发酵蔬菜的混合益生菌、发酵蔬菜及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379386.4 (22)申请日 2019.05.08 (83)生物保藏信息 CGMCC No.16727 2018.11.12 CGMCC No.16728 2018.11.12 (71)申请人 北京农学院 地址 101000 北京市昌平区回龙观镇北农 路7号 (72)发明人 高秀芝康建依易欣欣范双喜 金君华谢远红刘慧张红星 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 刘奇 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A23L 1。

2、9/20(2016.01) A23L 33/00(2016.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/25(2006.01) (54)发明名称 一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发酵蔬菜及其 制备方法 (57)摘要 本发明涉及一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发 酵蔬菜及其制备方法， 属于蔬菜发酵技术领域。 本 发 明 所 述 发 酵 蔬 菜 的 混 合 益 生 菌 由 LactobacillusdiolivoransV73和植物乳杆菌 LactobacillusplantarumV02组成。 利用本发 明所述混合益生菌发酵得到的发酵蔬菜具有调 节肠道菌群的功能， 预防心血管疾病， 有。

3、利于人 体健康， 并且人工接种发酵蔬菜可强化发酵， 降 低亚硝酸盐含量， 缩短发酵周期， 提高产品质量， 降低生产成本。 权利要求书1页 说明书6页 CN 110106112 A 2019.08.09 CN 110106112 A 1.一种发酵蔬菜的混合益生菌， 其特征在于， 所述混合益生菌由Lactobacillus diolivorans V73和植物乳杆菌Lactobacillusplantarum V02组成； 所述Lactobacillus diolivorans V73的生物保藏编号为CGMCC No.16728； 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V0。

4、2的生物保藏编号为CGMCC No.16727。 2.基于权利要求1所述混合益生菌的发酵蔬菜的方法， 包括以下步骤： 将权利要求1所述混合益生菌接种于花椒水和食盐的混合溶液中， 得到发酵溶液， 将发 酵溶液与蔬菜混合后在2025， 发酵3d5d。 3.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述接种的量为0.450.5。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述混合益生菌中， 所述植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum V02的体积分数为3035， 所述Lactobacillus diolivorans V73的体积分数为6570， 所述植物乳杆菌Lactoba。

5、cillusplantarum V02混合前的菌液 浓度为(1.62.5)109CFU/mL， 所述Lactobacillus diolivorans V73混合前的菌液浓度 为(0.81.5)109CFU/mL。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述花椒水的制备方法包括： 将0.3 0.5干花椒， 0.10.3大料， 0.20.4姜片和98.899.4水混合， 加热煮沸 两次， 晾凉。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述花椒水的质量占蔬菜质量的80 120。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述食盐的质量占蔬菜质量的2 .5 3.5。 8.根据权利。

6、要求2所述的方法， 其特征在于， 所述蔬菜包括生菜、 香芹和胡萝卜的组合； 或生菜、 圆白菜、 香芹和胡萝卜的组合。 9.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述蔬菜在发酵前进行切丝。 10.权利要求29任一项方法制备得到的发酵蔬菜。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110106112 A 2 一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发酵蔬菜及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及蔬菜发酵技术领域， 具体涉及一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发酵蔬菜 及其制备方法。 背景技术 0002 发酵蔬菜是我国的一种传统的发酵食品， 历史悠久， 发酵蔬菜是指新鲜蔬菜在封 闭的坛中经复杂的微生物体系(由原材料携。

7、带进入)由微生物和酶的变化， 使最终产品的化 学成分等方面发生较大变化发酵而成的蔬菜制品。 发酵蔬菜可以延长生菜的贮藏期、 利于 运输、 周年均衡供应、 提高其附加值， 还可以改进蔬菜风味， 满足人们对蔬菜食品日益增长 的需要。 现有发酵蔬菜的方法有自然发酵和母水发酵， 大多数传统发酵食品的生产仍然是 依据经验， 这使得发酵过程难以控制， 同时发酵蔬菜的品质会受到发酵原料蔬菜种类、 盐浓 度、 生产季节等诸多因素的影响。 传统发酵方法生产的发酵蔬菜具有发酵周期较长、 品质不 稳定及高盐等不足。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发酵蔬菜及其制备方法。 本 发明。

8、所述混合益生菌腌制出的泡菜具有调节肠道菌群的功能， 预防心血管疾病， 有利于人 体健康， 并且人工接种发酵蔬菜可强化发酵， 降低亚硝酸盐含量， 缩短发酵周期， 提高产品 质量， 降低生产成本。 0004 本发明提供了一种发酵蔬菜的混合益生菌， 所述混合益生菌由Lactobacillus diolivorans V73和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02组成； 0005 所述Lactobacillus diolivorans V73的生物保藏编号为CGMCC No.16728； 0006 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02的生物保藏。

9、编号为CGMCC No.16727。 0007 本发明还提供了基于上述技术方案所述混合益生菌的发酵蔬菜的方法， 包括以下 步骤： 0008 将上述技术方案所述混合益生菌接种于花椒水和食盐的混合溶液中， 得到发酵溶 液， 将发酵溶液与蔬菜混合后在2025， 发酵35d。 0009 优选的是， 所述接种的量为0.450.5。 0010 优选的是， 所述混合益生菌中， 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02的 体积分数为3035， 所述Lactobacillus diolivorans V73的体积分数为6570， 所述 植物乳杆菌Lactobacillus plant。

10、arum V02混合前的菌液浓度为(1.62.5)109CFU/mL， 所述Lactobacillus diolivorans V73混合前的菌液浓度为(0.81.5)109CFU/mL。 0011 优选的是， 所述花椒水的制备方法包括： 将0.30.5干花椒， 0.10.3大 料， 0.20.4姜片和98.899.4水混合， 加热煮沸两次， 晾凉。 0012 优选的是， 所述花椒水的质量占蔬菜质量的80120。 说明书 1/6 页 3 CN 110106112 A 3 0013 优选的是， 所述食盐的质量占蔬菜质量的2.53.5。 0014 优选的是， 所述蔬菜包括生菜、 香芹和胡萝卜的组合。

11、； 或生菜、 圆白菜、 香芹和胡萝 卜的组合。 0015 优选的是， 所述蔬菜在发酵前进行切丝。 0016 本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的发酵蔬菜。 0017 本发明提供了一种发酵蔬菜的混合益生菌。 本发明将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02和Lactobacillus diolivorans V73混合对蔬菜进行发酵， 不仅可以抑制杂 菌繁殖， 保证产品品质， 利用本发明所述混合益生菌得到的发酵蔬菜具有调节肠道菌群的 功能， 预防心血管疾病， 有利于人体健康， 并且人工接种发酵蔬菜可强化发酵， 降低亚硝酸 盐含量， 缩短发酵周期， 提高产品质量， 。

12、降低生产成本。 试验结果表明， 利用本发明所述混合 益生菌对蔬菜进行发酵， 发酵时间仅需35d， 亚硝酸盐含量0.200.27mg/kg， 产品品质稳 定， 生产成本低。 0018 生物保藏说明 0019 植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02。 本菌种保藏在中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物 研究所， 保藏编号为CGMCC No.16727， 保藏时间为2018年11月12日。 0020 Lactobacillus diolivorans V73。 本菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微。

13、生物中心， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物研究所， 保 藏编号为CGMCC No.16728， 保藏时间为2018年11月12日。 具体实施方式 0021 本发明提供了一种发酵蔬菜的混合益生菌， 所述混合益生菌由Lactobacillus diolivorans V73和植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02组成； 0022 所述Lactobacillus diolivorans V73的生物保藏编号为CGMCC No.16728； 0023 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02的生物保藏编号为CGMCC No。

14、.16727。 0024 在本发明中， 两种乳酸菌均分离筛选于山西地方传统自然发酵蔬菜中， 并已于 2018年11月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 其保藏号分别 为： CGMCC No.16727(菌株V02)， CGMCC No.16728(菌株V73)。 在MRS琼脂培养基上， V02菌株 的菌落23mm， 菌落表面光滑， 边缘规则， 圆形凸起， 有光泽， 乳白色； 个体形态呈短杆状， 短 链状排列， G+无芽孢杆菌。 V73菌株的菌落11.5mm， 菌落表面略平滑， 边缘整齐， 圆形稍凸 起， 无光泽， 浅白色； 个体形态呈短杆状， G+无芽孢杆菌。 两个菌株的。

15、发酵上清液做抑菌谱， 其中V02对沙门氏菌、 单增李斯特氏菌、 金黄色葡萄球菌、 粪肠球菌有抑制作用， V73对沙门 氏菌和单增李斯特氏菌有抑制作用。 0025 本发明对两种乳酸菌菌液的制备方法没有特殊限定， 采用本领域技术人员熟知的 常规发酵方法进行培养即可。 具体地， 在本发明中， 两种乳酸菌活化及发酵液的制备步骤优 选如下： 0026 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)V02： 将-80下甘油保藏的植物乳杆菌 V02平板涂布， 取单菌落转接入50mL MRS液体培养基的250ml锥形瓶中， 37， 150r/min 说明书 2/6 页 4 CN 11010611。

16、2 A 4 180r/min的摇床上培养10h14h； 以25的接菌量扩大培养V02到50ml的MRS液体培养 基中， 培养时间10h12h。 0027 乳杆菌(Lactobacillus diolivorans)V73： 将-80下甘油保藏的乳杆菌V73平板 涂布， 取单菌落转接入50mL MRS液体培养基的250ml锥形瓶中， 37， 150r/min180r/min 的摇床上培养10h14h； 以25的接菌量扩大培养V73到50ml的MRS液体培养基中， 培 养时间22h24h。 0028 在本发明中， 两种菌株的组合发酵得到的蔬菜可以维持人体肠道菌群微生态平 衡、 提高机体免疫力、 减。

17、少有害菌数量、 预防腹泻、 预防心血管疾病和胃肠道疾病等。 0029 本发明还提供了基于上述技术方案所述混合益生菌的发酵蔬菜的方法， 包括以下 步骤： 0030 将上述技术方案所述混合益生菌接种于花椒水和食盐的混合溶液中， 得到发酵溶 液， 将发酵溶液与蔬菜混合后优选在2025， 发酵35d， 更优选为22发酵4d。 0031 在本发明中， 所述接种的量优选为0.450.5。 0032 在本发明中， 所述混合益生菌中， 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02 的体积分数为3035， 所述Lactobacillus diolivorans V73的体积分数为6570。

18、， 优 选的， 本发明所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02和Lactobacillus diolivorans V73的混合体积比优选为1:2； 所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum V02混合前的菌液浓度为(1.62.5)109CFU/mL， 所述Lactobacillus diolivorans V73 混合前的菌液浓度为(0.81.5)109CFU/mL。 0033 在本发明中， 所述花椒水的制备方法优选包括： 将0.30.5干花椒， 0.1 0.3大料， 0.20.4姜片和98.899.4水混合， 加热煮沸两次， 晾凉。 本发明对。

19、所 述干花椒、 大料和姜片的来源没有特殊限定， 采用本领域技术人员熟知的常规干花椒、 大料 和姜片的常规市售产品即可。 在本发明中， 所述水优选为纯净水。 在本发明中， 所述晾凉优 选为晾凉至3040以下。 0034 在本发明中， 所述花椒水的质量占蔬菜质量的80120， 更优选的， 所述花椒水 与蔬菜的混合质量比为1:1。 在本发明中， 所述食盐的质量占蔬菜质量的2.53.5， 更优 选为3.0。 0035 本发明对所述蔬菜的种类没有特殊限定， 采用本领域技术人员熟知的蔬菜即可。 在本发明中， 所述蔬菜优选包括生菜、 香芹和胡萝卜 ； 或生菜、 圆白菜、 香芹和胡萝卜。 在本 发明中， 所述。

20、蔬菜优选在发酵前进行切丝。 本发明对所述发酵用装置没有特殊限定， 优选采 用本领域技术人员熟知的常规容器即可， 如泡菜坛子。 在本发明中， 发酵方式为厌氧发酵， 所述发酵装置优选放置在阴凉通风处。 0036 本发明还提供了上述技术方案所述方法制备得到的发酵蔬菜。 本发明得到的发酵 蔬菜具有调节肠道菌群的功能， 预防心血管疾病， 有利于人体健康， 产品品质高。 0037 下面结合具体实施例对本发明所述的一种发酵蔬菜的混合益生菌、 发酵蔬菜及其 制备方法做进一步详细的介绍， 本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。 0038 实施例1 0039 发酵蔬菜制作方法 0040 (1)将来源于发酵蔬菜的。

21、6株乳酸菌V02、 V22、 V53、 V66、 V71和V73分别用于发酵蔬 说明书 3/6 页 5 CN 110106112 A 5 菜实验中， 根据发酵蔬菜的风味， 筛选出发酵蔬菜效果较好的三株乳酸菌V71、 V73和V02， 并 将其分别进行单一菌种和不同乳酸菌株等比例组合发酵蔬菜实验。 0041 根据发酵蔬菜的色泽、 香气、 滋味和口感进行感官评价和pH测定， 评定小组为专业 的评价人员所构成(即由受过专业感官评价培训的人员组成)， 共有10人， 采用描述性的检 测方法分别对样品的色泽、 香气、 滋味和口感进行细致的描述， 以感官评价的结果作为益生 菌发酵蔬菜的评定标准。 益生菌发酵。

22、蔬菜的感官评定标准及评价指标见表1。 0042 根据表1感官评定标准作为评价益生菌发酵蔬菜感官品质的试验指标， 通过感官 评价结果和pH(酸度终点pH值3.6)， 组合发酵V02和V73的感官评价结果最好， 达到发酵酸 度终点时间较快， 最终筛选出其用于后续发酵。 0043 表1益生菌发酵蔬菜感官评价评定标准 0044 0045 (2)乳酸菌菌株的培养及活菌计数 0046 将-80下甘油保藏的V02和V73转接活化后， 经灭菌MRS液体培养基扩大培养， 各 取1mL菌液于9mL灭菌生理盐水管， 制成10-1的均匀稀释液， 做10倍递增稀释至10-8； 取10-6 10-8的稀释液各1mL置于无。

23、菌平皿中， 倒入溶化并冷却至44的灭菌MRS培养基约15mL， 迅速 轻轻旋动平皿， 使培养基与菌液充分混匀， 每个稀释度3次重复。 同时将灭菌MRS培养基注入 加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。 待培养基凝固后， 倒置平板， 置(361) 温箱中培养(482)h， 待菌落长出后即可计数。 依据MRS平板计数结果， 植物乳杆菌V02 Lactobacillus plantarum活菌数量为(1.72.3)109CFU/ml， V73 Lactobacillus 说明书 4/6 页 6 CN 110106112 A 6 diolivorans活菌数量为(11.4)109CFU/ml。。

24、 0047 (3)乳酸菌接种量的确定 0048 两种乳酸菌株等浓度发酵， 选择以蔬菜总重量为百分比的接种量梯度0.35、 0.4、 0.45、 0.5和0.55分别用于发酵蔬菜实验中， 根据发酵蔬菜的色泽、 香气、 滋味 和口感评价结果， 以较优接种量制作的益生菌发酵蔬菜产品， 其颜色均匀， 蔬菜有光泽， 无 霉斑， 有浓郁香味， 味道爽口、 酸咸度适中、 口感清脆， 感官评定分数最高， 最终选择接种量 为0.450.5。 0049 (4)益生菌发酵蔬菜制作工艺 0050 1)益生菌发酵蔬菜制作工艺： 将新鲜生菜、 香芹和胡萝卜(质量比为8:1:1)洗净切 丝放入坛子中备用； 制备花椒水(蔬菜。

25、总质量： 花椒水1:1)， 将0.30.5干花椒， 0.10.3大料和0.20.4姜片等放于98.899.4纯净水中， 加热煮沸两次， 晾凉至40以下备用。 将2.83.2(以下均以蔬菜总质量为百分比)食用盐融于花椒水 中， 并加入0.450.5的两种乳酸菌混合发酵液(体积比V02:V731:2)， 将蔬菜总质量 和混合花椒水等比例， 混匀于坛中， 盖好放置于25阴凉通风地， 发酵3d5d。 0051 2)配方2的制作方法将1)中原料蔬菜换为新鲜生菜、 圆白菜、 香芹和胡萝卜(质量 比为4:4:1:1)， 其余方法一致。 0052 (5)益生菌发酵蔬菜中乳酸菌总数和pH值 0053 称取25g。

26、发酵蔬菜放入含有225mL灭菌生理盐水中， 采用拍击式匀质器以8000 10000r/min的速度处理10s， 充分振荡后， 制成10-1的均匀稀释液。 再以9mL灭菌生理盐水做 10倍递增稀释至10-11， 取10-610-9的稀释液各1mL置于无菌平皿中， 倒入溶化并冷却至46 的改良MRS培养基约15mL， 迅速轻轻旋动平皿， 使培养基与菌液充分混匀， 每个稀释度3次 重复。 同时将改良MRS培养基注入加有1mL无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。 待培养 基凝固后， 倒置平板， 置(361)温箱中培养(482)h， 待菌落长出后即可计数。 取50mL混 匀发酵液， 用pH计测定pH值并。

27、记录。 其平板菌落计数及pH值结果显示， 发酵主要原料为生 菜， 乳酸菌数为(3.54.5)108CFU/ml， 发酵5d时pH为3.23.4； 发酵主要原料为生菜和 圆白菜， 乳酸菌数为(5.56.6)108CFU/ml， 发酵5d时pH为3.23.4。 0054 (6)益生菌发酵蔬菜的亚硝酸盐测定 0055 称取5g(精确至0.001g)匀浆试样， 置于250mL具塞锥形瓶中， 加12.5mL50g/L饱和 硼砂溶液， 加入70左右的水约150mL， 混匀， 于沸水浴中加热15min， 取出置冷水浴中冷却， 并放置至室温。 定量转移上述提取液至200mL容量瓶中， 加入5mL106g/L亚。

28、铁氰化钾溶液， 摇 匀， 再加入5mL220g/L乙酸锌溶液， 以沉淀蛋白质。 加水至刻度， 摇匀， 放置30min， 除去上层 脂肪， 上清液用滤纸过滤， 弃去初滤液30mL， 滤液备用。 0056 吸取40.0mL上述滤液于50mL带塞比色管中， 于标准管与试样管中分别加入2mL4g/ L对氨基苯磺酸溶液， 混匀， 静置3min5min后各加入1mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液， 加水至刻 度， 混匀， 静置15min， 用1cm比色杯， 以零管调节零点， 于波长538nm处测吸光度， 绘制标准曲 线比较。 同时做试剂空白。 亚硝酸盐标准曲线回归方程： y0.0477x， R20.9986， 。

29、发酵主要 原料为生菜， 发酵5d时亚硝酸盐含量为0.200.27mg/kg； 发酵主要原料为生菜和圆白菜， 发酵5d时亚硝酸盐含量为0.200.27mg/kg。 本发明接种发酵蔬菜0d5d发酵过程中亚硝 酸盐含量在0.100.27mg/kg范围内， 发酵过程中未出现 “亚硝峰” ， 亚硝酸盐含量较低且平 说明书 5/6 页 7 CN 110106112 A 7 稳； 自然发酵蔬菜0d5d发酵过程中亚硝酸盐含量在0.102.18mg/kg范围内， 自然发酵蔬 菜的亚硝酸盐含量高于接种发酵蔬菜， 自然发酵蔬菜1d时有 “亚硝峰” 达到2.18mg/kg， 但其 含量均在合理限量范围内(国家标准GB 2762-2017腌渍蔬菜亚硝酸盐含量低于20mg/kg)。 0057 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 110106112 A 8 。