥尔森氏菌、 红蝽菌菌种分 别按照5、 7.5、 15.5、 15、 3.8的比例接入厌氧发酵营养液中搅拌均匀， 保持发酵 容器内温度为35， 发酵72小时， 完成。

48、标准为pH4.55.0， 发酵罐内氧化还原电位值 (ORP)达到-100-200mV。 (3)制备用于复合菌液B制备的厌氧发酵营养液： 将纯净水1000L、 糖蜜(含糖量45) 120kg、 氢氧化钠1kg、 碳酸氢铵3.4kg、 磷酸二氢钾0.4kg、 磷酸氢二钾0.4kg、 硫酸镁88g、 硫 酸亚铁245g、 硫酸锰13g和氯化钙6g相互混合为发酵营养液， 将发酵营养液加热至100并 持续煮沸5分钟后注入厌氧发酵容器内， 待其冷却至38。 (4)制备复合菌液B： 将步骤(1)中制备所得复合菌种A 10L接入厌氧发酵营养液中搅拌 均匀， 此时发酵液pH调至7.07.5， 保持发酵容器内温度。

49、为38， 发酵10小时， 完成标准为 pH5.05.5， 发酵罐内氧化还原电位值(ORP)达到-100-200mV。 (5)制备解淀粉芽孢杆菌菌液： 将解淀粉芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于NA固体培养基上， 恒温30培养 72小时待用， 其中， NA固体培养基成分为： 葡萄糖2.5g/L， 蛋白胨5g/L， 牛肉膏 3g/L， 琼脂18g/L， pH 7.07.2。 取上述固体培养的菌种按8的接种量接种于NB液体培养基中， 于30， 200r/min条件下振荡培养24小时即为所需解淀粉芽孢杆菌菌液， 此时所得到的解淀粉 芽孢杆菌菌液中解淀粉芽孢杆菌2.0108CFU/ml， 其中如下制备NB液。

50、体培养基制备 方 法为： 将牛肉膏3g， 蛋白胨5g， 葡萄糖2.5g， 加蒸馏水定容至1L， 调pH值为7.0 7.2， 121灭菌30分钟后冷却。 (6)制备复合微生物菌剂： 取步骤(2)所述方法制备的复合菌液B 100L与步骤(3)制备 的解淀粉芽孢杆菌菌液1L混合即得到复合微生物菌剂的最终产品。 0054 经检测， 在所制得的复合微生物菌剂最终产品中， 活菌菌群总数2108CFU/ml， 其中作为优势菌的菌种数量为： 地衣芽孢杆菌1.0106CFU/ml， 丁酸梭菌1.0108CFU/ 说明书 8/11 页 10 CN 110106106 A 10 ml， 乳酸杆菌1.0108CFU/。