青霉素酰化酶基因及其编码蛋白.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910385295.1 (22)申请日 2019.05.09 (71)申请人 福建医科大学附属口腔医院 地址 350000 福建省福州市鼓楼区杨桥中 路246号 (72)发明人 黄晓宇 (74)专利代理机构 福州君诚知识产权代理有限 公司 35211 代理人 戴雨君 (51)Int.Cl. C12N 9/84(2006.01) C12N 15/55(2006.01) (54)发明名称 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白 (57)摘要 本发明公开了青霉素酰化酶基因及其编码 蛋白， 。

2、所述青霉素酰化酶基因的核酸序列如SEQ IDNO.1所示， 该青霉素酰化酶基因的编码蛋白 具有如SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。 本发明 的青霉素酰化酶在工业实际应用中具有良好的 稳定性和活性。 权利要求书1页 说明书4页 序列表5页 附图1页 CN 110106161 A 2019.08.09 CN 110106161 A 1.青霉素酰化酶基因， 其特征在于： 所述基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.如权利要求1所述的青霉素酰化酶基因所编码的蛋白， 其特征在于： 所述蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO.2所示。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110106161 A 。

3、2 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白 技术领域 0001 本发明涉及生物基因领域， 具体涉及青霉素酰化酶基因及其编码蛋白。 背景技术 0002 青霉素和头孢霉素同属于 -内酰胺抗生素， 被认为是最有发展前景的抗生素。 在 医药领域， -内酰胺抗生素的应用非常广泛， 工业产量很大， 创造了大量的经济价值。 但是 由于抗生素耐药性问题的存在， 需要不断地改进该类型抗生素的化学结构， 以提高其对耐 药菌的敏感性。 最有效的一个做法， 就是改变该类型抗生素的侧链基团， 进而改变其抗菌特 性。 而侧链基团的修饰， 常用的方法有化学法和酶法。 化学法的环境污染严重， 毒性大， 已经 逐渐被淘汰。 而酶法由于反。

4、应效率高， 环境友好， 备受推崇。 0003 青霉素酰化酶， 又称为青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。 该酶可以催化青霉素 或者头孢霉素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或者7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)， 也可以催 化青霉素酰基化反应， 进而由6-ACA或者7-ACA合成新型的抗生素。 由某些微生物产生的该 酶， 已大规模应用于工业生产 -内酰胺类抗生素的关键中间体和半合成 -内酰胺类抗生 素。 但是， 不同微生物来源的青霉素酰化酶， 在催化特性、 效率、 稳定性等等各方面， 具有不 同的特点， 因此适用于不同的应用场景。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供青霉素酰化酶基因及其编码。

5、蛋白。 0005 本发明所提供的青霉素酰化酶基因， 其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0006 本发明还提供了上述青霉素酰化酶基因所编码的蛋白,所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。 0007 本发明所述的青霉素酰化酶基因， 是从10份不同来源的牙面上的牙菌斑混合物 中， 通过宏基因组学技术， 使用试剂盒提取宏基因组DNA， 并直接对提取好的DNA进行PCR扩 增得到。 0008 本发明青霉素酰化酶基因编码的青霉素酰化酶能够在45环境中维持较高的活 性， 在日常储存和运输中， 表现出良好的稳定性， 满足工业实际应用的需求。 附图说明 0009 图1为实施例1步骤1中PCR。

6、产物的电泳图谱。 0010 图2为实施例1步骤1中重组质粒图谱。 具体实施方式 0011 以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。 以下未注明具体条件的实验方 法， 按照本领域常规实验条件或者制造厂商所建议的条件。 0012 本发明所述青霉素酰化酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。 说明书 1/4 页 3 CN 110106161 A 3 0013 上述青霉素酰化酶基因的编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。 0014 本申请所述的青霉素酰化酶基因来源， 是从10份不同来源的牙面上的牙菌斑混合 物中， 通过宏基因组学技术， 使用试剂盒(Mobio牌，DNA Isolat。

7、ion Kit， 14900-50-NF， USA)提取宏基因组DNA， 并直接对提取好的DNA进行PCR扩增得到。 0015 实施例1 0016 通过分子克隆技术， 构建青霉素酰化酶基因的蛋白表达载体 0017 1、 直接对提取好的宏基因组DNA做PCR扩增(50 l体系) 0018 上游引物GTTAGCAGCCGGATCATGGAGACGACGATGGCGCGA 0019 下游引物ATATGCTCGAGGATCCTACCGTGAAAACAAGAGCGTATGTTGGGC 0020 PCR体系： 0021 0022 PCR程序： 0023 95预变性2min， (94变性30s， 64退火3。

8、0s； 72延伸150s)X 35cycles， 最后 72延伸10min。 0024 PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定， 结果如图1所示， 泳道M是Takara 250bp DNA ladder marker， 泳道1是目的基因。 0025 本步骤所得PCR产物使用sanger法测序(ABI 3730 xl测序仪双向测序， 测序引物为 上述 “上游引物” 和 “下游引物” ， 由广州英骏生物公司完成)， 得到本发明所述青霉素酰化酶 基因的核酸序列， 如SEQ ID NO.1所示。 0026 根据三联密码子， 将该核酸序列翻译成蛋白序列。 该蛋白序列进行NCBI Blast比 对搜索， 得。

9、到的具有最高同源性的序列是Genbank WP_047822973.1记录下的蛋白序列， 具 有82.71的氨基酸同源性。 0027 2、 胶回收 0028 使用Omega公司胶回收试剂盒， 货号D2500-01， 对步骤1的PCR产物中的目的条带， 进行割胶回收。 将胶回收后的该基因的PCR产物的浓度调整为50ng/ l， 作为后续in fusion 连接反应的底物， 用于连接到表达载体上。 0029 3、 线性化表达质粒的准备构建蛋白表达载体： 0030 质粒载体选择pET15b， 先对载体酶切 0031 说明书 2/4 页 4 CN 110106161 A 4 0032 在37下保温30。

10、min 0033 酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定， 用上述的omega试剂盒回收酶切产物条带。 胶 回收产物浓度为27ng/ l。 以上即为制备好的线性化的质粒载体， 用于后续的In fusion反 应。 0034 4、 In-Fusion连接反应 0035 将纯化好的PCR产物与质粒表达载体相互连接， 构建表达载体。 0036 0037 50保温15min， 然后置于冰上 0038 重组质粒图谱如图2所示。 0039 5、 转化 0040 取In-Fusion连接反应获得的连接产物10 l， 加入到大肠杆菌NEB-10beta感受态 细胞中， 混匀冰浴30min， 42热激45s， 冰浴2m。

11、in， 涂LB平板(带有氨苄青霉素抗性)， 将平板 置于培养箱中培养， 平板上形成单克隆菌落。 0041 6、 验证单克隆 0042 挑取单克隆菌落至10 l无菌水中， 吹打混匀， 取1 l作模板(10个， 编号110)进行 菌落PCR， 验证目的基因是否连接到质粒载体上。 0043 PCR体系： 0044 0045 对照： 0046 0047 PCR程序： 94预变性10min， (94变性30s； 55退火30s； 72延伸2.5min) 35cycles， 最后72延伸10min。 PCR产物电泳检测， 通过目的条带的有无和大小， 判断目的 基因是否成功连接于载体。 说明书 3/4 页 。

12、5 CN 110106161 A 5 0048 7、 测序验证与表达菌株的构建 0049 取有目的条带的样品菌， 接种到带有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中， 培养过 夜， 菌液送至广州英骏生物公司测序验证， 使用T7上游和下游通用测序引物进行测序， 结果 显示序列正确。 然后提取该样品的质粒DNA， 将质粒DNA转化到大肠杆菌ER2566细胞(蛋白表 达的宿主菌)内， 将ER2566培养过夜。 0050 实施例2 0051 蛋白表达部分： 0052 1、 诱导表达 0053 1)取实施例1步骤7中过夜培养的菌液300 L， 加入到30mL LB中， 再加氨苄青霉素， 37， 200rpm培养。

13、。 0054 2)大约2h后测OD， 当OD值达到0.5(0.30.5)时， 加入IPTG， 终浓度0.1mM， 然后20 ， 200rpm培养12h。 0055 2、 酶法裂解细胞(30mL菌液) 0056 1)4000g， 10min离心收集菌体， 去上清， 用高纯水洗一次(高纯水重悬沉淀再离心 去上清)。 0057 2)每30mL菌液对应的沉淀重悬于1.2mL cell lysis buffer(pH 8.5)， buffer需 要确保添加有PMSF。 0058 3)加入溶菌酶粉末至终浓度1mg/mL， 混匀， 冰浴30min。 0059 4)将离心管转移到摇床， 旋紧盖子， 倾斜45度。

14、放置， 230rpm， 25， 震荡10min。 0060 5)加入Triton X-100 12 L(终浓度为1)， DNA酶0.5 L和RNA酶1 L(终浓度均为5 g/mL)， 置于摇床上， 230rpm， 25， 震荡15min。 0061 6)4， 12000g离心15min， 上清为可溶蛋白组分， 沉淀为细胞碎片和不溶蛋白组 分。 上清液用于后续实验。 0062 上清液中基因工程重组表达的青霉素酰化酶， 其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。 0063 3、 活性检测 0064 根据文献(邵威平,吴卓颖,张永玲,杨富民,田常庆.产青霉素G酰化酶工程菌的构 建J.甘肃农业大学学报,。

15、2016,51(01):132-137)的方法， 测定上述上清液中青霉素酰化 酶的活性， 可达56U/mL。 0065 将Genbank记录的WP_047822973.1的蛋白序列， 也用上述方法进行蛋白表达。 将本 发明的青霉素酰化酶， 与WP_047822973.1的酶， 各取100U总量， 平行实验操作如下： 用10KDa 的超滤膜过滤截留蛋白质， 用等体积的pH 7.0的纯水重悬膜上截留的蛋白。 45保温72小 时。 在保温前后， 各取样测定酶活性。 本发明的酶蛋白， 在72h后仍保留有84的酶活性。 WP_ 047822973.1序列来源的酶蛋白， 仅保留有67的酶活性。 以上结果表。

16、明， 本发明的酶蛋白， 与WP_047822973.1相比， 具有更好的稳定性和活性。 0066 日常工业领域使用青霉素酰化酶时， 一般需要物流运输和储存， 将酶制剂从酶工 厂运送到抗生素厂家。 而有些情况下， 由于气温高、 运输时间长、 仓库储存时间久等不利因 素的影响， 容易导致酶活性降低， 从而造成经济损失。 上述酶稳定性测定方法， 模拟了酶产 品日常储存和运输的情况， 说明本发明的青霉素酰化酶， 在工业实际应用中， 具有更佳的稳 定性。 说明书 4/4 页 6 CN 110106161 A 6 序列表 福建医科大学附属口腔医院 青霉素酰化酶基因及其编码蛋白 2019 2 SIPOSeq。

17、uenceListing 1.0 1 2421 DNA 人工序列(Artificial sequence ) 1 atggagacga cgatggcgcg acgggcatgg ctgatctggg gacggcgtac gctgctgctg 60 atcctggccc tggtgttgct ggccgtgctg ggtgtctggc tgttcctgcg tgccagcctg 120 gcgcagctcg acggcaaggt cgtgtcgccg cagctgagcg gttccgtgac cgtcacgcgc 180 gacgccaacg gcgtgccgac gatcagcggc g。

18、ccgaccgga tcgacctggc ctatgccgcc 240 ggctacgtgc acgcccagga gcgcttcttc cagatggacc tgctgcgccg cagcgccgcc 300 ggcgagctgg ccgagctgtt cgggccgaag gcgctgccgc tcgaccgcgc gcatcgcctg 360 caccgcttcc gcgcccgtgc gctcgaggcg ctggcgcgcc tgagcccgga gcagcgccgc 420 ttcgtcgagc gctatgccgc cggcgtcaac gacggcctga atgcgctcgg。

19、 cgcacggccc 480 ttcgaatatg cgctgaccgg cgccagaccg cggccctgga ccgcagccga ttcgctgctg 540 acggtgtggg ccatgtacat cgatttgcag ggcaaccagg aggcacgcga cctggcgcgc 600 ggctggctgg caagccacac cacgcctgag cagcgcgcct tcctgatgcc cgaagccagc 660 cgctgggatg cgccgctcga cgcccccggc gtggatgtgg ccgcggcggc cgtgcccgcc 720 gcgc。

20、cgcccg catggtggca ccgcaaggat gcgctgccgg cgcgccaggt ggccggcatc 780 gatttcaccg acgcggtcgg cagcaacaac tatgcggtgg ccggcacgcg caccgccagc 840 ggggcggcga tcgtctcgga cgacatgcac ctcggcctgc agttgccgaa tacctggtac 900 cggctggcgc tgcgctttcc cgacgcgcaa ggcgggcagc ggcgcgtggt cggcgtaagc 960 ctgccgggcg cgccgccgct gg。

21、tgatcgtc ggcagcaatg gccatgtggc ctgggccttc 1020 accaacagct atgccgacac gctcgacctg gtccgcctgg gcaccgaccg cgcacgcgcc 1080 gggcaggtac ggacgccggc cggctgggag acgccgctgg aaaaggtcga gacgattttg 1140 gtgaaaggcc agccggccga acgcgtgctc gtgcgcgaga ccagcctggg accgatccgc 1200 gaagccggcg gcgaactcta tgcgatccac tggatcg。

22、cgc atgcgccgca ggcggtcaac 1260 ctcgaacacc tgcgcatgga aaccgcgacc acgctggacg acgcgatggc ggtggcggcc 1320 gtcgacggta tcccggcgca gaacatcctg atcggcgacg agcgcggcaa tatcggctgg 1380 accgtcgccg gcatcctgcc gcaccgtccc gcggccggcc gcgggctggc cgtgtccttc 1440 ccgctggacg cgagcggcag cgttccggcc tgggacggcg tgctggcgcc g。

23、gccgactat 1500 ccgcatgtgg tgaatccgcc gggtgggcaa ctggtgaccg ccaacaaccg ccagctggcc 1560 ggaccgaacg cgcaagtgct cggcgacggc ggcttcgacc tcggcgcgcg tgcgcgccag 1620 序列表 1/5 页 7 CN 110106161 A 7 ctgggcgagg gcgtgcgcag cctgggcgac aagaccgacg tgccggccac cttccgcgcg 1680 gcgctcgacg atcgcgcgct gttcgtgcag gagtggcgcg。

24、 agcgcgccct ggcggcgctc 1740 gacgacgcgg ccgtcgccgg ccatccggag cgtgcggagt tccgccgcct gctgaaggaa 1800 agctgggatg gccatgccag caccggctcg gtcggctacc gcctggcgca gcagttccgc 1860 tggtcgctgt acgagctggt gttcgccggc gcgaatgccg agatggccag gctcgatccg 1920 aaggccagca tgcagagcgc cagctcgcgc tggtcggcgg tgctggcgcg cctg。

25、ctggac 1980 gagcgcccgg cggcctggct gccgtccggc tatgccagct ggcaggacct gcagctggcc 2040 gcggtcgacc gcacgatccg cgatgtcacc aaggacggca cgccgctggc ccgggccacc 2100 tggggcgcgc gcaacacggc ggcgatcgcg catccgatca gcatggcgct gcctttcctg 2160 aagcgttggc tgggcgcgcc gcccgaccag ctgccgggcg acgccaacat gccgcgcgtg 2220 gcag。

26、ggccga agttcggcca gtcggagcgc ctgacggtgt cgccggggcg ggaagaagag 2280 gggctgttcg acatgcccgg cgggcagagc gggcatccgc tgtcgccctg gttcctgggc 2340 gggcatgcgg actgggtgcg cgggaagccg accccgctgc tgccggggcc ggcccaacat 2400 acgctcttgt tttcacggta g 2421 2 806 PRT 人工序列(Artificial sequence ) 2 Met Glu Thr Thr Met Ala。

27、 Arg Arg Ala Trp Leu Ile Trp Gly Arg Arg 1 5 10 15 Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Leu Leu Ala Val Leu Gly Val 20 25 30 Trp Leu Phe Leu Arg Ala Ser Leu Ala Gln Leu Asp Gly Lys Val Val 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Ser Gly Ser Val Thr Val Thr Arg Asp Ala Asn Gly 50 55 60 Val Pro Thr Ile Ser Gly Ala As。

28、p Arg Ile Asp Leu Ala Tyr Ala Ala 65 70 75 80 Gly Tyr Val His Ala Gln Glu Arg Phe Phe Gln Met Asp Leu Leu Arg 85 90 95 Arg Ser Ala Ala Gly Glu Leu Ala Glu Leu Phe Gly Pro Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Leu Asp Arg Ala His Arg Leu His Arg Phe Arg Ala Arg Ala Leu 115 120 125 Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser P。

29、ro Glu Gln Arg Arg Phe Val Glu Arg 130 135 140 Tyr Ala Ala Gly Val Asn Asp Gly Leu Asn Ala Leu Gly Ala Arg Pro 145 150 155 160 序列表 2/5 页 8 CN 110106161 A 8 Phe Glu Tyr Ala Leu Thr Gly Ala Arg Pro Arg Pro Trp Thr Ala Ala 165 170 175 Asp Ser Leu Leu Thr Val Trp Ala Met Tyr Ile Asp Leu Gln Gly Asn 180 。

30、185 190 Gln Glu Ala Arg Asp Leu Ala Arg Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Thr 195 200 205 Pro Glu Gln Arg Ala Phe Leu Met Pro Glu Ala Ser Arg Trp Asp Ala 210 215 220 Pro Leu Asp Ala Pro Gly Val Asp Val Ala Ala Ala Ala Val Pro Ala 225 230 235 240 Ala Pro Pro Ala Trp Trp His Arg Lys Asp Ala Leu Pro Ala Arg 。

31、Gln 245 250 255 Val Ala Gly Ile Asp Phe Thr Asp Ala Val Gly Ser Asn Asn Tyr Ala 260 265 270 Val Ala Gly Thr Arg Thr Ala Ser Gly Ala Ala Ile Val Ser Asp Asp 275 280 285 Met His Leu Gly Leu Gln Leu Pro Asn Thr Trp Tyr Arg Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Phe Pro Asp Ala Gln Gly Gly Gln Arg Arg Val Val Gly 。

32、Val Ser 305 310 315 320 Leu Pro Gly Ala Pro Pro Leu Val Ile Val Gly Ser Asn Gly His Val 325 330 335 Ala Trp Ala Phe Thr Asn Ser Tyr Ala Asp Thr Leu Asp Leu Val Arg 340 345 350 Leu Gly Thr Asp Arg Ala Arg Ala Gly Gln Val Arg Thr Pro Ala Gly 355 360 365 Trp Glu Thr Pro Leu Glu Lys Val Glu Thr Ile Leu 。

33、Val Lys Gly Gln 370 375 380 Pro Ala Glu Arg Val Leu Val Arg Glu Thr Ser Leu Gly Pro Ile Arg 385 390 395 400 Glu Ala Gly Gly Glu Leu Tyr Ala Ile His Trp Ile Ala His Ala Pro 405 410 415 Gln Ala Val Asn Leu Glu His Leu Arg Met Glu Thr Ala Thr Thr Leu 420 425 430 Asp Asp Ala Met Ala Val Ala Ala Val Asp 。

34、Gly Ile Pro Ala Gln Asn 435 440 445 Ile Leu Ile Gly Asp Glu Arg Gly Asn Ile Gly Trp Thr Val Ala Gly 450 455 460 Ile Leu Pro His Arg Pro Ala Ala Gly Arg Gly Leu Ala Val Ser Phe 序列表 3/5 页 9 CN 110106161 A 9 465 470 475 480 Pro Leu Asp Ala Ser Gly Ser Val Pro Ala Trp Asp Gly Val Leu Ala 485 490 495 Pro。

35、 Ala Asp Tyr Pro His Val Val Asn Pro Pro Gly Gly Gln Leu Val 500 505 510 Thr Ala Asn Asn Arg Gln Leu Ala Gly Pro Asn Ala Gln Val Leu Gly 515 520 525 Asp Gly Gly Phe Asp Leu Gly Ala Arg Ala Arg Gln Leu Gly Glu Gly 530 535 540 Val Arg Ser Leu Gly Asp Lys Thr Asp Val Pro Ala Thr Phe Arg Ala 545 550 555。

36、 560 Ala Leu Asp Asp Arg Ala Leu Phe Val Gln Glu Trp Arg Glu Arg Ala 565 570 575 Leu Ala Ala Leu Asp Asp Ala Ala Val Ala Gly His Pro Glu Arg Ala 580 585 590 Glu Phe Arg Arg Leu Leu Lys Glu Ser Trp Asp Gly His Ala Ser Thr 595 600 605 Gly Ser Val Gly Tyr Arg Leu Ala Gln Gln Phe Arg Trp Ser Leu Tyr 610。

37、 615 620 Glu Leu Val Phe Ala Gly Ala Asn Ala Glu Met Ala Arg Leu Asp Pro 625 630 635 640 Lys Ala Ser Met Gln Ser Ala Ser Ser Arg Trp Ser Ala Val Leu Ala 645 650 655 Arg Leu Leu Asp Glu Arg Pro Ala Ala Trp Leu Pro Ser Gly Tyr Ala 660 665 670 Ser Trp Gln Asp Leu Gln Leu Ala Ala Val Asp Arg Thr Ile Arg。

38、 Asp 675 680 685 Val Thr Lys Asp Gly Thr Pro Leu Ala Arg Ala Thr Trp Gly Ala Arg 690 695 700 Asn Thr Ala Ala Ile Ala His Pro Ile Ser Met Ala Leu Pro Phe Leu 705 710 715 720 Lys Arg Trp Leu Gly Ala Pro Pro Asp Gln Leu Pro Gly Asp Ala Asn 725 730 735 Met Pro Arg Val Ala Gly Pro Lys Phe Gly Gln Ser Glu。

39、 Arg Leu Thr 740 745 750 Val Ser Pro Gly Arg Glu Glu Glu Gly Leu Phe Asp Met Pro Gly Gly 755 760 765 Gln Ser Gly His Pro Leu Ser Pro Trp Phe Leu Gly Gly His Ala Asp 770 775 780 序列表 4/5 页 10 CN 110106161 A 10 Trp Val Arg Gly Lys Pro Thr Pro Leu Leu Pro Gly Pro Ala Gln His 785 790 795 800 Thr Leu Leu Phe Ser Arg 805 序列表 5/5 页 11 CN 110106161 A 11 图1 图2 说明书附图 1/1 页 12 CN 110106161 A 12 。