中药免疫增强剂及其在制备猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910343310.6 (22)申请日 2019.04.26 (71)申请人 商丘美兰生物工程有限公司 地址 476200 河南省商丘市柘城县高新技 术开发区株洲路9号 (72)发明人 焦金英魏曼姚奋卯李冰 孟祥张宁李沛泽李国辉 李自波 (74)专利代理机构 郑州大通专利商标代理有限 公司 41111 代理人 陈勇 (51)Int.Cl. A61K 39/39(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 1/。

2、12(2006.01) (54)发明名称 中药免疫增强剂及其在制备猪流行性腹泻 灭活疫苗中的应用 (57)摘要 本发明属于免疫药物技术领域， 公开了一种 中药免疫增强剂， 由四君子汤总多糖和四君子汤 总皂苷组成， 所述四君子汤总多糖和四君子汤总 皂苷各占所述免疫增强剂总重的50%。 利用该中 药免疫增强剂制备的猪流行性腹泻灭活疫苗， 可 发挥四君子汤中总多糖和总皂苷的免疫增强作 用， 对猪免疫系统的损伤也有一定地恢复作用。 效力检验结果表明： 相比商品化疫苗， 本发明猪 流行性腹泻灭活疫苗在免疫一个月后即可达到 较高的抗体保护水平， 并且抗体滴度维持时间 久， 持续维持高水平状态， 应用前景广。

3、阔。 权利要求书1页 说明书8页 CN 110101856 A 2019.08.09 CN 110101856 A 1.一种中药免疫增强剂， 其特征在于， 由四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷组成， 所述 四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷各占所述免疫增强剂总重的50%； 所述四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷均由以下重量份的中药原料提取： 党参60g、 白 术60g、 茯苓60g、 甘草30g； 所述四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷的提取步骤如下： 步骤1： 称取上述重量份的党参、 白术、 茯苓和甘草， 粉碎成粉， 加入纤维素酶、 半纤维素 酶和淀粉酶， 进行酶解； 所述纤维素酶、 半纤维素酶和淀粉酶的质。

4、量比为0.61.8： 0.61.8： 0.61.8； 所述酶解的条件如下： 酶解温度为4555， 酶解时间为26h， pH为3.55.5， 料液 比为1： 48； 步骤2： 酶解后， 加热至沸腾使酶失活， 离心取上清液， 萃取得粗多糖和粗皂苷； 步骤3： 将粗多糖和粗皂苷分别过Sephadex G-100和AB-8型树脂层析柱， 分别纯化， 得 到固体状的四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷。 2.根据权利要求1所述的中药免疫增强剂， 其特征在于， 所述纤维素酶、 半纤维素酶和 淀粉酶的质量比为1.8： 1.2： 1.2。 3.根据权利要求1所述的中药免疫增强剂， 其特征在于， 所述酶解条件如下： 。

5、酶解温度 为50， 酶解时间为6h， pH为4.5， 料液比为1： 6。 4.权利要求13任一项所述的中药免疫增强剂在制备猪流行性腹泻灭活疫苗中的应 用， 其特征在于， 所述制备猪流行性腹泻灭活疫苗的步骤如下： 步骤A： 称取已灭活的猪流行性腹泻抗原液， 按照四君子汤总多糖0.1%5%、 四君子汤总 皂苷0.1%5%、 白油佐剂6080%和乳化剂10%30%称取原料， 所述已灭活的猪流行性腹泻抗 原液的质量为白油佐剂和乳化剂总质量的二分之一； 步骤B： 将总多糖和总皂苷溶于已灭活的猪流行性腹泻抗原液中， 得水溶液A； 白油佐剂 与乳化剂二者混合后， 高压灭菌， 得乳液B； 步骤C： 按1： 2。

6、的体积比将溶液A与乳液B混合得乳液C； 步骤D： 将乳液C过高压均质机进行均质化， 经23次均质化后得到猪流行性腹泻灭活疫 苗。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于， 所述乳化剂选自聚山梨酯-80、 月桂酸单甘 油酯、 单油酸甘油酯、 失水山梨醇单油酸酯、 硬脂酸铝、 月桂酸钠或十二烷基磺酸钠中的一 种或多种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110101856 A 2 中药免疫增强剂及其在制备猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用 技术领域 0001 本发明属于免疫药物技术领域， 涉及一种中药免疫增强剂及其在制备猪流行性腹 泻灭活疫苗中的应用。 背景技术 0002 猪流行性腹泻(Porcin。

7、e epidemic diarrhea， PED)主要是因为其感染了冠状病毒 而导致的一种常见病， 这种病毒一旦进入到猪的体内就会迅速地在肠道部位聚集， 其繁殖 速度比较快， 能够在较短时间内大面积繁殖。 生猪在感染该病毒后， 会在短时间内发作， 而 且该病毒的传播速度也比较快， 其能在较短的时间内， 传播给其它的生猪， 进而造成整个猪 群的感染。 流行性腹泻的发病率和感染率都较高， 死亡率也最高， 即使痊愈后也会生长缓慢 或是发育不良， 而接种疫苗是预防猪流行性腹泻的有效措施。 0003 疫苗免疫效果受多方面因素影响， 如疫苗本身差异、 个体的差异、 母源抗体水平的 影响、 接种方法等。 有。

8、些猪场免疫采用基因缺失疫苗， 这类疫苗免疫原性较低， 因此需要一 种有效的佐剂能激活潜在的免疫反应。 佐剂是一种潜在的免疫调节剂， 尤其中药类免疫增 强剂， 如蜂胶免疫佐剂、 人参皂苷佐剂、 当归多糖-内酯复合免疫佐剂等等， 它们都是利用中 药有效成分激活机体免疫实来现免疫佐剂作用的， 因其具有资源丰富、 毒性小、 功能广等特 点， 成为近年来研究的热点。 0004 四君子汤是中医益气健脾的基本方， 也是经典的补益方剂， 含有皂甙、 黄芩素、 葡 萄糖甙、 生物碱及糖类、 苍术醇、 苍术酮等， 并含有维生素A、 茯苓聚糖、 三萜羧酸、 茯苓酸、 甘 草皂苷等成分， 含量最多的成分群为多糖， 其。

9、免疫调节活性是目前研究的热点。 研究表明四 君子汤总多糖对免疫系统的损伤具有不同程度的恢复作用， 对免疫损伤模型的免疫器官/ 组织(如脾脏、 肠道组织等)、 免疫器官组织中的免疫细胞的细胞水平(如CD3+、 CD19+、 IgA+细 胞等)、 免疫细胞分泌的细胞因子等均具有一定的改善作用。 0005 肠道免疫是肠道除消化吸收功能外的另一主要功能， 肠道免疫占全身免疫功能的 70， 在免疫防御中起重要作用。 肠道免疫系统按解剖和功能可分为诱导部位和效应部位。 研究发现， 四君子汤总多糖在肠道免疫的诱导部位及效应部位均能产生免疫应答， 推测四 君子汤多糖能激活肠道免疫的诱导部位和效应部位， 发挥肠。

10、道免疫作用。 目前， 未见将四君 子汤总多糖和总皂苷的肠道免疫活性与猪流行性腹泻灭活疫苗相结合起来以提高免疫效 果的研究报道。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种免疫作用好的中药免疫增强剂及其在制备猪流行性 腹泻灭活疫苗中的应用。 0007 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 本发明提供一种中药免疫增强剂， 由四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷组成， 所述四 君子汤总多糖和四君子汤总皂苷各占所述免疫增强剂总重的50； 说明书 1/8 页 3 CN 110101856 A 3 所述四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷均由以下重量份的中药原料提取： 党参60g、 白 术60g、 茯苓60g。

11、、 甘草30g； 所述四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷的提取步骤如下： 步骤1： 称取上述重量份的党参、 白术、 茯苓和甘草， 粉碎成粉， 加入纤维素酶、 半纤维素 酶和淀粉酶， 进行酶解； 所述纤维素酶、 半纤维素酶和淀粉酶的质量比为0.61.8： 0.6 1.8： 0.61.8； 所述酶解的条件如下： 酶解温度为4555， 酶解时间为26h， pH为3.5 5.5， 料液比为1： 48； 步骤2： 酶解后， 加热至沸腾使酶失活， 离心取上清液， 萃取得粗多糖和粗皂苷； 步骤3： 将粗多糖和粗皂苷分别过Sephadex G-100和AB-8型树脂层析柱， 分别纯化， 得 到固体状的四君子汤总多。

12、糖和四君子汤总皂苷。 0008 优选地， 所述纤维素酶、 半纤维素酶和淀粉酶的质量比为1.8： 1.2： 1.2。 0009 优选地， 所述酶解条件如下： 酶解温度为50， 酶解时间为6h， pH为4.5， 料液比为 1： 6。 0010 本发明还提供上述中药免疫增强剂在制备猪流行性腹泻灭活疫苗中的应用， 所述 制备猪流行性腹泻灭活疫苗的步骤如下： 步骤A： 称取已灭活的猪流行性腹泻抗原液， 按照四君子汤总多糖0.15、 四君子 汤总皂苷0.15、 白油佐剂6080和乳化剂1030称取原料， 所述已灭活的猪 流行性腹泻抗原液的质量为白油佐剂和乳化剂总质量的二分之一； 步骤B： 将总多糖和总皂苷。

13、溶于已灭活的猪流行性腹泻抗原液中， 得水溶液A； 白油佐剂 与乳化剂二者混合后， 高压灭菌， 得乳液B； 步骤C： 按1： 2的体积比将溶液A与乳液B混合得乳液C； 步骤D： 将乳液C过高压均质机进行均质化， 经23次均质化后得到猪流行性腹泻灭活 疫苗。 0011 优选地， 所述乳化剂选自聚山梨酯-80、 月桂酸单甘油酯、 单油酸甘油酯、 失水山梨 醇单油酸酯、 硬脂酸铝、 月桂酸钠或十二烷基磺酸钠中的一种或多种。 0012 中药中植物药占99， 植物细胞由细胞壁及原生质体组成。 细胞壁是由纤维素、 半 纤维素、 果胶质、 木质素等物质构成的紧密结构， 一般分为3层， 即胞间层、 初生壁和次生。

14、壁。 胞间层的主要成分为果胶质。 初生壁主要由纤维素、 半纤维素和果胶质组成。 初生壁的结构 甚为复杂， 由纤维素分子组成的微纤丝构成了其基本骨架， 在微纤丝之间的空隙中， 填着果 胶质和半纤维素的胶体状物质。 和初生壁一样， 次生壁的骨架也是由纤维素分子组成的微 纤丝构成。 中药提取过程中， 细胞原生质体中的有效成分向提取介质扩散时， 必须克服细胞 壁及细胞间质的双重阻力。 中药酶法提取是在传统溶剂提取方法的基础上， 根据植物药材 细胞壁的构成， 利用酶反应所具有的高度专一性等特点， 选择相应的酶， 将细胞壁组成成分 水解或降解， 破坏细胞壁结构， 使有效成分充分暴露出来， 溶解、 混悬或胶。

15、溶于溶剂中， 从而 达到提取细胞内有效成分的目的。 0013 相比现有技术， 本发明的有益效果在于： 本发明采用四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷， 经合理配比得到本发明中药免疫增强 剂， 利用其制备的猪流行性腹泻灭活疫苗， 可发挥四君子汤总多糖和四君子汤总皂苷的免 疫增强作用， 对猪免疫系统的损伤也有一定地恢复作用。 效力检验结果表明： 相比商品化疫 说明书 2/8 页 4 CN 110101856 A 4 苗， 本发明猪流行性腹泻灭活疫苗在免疫一个月后即可达到较高的抗体保护水平， 并且抗 体滴度维持时间久， 持续维持高水平状态， 应用前景广阔。 0014 本发明采用复合酶法提取四君子汤总多糖和。

16、四君子汤总皂苷， 选用纤维素酶、 半 纤维素酶及淀粉酶作用于药用植物细胞， 使细胞壁及细胞间质节后产生局部疏松、 膨胀、 崩 溃等变化， 减小细胞壁、 细胞间质等传质屏障， 减小有效成分从胞内向提取介质扩散的传质 阻力， 从传质角度来提高提取率。 具体实施方式 0015 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限定本发明的保护范围。 若未特别指明， 实 施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 下述实施例中的试验方法， 如 无特别说明， 均为常规方法。 0016 实施例1酶法提取四君子汤总多糖及四君子汤总皂苷 称取党参60g、 白术60g、 茯苓60g、 甘草30g， 粉碎成粉， 加入。

17、一定量的复合酶， 在固定时 间、 温度、 pH值条件下进行酶解。 0017 (1)复合酶配比正交试验 在pH4.5， 料液比1:8， 提取温度55， 提取时间90min的条件下， 按照复合酶处理方 法， 分别选择不同质量百分比的纤维素酶， 半纤维素酶和淀粉酶进行复合酶配比正交试验 设计， 确定最佳复合酶配比。 试验因素和水平设计见表1。 0018 复合酶配比正交试验结果： 根据正交试验设计， 由硫酸-苯酚法测定四君子汤多糖 含量确定复合酶的最佳配比。 试验结果分析见表2。 根据极差可知， 对多糖提取率的影响顺 序为： 纤维素酶半纤维素酶淀粉酶， 最佳复合酶配比为A3B2C2， 即纤维素酶质量分。

18、数为 1.8， 半纤维素酶和淀粉酶质量分数为1.2。 0019 表1复合酶配比因素水平表 表2复合酶配比正交试验结果 说明书 3/8 页 5 CN 110101856 A 5 (2)酶法提取工艺正交试验 在已确定的复合酶配比条件下， 进一步对提取温度、 酶作用时间， 酶作用pH值和料液比 等因素， 进行正交试验因素设计。 试验因素和水平设计及结果见表3和表4。 0020 表3酶法提取工艺因素水平表 表4酶法提取工艺正交试验结果 说明书 4/8 页 6 CN 110101856 A 6 由表4可知， 各个因素对酶法提取四君子汤多糖的影响顺序为提取温度pH值提取时 间料液比， 最佳复合酶法提取条件。

19、为A2B3C2D2， 即酶解温度50， 酶解pH值为4.5， 酶解时间 为6h， 料液比为1:6。 在此条件下四君子汤总多糖的得率为20.62， 四君子汤总皂苷的得率 18.76。 0021 (3)粗多糖及粗皂苷的分离 酶解一定时间后， 加热提取液至沸腾， 保持10分钟， 使酶失活， 离心， 取上清液。 将酶法 提取得到的上清液用乙醚萃取2次， 除去脂质成分， 取水层， 用水饱和的正丁醇萃取4次， 分 别收集水层和丁醇层， 丁醇层继续水洗2次， 将得到的含多糖的水层和含皂苷的丁醇层液体 分别于55真空浓缩干燥， 得粗多糖和粗皂苷。 0022 (4)粗多糖的纯化 将已处理好Sephadex G-。

20、100装入层析柱(1.3100cm)中， 以去离子水(过0.22 m滤膜) 平衡过夜。 将粗多糖溶于蒸馏水中， 以15000rpm离心20min后， 样品上柱。 先用水洗脱一个柱 体积500ml， 再用盐梯度洗脱， 盐梯度为0-2M NaCl， 洗脱体积500-1000ml。 最后用2M NaCl冲 洗柱子。 流速为4mL/min， 以10mL/tube接受洗脱液。 透析3天后， 冻干得纯化后的四君子汤总 多糖。 0023 (5)粗皂苷的纯化 取AB-8型树脂适量， 置于烧杯中， 用95的乙醇浸泡24h后， 将树脂湿法装柱于干净的 层析柱中， 使其液面高出树脂表面30cm， 浸泡45h， 用9。

21、5乙醇以2BV/h的流速洗脱， 至洗 脱液与水混合(1： 5)不呈现白色浑浊， 用水以同样的流速将乙醇洗净。 将粗皂苷溶于蒸馏水 说明书 5/8 页 7 CN 110101856 A 7 中， 以15000rpm离心20min后， 样品上柱。 用65的乙醇溶液洗脱， 洗脱流速为4mL/min， 收集 洗脱液， 用旋转蒸发仪挥去乙醇， 冻干得纯化后的四君子汤总皂苷。 0024 实施例2制备猪流行性腹泻灭活疫苗 (1)猪流行性腹泻抗原的纯化 取少量流行性腹泻感染猪病料， 制成病料悬液， 在Vero传代细胞培养液中进行传代培 养， 随后与DMEM基础培养液以1： 5比例接种至单层的PK-15细胞， 。

22、37孵育2h， 换细胞培养维 持液培养18h后， 按Tischer法加入适量300mmol/L D-氨基葡萄糖， 于相同条件下处理 30min， 弃去D-氨基葡萄糖， PBS轻洗2次， 换含2胎牛血清的细胞培养维持液继续培养48h， 收获病毒。 0.2甲醛37灭活48h， 经无菌检验和灭活检验。 0025 (2)制备猪流行性腹泻灭活疫苗 白油佐剂购自河南通商进出口有限公司， 聚山梨酯-80购自天津市风船化学试剂科技 有限公司， 失水山梨醇单油酸酯购自天津市天力化学试剂有限公司， 单油酸甘油酯购自上 海麦克林生化科技有限公司。 0026 制备步骤如下： 步骤A： 称取已灭活的猪流行性腹泻抗原液5。

23、00ml， 四君子汤总多糖30g， 四君子汤总皂 苷30g， 白油佐剂800ml， 失水山梨醇单油酸酯150g， 聚山梨酯-80 40g， 单油酸甘油酯10g。 0027 步骤B： 将总多糖和总皂苷溶于已灭活的猪流行性腹泻抗原液中， 得水溶液A； 白油 佐剂与乳化剂二者混合后， 高压灭菌， 得乳液B； 步骤C： 按1： 2的体积比将水溶液A与乳液B混合得乳液C； 步骤D： 将乳液C过高压均质机(型号： JJ-1/25， 金坛市富瑞实验仪器厂)进行均质化， 经 23次均质化后得到制成双向油乳剂猪流行性腹泻灭活疫苗。 0028 实施例3猪流行性腹泻灭活疫苗实验前检查 (1)外观均匀乳白色乳剂， 瓶。

24、间颜色一致。 0029 (2)剂型为油包水型， 取少量疫苗滴于冷水表面， 除第一滴呈现云雾状扩散外， 均 不扩散。 0030 (3)稳定性取疫苗10ml加入15ml离心管中， 经3000r/min离心15分钟后， 疫苗不分 层， 稳定性良好。 0031 (4)粘度用内径为1.2mm吸管吸取疫苗1ml在室温下令其垂直流出， 流出0.4ml的时 间为4.55.5s， 适合注射使用。 0032 (5)无菌检验将制备好的疫苗接种于含5血清和0.01NDA的TSA平板， 37培养 24h后无菌落生长； 将制备好的疫苗接种于含5血清和0.01NDA的TSB液体培养基中， 置 于37恒温摇床中培养过夜， 无。

25、细菌生长。 0033 实施例4猪流行性腹泻灭活疫苗实验室安全检验 (1)安全检验试验方法 选用3日龄PEDV ELISA抗体阴性和PEDV抗原阴性的健康易感仔猪4头， 各后海穴注射疫 苗2.0ml， 连续观察14日。 0034 (2)安全检验试验结果 实验室安全检验结果显示， 免疫猪4/4健活， 所有免疫猪精神状态、 行为活动和饮食正 常； 呼吸和体温均在正常范围内； 无全身反应； 接种部位无其它不良反应。 说明书 6/8 页 8 CN 110101856 A 8 0035 实施例5猪流行性腹泻灭活苗实验前检查 (1)实验室效力检验试验方法 试验用3日龄的PEDV抗原阴性和PEDV抗体阴性的健。

26、康易感仔猪15头， 随机分为3组， 每 组5头。 第1组为免疫组， 第2组为攻毒对照组， 第3组作为空白对照组。 第1组免疫组， 每头于 后海穴注射疫苗1.0ml， 14日后用相同剂量二免， 于二免3周后， 对所有组猪称重， 采血， 测定 血清中的PEDV抗体效价。 第1、 2组各用PEDV病毒液(含106.0TCID50/ml)攻毒， 每头猪滴鼻 1.0ml、 肌肉注射2.0ml。 第3组空白对照组， 不免疫， 不攻毒。 与第1组、 第2组相同的时间称 重， 采血， 测定血清中的PEDV抗体效价。 0036 3组猪分别隔离饲养。 攻毒后逐日测定体温并观察25天， 攻毒到期后对所有猪称重 后扑。

27、杀、 剖检。 根据体温、 相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定。 0037 (2)实验室效力检验试验结果 第1组免疫组猪二免后5/5PEDV抗体滴度1:800， 结果见表5。 0038 表5二免后猪抗体滴度(OD值) 样品OD630值大于0.4， 判定为阳性； 样品OD630值在0.2到0.4之间， 判定为可疑； 样品 OD630值小于0.2， 判为阴性。 0039 由表5可见， 阴性对照OD值均小于0.2， 阳性对照OD值均大于2， 免疫组5头猪抗体滴 度小于1： 1600时， OD630值均大于0.4， 表明抗体水平较高， 效力检验试验结果说明： 含四君 子汤总多糖及总皂苷的猪流行性腹泻灭。

28、活苗免疫猪可获得较高的抗体。 0040 实施例6猪流行性腹泻灭活疫苗普通猪场安效检试验 (1)普通猪场猪流行性腹泻灭活疫苗免疫试验方法 选取大小体重相近的3日龄健康商品仔猪100头， 进行随机分成2组， 每组50头， 其中第1 组接种本发明猪流行性腹泻灭活疫苗1ml/次； 第2组为对照组， 免疫接种商品化流行性腹 泻-猪流行性腹泻二联灭活苗(购自成都天邦生物制品有限公司)。 疫苗接种方式为后海穴 注射， 第一次接种2周后， 以相同方法相同剂量再接种一次， 再次接种后继续观察两周。 0041 (2)普通猪场免疫猪流行性腹泻灭活疫苗的安全检验结果 仔猪注射后连续观察14日， 所有免疫猪， 精神状态。

29、、 行为活动和饮食正常； 呼吸和体温 说明书 7/8 页 9 CN 110101856 A 9 均在正常范围内； 无全身反应； 接种部位无其它不良反应。 本发明灭活疫苗组和商品化疫苗 组试验猪每组随机抽取5头进行系统尸检。 0042 结果表明免疫组疫苗注射局部吸收良好， 无炎性结节和残留； 气管支气管淋巴结、 腹股沟淋巴结和肠系膜淋巴结均无肿大、 出血点等异常变化， 肺、 肾、 脾和扁桃体等脏器均 无水肿、 实变、 坏死或出血点异常病理变化， 与对照组无明显差异。 说明注射本发明猪流行 性腹泻灭活疫苗， 不会引起不良的过敏反应， 可安全进行临床应用。 0043 (3)普通猪场免疫猪流行性腹泻灭。

30、活疫苗的效力检验结果 试验组及对照组猪免疫前(0日)、 免疫后14日、 35日、 2月、 4月、 6月抗体检测结果见表6。 免疫前(0日)抗体检测结果显示部分试验猪PEDV ELISA抗体阳性， 表明试验猪场存在PEDV 感染， 但抗体滴度较低。 仔猪接种本发明疫苗后14日后， 即可检测到PEDV ELISA抗体， 抗体 滴度明显升高， 且本发明灭活疫苗组免疫滴度高于商品化疫苗组； 免疫后35日， 平均抗体滴 度1:16001:2000， 抗体阳性率为100， 达到保护标准， 但是商品化疫苗组抗体滴度明显 低于本发明灭活疫苗组。 在此后6个月的抗体检测期中， 平均抗体滴度均在保护标准(1: 8。

31、00)以上， 但商品化疫苗组免疫抗体滴度下降速度明显高于本发明灭活疫苗组。 普通猪场 疫苗免疫的效力检测结果说明， 本发明猪流行性腹泻灭活疫苗在免疫一个月后即可达到较 高的抗体保护水平， 并且抗体滴度维持时间久， 持续维持高水平状态。 0044 表6免疫猪抗体检测结果 以上所述之实施例， 只是本发明的较佳实施例而已， 仅仅用以解释本发明， 并非限制本 发明实施范围， 对于本技术领域的技术人员来说， 当然可根据本说明书中所公开的技术内 容， 通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式， 故凡在本发明的原理上所作的变化 和改进等， 均应包括于本发明申请专利范围内。 说明书 8/8 页 10 CN 110101856 A 10 。