可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf

上传人:zhu****_FC 文档编号:11346724 上传时间:2021-09-19 格式:PDF 页数:21 大小:1,014.40KB
收藏 版权申诉 举报 下载
可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf_第1页
第1页 / 共21页
可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf_第2页
第2页 / 共21页
可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf_第3页
第3页 / 共21页
文档描述:

《可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf(21页完成版)》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910457717.1 (22)申请日 2019.05.29 (83)生物保藏信息 CCTCC NO: C2018122 2018.06.13 CCTCC NO: C2018123 2018.06.13 (71)申请人 暨南大学 地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大 道西601号 (72)发明人 唐勇边洪芬徐飞 (74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 44245 代理人 黄莹 (51)Int.Cl. C12N 5/20(2006.01) C07K 1。

2、6/10(2006.01) C07K 1/30(2006.01) G01N 21/64(2006.01) G01N 21/65(2006.01) G01N 33/558(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (54)发明名称 可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、 单克隆抗 体及应用 (57)摘要 本发明提供了可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤 细胞、 单克隆抗体及应用。 所述的杂交瘤细胞分 别命名为4A11和3H7, 于2018年6月13日保藏于位 于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏 中心, 保藏编号分别为CCTCCNO: C2018123、 CCTCCNO: C2018。

3、122。 所述的杂交瘤细胞株4A11 和3H7可高产分泌抗猪流行性腹泻病毒的单克隆 抗体, 其腹水间接ELISA效价均达10-6。 本发明还 以所述的单抗为核心建立了猪流行性腹泻病毒 检测试纸, 能高度特异、 准确、 灵敏地检测猪流行 性腹泻病毒, 操作简便, 可实现有效且快速的现 场快速检测, 为我国猪流行性腹泻病毒的检测、 诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。 权利要求书3页 说明书13页 附图4页 CN 110144330 A 2019.08.20 CN 110144330 A 1.可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞, 为如下任意一株: (1)可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆。

4、抗体的杂交瘤细胞, 命名为杂交瘤细胞株4A11, 已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心, 保藏编 号为: CCTCC NO: C2018123; (2)可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞, 命名为杂交瘤细胞株3H7, 已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心, 保藏编 号为CCTCC NO: C2018122。 2.猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体, 其特征在于: 由保藏编号为: CCTCC NO: C2018123的杂交瘤和/或保藏编号为CCTCC NO: C2018122的 杂交瘤产生。 3.权利要求2。

5、所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体的纯化方法, 去除脂质后, 通过辛 酸-硫酸铵沉淀法进行纯化, 其特征在于: 正辛酸与初始腹水的比例为40 L/mL, 缓冲液为浓度0.015moL/L pH7.4的PBS, 硫酸 铵的终饱和度为50。 4.权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体在检测猪流行性腹泻病毒的应 用。 5.一种猪流行性腹泻病毒检测试纸, 其特征在于: 包含权利要求2所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。 6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸, 其特征在于: 所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括双抗体夹心拉曼检测试纸、 双抗体夹心胶体金 试纸、 双抗体夹心荧光试纸中的至少。

6、一种; 所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括捕获抗体、 检测抗体; 所述的捕获抗体为由保 藏编号为CCTCC NO: C2018122的杂交瘤细胞株3H7产生的单克隆抗体, 所述的检测抗体为由 保藏编号为CCTCC NO: C2018123的杂交瘤细胞株4A11产生单克隆抗体。 7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸, 其特征在于: 所述的双抗体夹心拉曼检测试纸的制备方法为: (1)拉曼探针: 在纳米金溶液中加入AgNO3溶液进行反应, 然后再加入拉曼探针分子进行 搅拌孵育, 加入PVP继续反应, 离心得到拉曼探针; (2)拉曼探针标记抗体的制备: 将步骤(1)得到的拉曼探针溶于水中,。

7、 调节pH至8.5, 加 入由杂交瘤细胞株3H7产生的单抗反应, 随后加入封闭剂室温孵育, 离心, 得到拉曼探针标 记抗体, 所述的拉曼探针标记抗体加入至样品溶液中作为所述的双抗体夹心拉曼检测试纸 的点样溶液; (3)拉曼试纸的组装: 组装以杂交瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小鼠 IgG为质控线的拉曼试纸; 所述的双抗体夹心胶体金试纸的制备方法为: (1)制备金纳米颗粒: 通过柠檬酸盐还原法制备, 加热水至沸腾后, 加入氯金酸和柠檬 酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色; (2)制备金标抗体: 在步骤(1)制得的金纳米颗粒溶液中加入由杂交瘤细胞株3H7产生 的单抗, 搅。

8、拌反应后静置后, 加入封闭剂反应后离心, 然后用含20(w/v)蔗糖、 20(w/v) 权利要求书 1/3 页 2 CN 110144330 A 2 海藻糖、 0.1(w/v)PVP K40、 0.1(w/v)S-9、 1(w/v)BSA、 0.5(w/v)Tween-20的PBS (0.015 M, pH7.4)复溶; (3)双抗体夹心胶体金试纸的组装: 组装含有以杂交瘤细胞株3H7产生的抗体制得的金 标抗体的结合垫, 以杂交瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小鼠IgG为质控线的 双抗体夹心胶体金试纸; 所述的双抗体夹心荧光试纸通过如下方法制备得到: (1)荧光标记抗体的制备: 。

9、将荧光微球与由杂交瘤细胞株3H7产生的单抗搅拌孵育后, 加入甘氨酸过夜反应, 再加入乙醇胺, 室温搅拌反应, 超声清洗; (2)双抗体夹心荧光试纸的组装: 组装含有以杂交瘤细胞株3H7产生的抗体制得的荧光 标记抗体的结合垫, 以杂交瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小鼠IgG为质控线 的双抗体夹心荧光试纸。 8.根据权利要求7所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸, 其特征在于: 在所述的双抗体夹心拉曼检测试纸的制备方法中, 步骤(1)中所述的纳米金通过柠檬酸盐还原法制备, 加热水至沸腾后, 加入氯金酸和柠 檬酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色; 步骤(1)中所述的AgNO3溶液。

10、的加入速度为1滴/15s1滴/25s; 步骤(1)中所述的AgNO3溶液的浓度为812mM; 所述的柠檬酸盐为柠檬酸三钠; 在所述的双抗体夹心胶体金试纸的制备方法中, 步骤(3)中所述的双抗体夹心胶体金试纸的组装中, 所述的胶体金试纸条包括样品垫、 结合垫和吸收垫制成; 所述的样品垫的处理液为含15(w/v)蔗糖、 0.53(v/v)Tween-20的0.2M pH7.4的磷酸缓冲液; 所述作为检测线的杂交瘤细胞株4A11产生的单抗的终浓度为0.51mg/mL; 所述作为质控线的山羊抗小鼠IgG的终浓度为0.52mg/mL; 所述的结合垫上需要的金标抗体的终浓度为150300mg/mL; 在所。

11、述的双抗体夹心荧光试纸的制备中, 步骤(1)中所述的超声清洗的时间为2040min; 步骤(1)中所述的甘氨酸的浓度为0.050.2 M; 步骤(1)中所述的杂交瘤细胞株3H7产生的单抗终浓度为4080mg/mL; 步骤(1)中所述的乙醇胺与荧光标记抗体溶液的比例为2050 L/mL。 9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸, 其特征在于: 在所述的双抗体夹心拉曼检测试纸的制备方法中: 所述的柠檬酸三钠的浓度为0.51.5(w/v); 所述的氯金酸的浓度为0.0050.02(w/v); 所述的继续加热煮沸的时间为515min; 步骤(1)中所述的AgNO3溶液的加入速度为1滴/20s。

12、; 步骤(1)中所述的AgNO3溶液的浓度为10mM; 步骤(1)中所述的拉曼探针分子为4-ATP; 权利要求书 2/3 页 3 CN 110144330 A 3 步骤(1)中所述的反应条件为室温反应20min; 步骤(1)中所述的孵育的时间为15min; 步骤(1)中所述的PVP为PVP29000; 所述的继续反应的时间为25min; 在所述的双抗体夹心胶体金试纸的制备方法中, 步骤(1)中所述的金纳米颗粒的粒径为40nm; 步骤(2)中所述的搅拌反应的时间为15min; 所述的静置的时间为15min; 步骤(2)中所述的封闭剂为PEG 20000; 所述的加入封闭剂反应的操作为旋转15mi。

13、n并 静置15min; 步骤(2)中所述的离心条件为6000rpm离心15min; 在所述的双抗体夹心荧光试纸的制备中, 步骤(1)中所述的超声清洗的时间为3040min; 步骤(1)中所述的甘氨酸的浓度为0.1M; 步骤(1)中所述的室温搅拌反应的时间为1030min; 步骤(1)所述的荧光微球先进行如下活化步骤: 先将荧光微球于0.05M MES溶液中, 离 心30min后, 再次溶解于0.05M pH6的MES中, 超声清洗; 加入1mg/mL EDC、 1mg/mL NHS, 孵 育30min, 超声清洗, 得到活化后的荧光微球。 10.一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒, 包含权利要求5。

14、9任一项所述的猪流行性腹 泻病毒检测试纸。 权利要求书 3/3 页 4 CN 110144330 A 4 可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、 单克隆抗体及应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域, 特别涉及可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、 单克隆抗 体及应用。 背景技术 0002 猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)作为冠状病毒科 和Alphacoronavirus属的成员, 是猪流行性腹泻(PED)的病原体, 该病是一种高度接触性传 染性肠道疾病, 其主要特征是猪严重腹泻、 呕吐、 脱水及对哺乳仔猪的高致病率。 自1982年。

15、 以来, PEDV已在东南亚传播和蔓延, 例如在日本。 在过去的30年里, 亚洲猪场感染PEDV的情 况十分严重, 分别自2005年和2007年在中国和泰国进一步记录了该病, 在被感染的猪场, 处 于各个年龄期段的猪都受到严重呕吐和水样腹泻的影响, 更严重的是哺乳仔猪的死亡率接 近100, 相对而言成年猪的发病状况较轻和死亡率较低。 0003 PEDV的基因组是线性单股正链且具有感染性的RNA, 长约28kb, 含有7个开放阅读 框(ORF1a, ORF1b, 和ORF26), ORF1a与ORF1b编码多聚蛋白pp1ab, 这种多聚蛋白可被病毒 编码的裂解蛋白酶分为16个非结构蛋白(nsp1。

16、nsp16)并参与到病毒RNA转录和复制的基 本机制。 四种结构蛋白分别是囊膜蛋白(S)、 膜蛋白(M)、 小膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N), 核 衣壳就是由N蛋白与RNA构成。 0004 PEDV感染的组织学特征包括严重扩散的萎缩性肠炎, 随着轻度细胞质空泡化表面 绒毛状肠细胞肿胀, 散在的肠细胞坏死然后脱落, 下层含有凋亡细胞的绒毛膜层收缩。 小肠 绒毛变为原始长度的三分之二左右(腺窝深度比由正常的7:1缩小为3:1, 具体的变化取决 于感染的程度和病情。 PEDV在整个小肠的绒毛上皮细胞中复制, 破坏目标细胞使其细胞坏 死或凋亡, 这些过程导致绒毛萎缩和空泡形成以及酶活性的显着降低, 这。

17、一系列的过程的 发生能够阻断消化和影响营养物质和电解质的吸收, 从而导致猪吸收不良发生腹泻继而使 仔猪严重脱水最终致命。 尽管与断奶的猪相比较, 为什么PEDV感染哺乳仔猪会诱发更严重 的病症的机理还没有清楚地阐明, 新生猪肠道细胞再生较慢可能会是一个重要的因素。 0005 PEDV在猪与猪之间的感染主要是通过直接或者间接的粪口传播, 空气传播在某些 条件下也在其传播中发挥作用。 PEDV进入猪场主要是通过临床或者亚临床感染猪的腹泻粪 便、 呕吐物和被污染环境资源, 运输猪、 饲料或者食物的拖车, 猪场主或者猪场访客(如穿着 携带污染源服饰和鞋子的货车司机), 以及野生动物和鸟类。 其他受污染。

18、的污染物, 如母乳、 饲料、 食物物品或食品添加剂或配料都可能是潜在的病毒来源。 为了控制该病继续危害我 国猪场安全, 对它的及时发现就显得尤为重要。 0006 目前现有技术中多种的检测方法如PCR、 IHC、 LAMP等, 对仪器有很高的要求或者样 品前处理复杂, 不能达到操作简便节省资源的目的。 因此, 目前的猪流行性腹泻病毒的检 测、 诊断和科学指导防控亟需更为简便、 高效的技术。 0007 目前有用胶体金方法检测PEDV的现有技术, 如专利文献 “一种用于检测猪流行性 腹泻病毒的免疫胶体金试纸条及其制备方法和应用” (申请号CN201310317343.6)。 胶体金 说明书 1/13。

19、 页 5 CN 110144330 A 5 法能实现现场快速检测, 但是其只能实现定性检测且灵敏度低。 荧光法也被用于检测PEDV, 如专利文献 “一种快速定量检测猪流行性腹泻病毒的免疫荧光试纸条及其制备方法” (申请 号CN201510152757.7)。 荧光法能实现定性检测且灵敏度比胶体金有所提高, 但荧光标记抗 体溶液中容易出现聚集, 荧光信号较弱、 不稳定。 近来兴起的表面增强拉曼免疫检测技术具 有灵敏度高且抗体特异性强的优点, 如专利文献 “一种快速检测微量氟虫腈的表面增强拉 曼金标试纸条及其制备方法” (申请号: CN201810005898.X), 但是存在对胶体金质量要求严 。

20、苛且拉曼试纸条对不同抗体的适应性不同的不足。 发明内容 0008 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足, 提供可分泌抗猪流行性腹泻 病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞。 本发明获得了2株能分泌抗PEDV单抗杂交瘤细胞4A11和 3H7。 0009 本发明的第二目的在于提供由所述的杂交瘤细胞株制备得到的单克隆抗体。 0010 本发明的第三目的在于提供所述的单克隆抗体的应用, 所述的单克隆抗体可对猪 流行性腹泻病毒进行高效、 准确的检测。 0011 本发明的第四目的在于提供一种检测猪流行性腹泻病毒的试纸, 通过所述的单克 隆抗体建立了检测猪流行性腹泻病毒的试纸。 0012 本发明的第五目的在于提供。

21、一种检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒。 0013 本发明的目的通过下述技术方案实现: 0014 一株可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞, 命名为杂交瘤细胞株 4A11, 已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 保藏编号为: CCTCC NO: C2018123。 0015 一株可分泌抗猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞, 命名为杂交瘤细胞株 3H7, 已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心 (CCTCC), 保藏编号为CCTCC NO: C2018122。 0016 一种猪流行性腹泻病。

22、毒的单克隆抗体, 由保藏编号为CCTCC NO: C2018122的杂交 瘤细胞株3H7产生。 所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-7。 0017 一种猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体, 由保藏编号为CCTCC NO: C2018123的杂交 瘤细胞株4A11产生。 所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6。 0018 所述的抗体亚型为IgG2a, Kappa链。 0019 所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体的纯化方法, 去除脂质后, 通过辛酸-硫酸 铵沉淀法进行纯化, 其中, 正辛酸与初始腹水的比例为40 L/mL, 缓冲液为浓度0.015moL/L pH7.4的PBS, 硫酸。

23、铵的终饱和度为50。 0020 所述的去除脂质的方法优选为通过二氧化硅吸附去除。 0021 所述的二氧化硅的加入量优选为按二氧化硅与腹水的比例为80120mg/mL加入。 0022 所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体在检测猪流行性腹泻病毒的应用。 0023 一种猪流行性腹泻病毒检测试纸, 包含所述的猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体。 0024 所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括双抗体夹心拉曼检测试纸、 双抗体夹心胶 体金试纸、 双抗体夹心荧光试纸。 说明书 2/13 页 6 CN 110144330 A 6 0025 所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸包括捕获抗体、 检测抗体; 所述的捕获抗体优 选为。

24、由保藏编号为CCTCC NO: C2018122的杂交瘤细胞株3H7产生的单克隆抗体, 所述的检测 抗体优选为由保藏编号为CCTCC NO: C2018123的杂交瘤细胞株4A11产生单克隆抗体。 0026 所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸的质控线优选为山羊抗小鼠IgG。 0027 所述的双抗体夹心拉曼检测试纸优选通过如下方法制得: 0028 (1)拉曼探针: 在纳米金溶液中加入AgNO3溶液进行反应, 然后再加入拉曼探针分 子进行搅拌孵育, 加入PVP继续反应, 离心得到拉曼探针; 0029 (2)拉曼探针标记抗体的制备: 将步骤(1)得到的拉曼探针溶于水中, 调节pH至 8.5, 加入由杂交。

25、瘤细胞株3H7产生的单抗反应, 随后加入封闭剂室温孵育, 离心, 得到拉曼 探针标记抗体, 所述的拉曼探针标记抗体加入至样品溶液中作为所述的双抗体夹心拉曼检 测试纸的点样溶液; 0030 (3)拉曼试纸的组装: 组装以杂交瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小 鼠IgG为质控线的拉曼试纸。 0031 步骤(1)中所述的纳米金优选通过柠檬酸盐还原法制备, 加热水至沸腾后, 加入氯 金酸和柠檬酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色。 0032 所述的柠檬酸盐优选为柠檬酸三钠。 0033 所述的柠檬酸三钠的浓度优选为0.51.5(w/v)。 0034 所述的氯金酸的浓度优选为0.00。

26、50.02(w/v)。 0035 所述的继续加热煮沸的时间优选为515min; 更优选为10min。 0036 步骤(1)中所述的拉曼探针分子优选为4-ATP(对氨基苯硫酚)。 0037 步骤(1)中所述的AgNO3溶液的浓度优选为812mM; 更优选为10mM。 0038 步骤(1)中所述的AgNO3溶液的加入速度优选为1滴/15s1滴/25s; 更优选为1滴/ 20s。 0039 步骤(1)中所述的反应条件优选为室温反应20min。 0040 步骤(1)中所述的孵育的时间优选为15min。 0041 步骤(1)中所述的PVP优选为PVP29000; 所述的继续反应的时间优选为25min。 。

27、0042 所述的拉曼检测试纸包括支撑薄片、 硝酸纤维素膜、 样品垫和吸收垫、 检测(T线) 和质控线(C线), 所述的检测线和所述的质控线设在所述的硝酸纤维素膜上, 所述的检测线 为所述的杂交瘤细胞株4A11产生的单克隆抗体, 所述的质控线为山羊抗小鼠IgG。 当T线检 测出拉曼信号时, 结果为阳性; 当T线检测不出拉曼信号时, 结果为阴性。 0043 所述的支撑薄片优选为PVC板。 0044 所述的双抗体夹心胶体金试纸优选通过如下方法制备得到: 0045 (1)制备金纳米颗粒: 通过柠檬酸盐还原法制备, 加热水至沸腾后, 加入氯金酸和 柠檬酸盐继续加热煮沸至溶液颜色稳定为酒红色或红色; 00。

28、46 (2)制备金标抗体: 在步骤(1)制得的金纳米颗粒溶液中加入由杂交瘤细胞株3H7 产生的单抗, 搅拌反应后静置后, 加入封闭剂反应后离心, 然后用含20(w/v)蔗糖、 20 (w/v)海藻糖、 0.1(w/v)PVP K40、 0.1(w/v)S-9、 1(w/v)BSA、 0.5(w/v)Tween-20的 PBS(0.015M, pH7.4)复溶; 0047 (3)双抗体夹心胶体金试纸的组装: 组装含有以杂交瘤细胞株3H7产生的抗体制得 说明书 3/13 页 7 CN 110144330 A 7 的金标抗体的结合垫, 以杂交瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小鼠IgG为。

29、质控 线的双抗体夹心胶体金试纸。 0048 步骤(1)中所述的金纳米颗粒的粒径优选为40nm。 0049 步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为15min; 所述的静置的时间优选为15min。 0050 步骤(2)中所述的封闭剂优选为PEG 20000; 所述的加入封闭剂反应的操作优选为 旋转15min并静置15min。 0051 步骤(2)中所述的离心条件优选为6000rpm离心15min。 0052 步骤(3)中所述的双抗体夹心胶体金试纸的组装中, 所述的胶体金试纸条包括样 品垫、 结合垫和吸收垫制成。 0053 所述的样品垫处理液为含1.05.0(w/v)蔗糖、 0.53(v/v)Twe。

30、en-20的 0.2M pH 7.4的磷酸缓冲液; 所述作为检测线的杂交瘤细胞株4A11产生的单抗终浓度为0.5 1mg/mL; 所述作为质控线的山羊抗小鼠IgG终浓度为0.52mg/mL; 所述的结合垫上需要 的金标抗体终浓度为150300mg/mL。 0054 所述的双抗体夹心荧光试纸优选通过如下方法制备得到: 0055 (1)荧光标记抗体的制备: 将荧光微球与由杂交瘤细胞株3H7产生的单抗搅拌孵育 后, 加入甘氨酸过夜反应, 再加入乙醇胺, 室温搅拌反应, 超声清洗; 0056 (2)双抗体夹心荧光试纸的组装: 组装含有以杂交瘤细胞株3H7产生的抗体制得的 荧光标记抗体的结合垫, 以杂交。

31、瘤细胞株4A11产生的单抗作为检测线, 山羊抗小鼠IgG为质 控线的双抗体夹心荧光试纸。 0057 步骤(1)所述的荧光微球优选先进行如下活化步骤: 先将荧光微球于0.05M MES溶 液中, 离心30min后, 再次溶解于0.05M MES(pH 6.0)中, 超声清洗; 加入1mg/mL EDC、 1mg/mL NHS, 孵育30min, 超声清洗, 得到活化后的荧光微球。 0058 步骤(1)中所述的超声清洗的时间优选为2040min; 进一步优选为3040min。 0059 步骤(1)中所述的甘氨酸的浓度优选为0.050.2M; 更优选为0.1M。 0060 步骤(1)中所述的杂交瘤细。

32、胞株3H7产生的单抗终浓度优选为4080mg/mL。 0061 步骤(1)中所述的乙醇胺与荧光标记抗体溶液的比例为2050 L/mL。 0062 步骤(1)中所述的室温搅拌反应的时间优选为1030min。 0063 一种猪流行性腹泻病毒检测试剂盒, 包含所述的猪流行性腹泻病毒检测试纸。 0064 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果: 0065 (1)本发明的杂交瘤细胞株4A11和3H7是可高产分泌抗猪流行性腹泻病毒的单克 隆抗体, 所述的单克隆抗体腹水间接ELISA效价均达10-6。 0066 (2)本发明提供的杂交瘤细胞株4A11和3H7分泌抗猪流行性腹泻病毒特异性单抗, 以所述的单抗。

33、为核心建立猪流行性腹泻病毒检测试纸(如拉曼试纸、 胶体金试纸、 荧光试 纸)均能高度特异、 准确、 灵敏地检测猪流行性腹泻病毒。 本发明的检测试纸灵敏度高, 所制 得的拉曼试纸、 胶体金试纸、 荧光试纸的检测限(LOD)分别可达0.078125 g/mL(0.975 103TCID50/mL)、 0.625 g/mL(7.8103TCID50/mL)、 0.3125 g/mL(3.9103TCID50/mL), 其中, 所制得的拉曼试纸比同样方法制备的胶体金试纸条高4个滴度, 比同样方法制备的荧光试 纸条高2个滴度。 而且所述的检测试纸仅与猪流行性腹泻病毒反应, 与猪胃肠炎病毒和猪伪 狂犬病毒。

34、等均不发生免疫反应, 特异性好。 说明书 4/13 页 8 CN 110144330 A 8 0067 (3)利用本发明所制备的单克隆抗体检测猪流行性腹泻病毒, 不需要昂贵的电子 显微镜、 PCR仪等设备, 操作简便, 可实现现场快速检测。 0068 (4)利用本发明所制备的单克隆抗体, 可有效且快速地用于猪粪便中病毒的检测, 为我国猪流行性腹泻病毒的检测、 诊断和科学指导防控提供物质和技术支持。 附图说明 0069 图1是胶体金试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的结果图。 0070 图2是胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的灵敏度结果分析图。 0071 图3是胶体金试。

35、纸条检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、 猪伪狂犬病毒(PRV)、 猪圆环 病毒2型(PCV-2)、 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、 猪瘟病毒(CSFV)和传染性胃肠炎病毒 (TGEV)的结果图。 0072 图4是胶体金试纸条检测猪流行性腹泻病毒的特异性结果分析图。 0073 图5是荧光试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的结果图。 0074 图6是荧光试纸条检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的灵敏度结果分析图。 0075 图7是拉曼试纸条检测不同浓度的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的结果图。 0076 图8是拉曼试纸条检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的灵敏度结果分析图。 具体实。

36、施方式 0077 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述, 但本发明的实施方式不限于此。 除非特别说明, 本发明采用的试剂、 方法和设备为本技术领域常规试剂、 方法和设备。 除非 特别说明, 本发明所用试剂和材料均可通过市售获得。 0078 实施例1杂交瘤细胞的获得及其单克隆抗体的制备 0079 1、 PEDV病毒的制备 0080 将PEDV CHYJ130330株(GenBank:KJ020932, 由广东海大畜牧兽医研究院分离鉴 定, 保存)在37下接种于Vero细胞(购自ATCC, 货号: ATCC CCL-81)单层45分钟。 然后将实 验室配置的维护培养基(含1(v/v)双抗(青链。

37、霉素混合液)的DMEM)添加到培养物中培养2 或3天。 当细胞病变达到85以上时, 收集细胞并重复冷冻和解冻3次。 超声破碎并以 10000rpm离心1小时后, 将上清液以45000rpm进一步离心3小时, 并将沉淀再悬浮于PBS (0.01M, pH7.4)中。 粗提物病毒依次铺于3060(w/v)蔗糖-PBS中, 33000rpm离心3h。 然后将PEDV病毒重新悬浮于PBS中并以40000rpm离心3小时以除去蔗糖。 将纯化的病毒重悬 于PBS中。 将未接种的Vero细胞进行相同的处理并用作阴性对照。 0081 2、 免疫动物 0082 将超离纯化后的PEDV免疫体格强健的6周龄Balb。

38、/c小鼠(购自南方医科大学实验 动物中心)。 免疫方法如下, 大腿肌肉、 背部和皮下免疫弗式完全佐剂乳化的抗原100105 g/只, 2周后皮下免疫弗式不完全佐剂乳化的抗原8085 g/只, 间隔2周后皮下免疫弗式不 完全佐剂乳化的抗原8085 g/只, 再间隔4周后皮下免疫弗式不完全佐剂乳化的抗原80 85 g/只, 4免后1周采血, 间接ELISA测定抗血清效价。 选取效价最高的小鼠融合前3天尾静 脉注射8085 g纯病毒抗原加强免疫。 0083 3、 细胞融合 说明书 5/13 页 9 CN 110144330 A 9 0084 因为融合时需要SP2/0细胞, 所以融合前期要复苏并扩大培。

39、养SP2/0细胞(购自上 海细胞生物学研究所)。 0085 选择状态较好的SP2/0细胞通过有限稀释法多次亚克隆, 选取状态最好的SP2/0细 胞重悬并进行细胞计数, 重悬前用基本培养基(含1(v/v)双抗(青链霉素混合液)的RPMI- 1640)清洗细胞, 洗去死亡细胞, 然后根据脾细胞总量取适量体积的优化后SP2/0细胞, 制备 好所需要的SP2/0细胞悬液。 0086 融合的过程中先将饲养细胞离心1000r/min, 7min去掉上清, 于37放置备用。 将 制备的SP2/0细胞与免疫脾细胞(从步骤2免疫后的小鼠脾脏获得脾细胞)按体积比1:6于 50mL离心管中混匀, 1000r/min。

40、离心7min, 去上清。 将装有细胞混合物的离心管放入37水 浴中, 然后在1min内以由慢到快的速度滴入预热到37的50PEG 1mL, 边加边轻轻搅拌, 加完后静置3min, 接着在24min内以由慢到快的速度滴加15mL的基本培养基, 1000r/min 离心7min。 用HAT选择培养基重悬融合后的细胞并进行铺板, 铺到预先铺有饲养层细胞的96 孔细胞板, 放入37, 5CO2细胞培养箱中静置培养并观察细胞状态, 5d7d后选取细胞克 隆数目多或细胞数量较多的细胞孔换液继续培养, 其内细胞经过48小时即可取其细胞培养 液进行检测。 0087 4、 筛选杂交瘤细胞的细胞表面间接荧光免疫吸。

41、附法的建立 0088 参照专利文献 “一种筛选分泌特异性单克隆抗体杂交瘤细胞的方法与应用” (申请 号CN201510331003.8)的实施例1将PEDV与偶联剂偶联进行融合后抗PEDV阳性细胞的挑选。 0089 将细胞弃去培养上清液, 然后将制备的抗原偶联复合物与FITC标记的山羊抗小鼠 IgG(购自奥创生物技术有限公司, 货号: A102-Ab1)混合并稀释后每孔加100 L, 37静置孵 育1h后洗涤3次, 每孔加入200 L RPMI1640培养基, 置于荧光显微镜下观察每孔细胞。 空白 对照孔不加入抗原偶联复合物; SP2/0细胞上清和小鼠的阳性血清(用PBS稀释5000倍)分别 。

42、为阴性对照和阳性对照, 相同条件处理后进行对比。 将镜下观察到荧光信号的阳性细胞孔 标记后加入甲基纤维素半固体培养基, 移液枪挑出标记细胞团, 将其扩大传代培养后用于 制备腹水和液氮保存, 最终获得稳定的细胞株18株。 0090 5、 筛选杂交瘤细胞的间接ELISA法的建立 0091 将PEDV包被酶标板检测杂交瘤细胞上清液, 同时每次检测设定PBS为空白对照, 以 SP2/0细胞上清和小鼠的阳性血清(用PBS稀释5000倍)分别为阴性对照和阳性对照。 将阳性 孔通过有限稀释法多次亚克隆, 将最终得到的阳性单克隆扩大传代培养后用于制备腹水和 液氮保存, 最终获得稳定的细胞株3株。 综合两种筛选。

43、方法, 本次共获得稳定的细胞株21株。 0092 6、 单克隆抗体腹水制备及纯化 0093 采用体内诱生腹水法制备单抗。 选取68周龄的Balb/c小鼠腹腔注射液体不完全 佐剂0.40.5mL/只, 一周后注射浓度为1106/mL对数生长期的阳性杂交瘤细胞0.5mL到 每只小鼠的腹腔。 每天观察小鼠的生长情况至小鼠腹部膨大到影响其行动和精神状态, 用 注射针头抽取腹水。 3000rpm离心10min, 收集上清液即为单抗腹水。 0094 纯化方案(1): 参照中文图书 细胞和分子免疫学实验技术 第三章 “免疫球蛋白纯 化技术” 进行腹水纯化。 腹水4, 12000rpm离心15min, 去除杂。

44、质。 取1份腹水与2份醋酸盐缓 冲液混合, 室温搅拌下逐滴加入正辛酸33 L/mL腹水。 室温混合30min。 4静置2h以上, 使其 充分沉淀。 上清经砂芯漏斗或125 m的尼龙网过滤后, 加入1/10体积的0.1M pH 7.4PBS, 用 说明书 6/13 页 10 CN 110144330 A 10 2M NaOH调pH值至7.4。 冰浴下于30min内加入0.277g/mL的硫酸铵, 使成45饱和度。 4静 置1h以上。 4, 10000rpm离心30min, 弃上清。 沉淀用适量含137mM NaCl、 2.6mM KCl、 0.2mM EDTA的pH 7.4PBS溶解, 于501。

45、00倍体积的上述PBS中4透析过夜。 0095 纯化方案(2): 在纯化方案(1)的基础上根据腹水存在脂质的实际情况, 在过饱和 硫酸铵之前按二氧化硅与腹水的比例为80120mg/mL加入二氧化硅, 静置0.52h吸附脂 质。 根据优化后结果将正辛酸与初始腹水的比例调为40 L/mL, PBS的浓度调为0.015moL/L, 过滤膜的孔径调为0.45 m, 硫酸铵的终饱和度调为50。 0096 采用PEDV包板, 将纯化方案(1)和(2)纯化的抗体4A11梯度稀释到相同浓度作为一 抗, 建立起对比两种纯化方案所得抗体效价的间接ELISA。 结果显示纯化方案(1)纯化抗体 4A11的效价为241。

46、000, 纯化方案(2)纯化抗体4A11的效价为261000, 方案(2)纯化抗体的 效价高于方案(1)。 采用SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒(购自BBI Life Science, CAS号: E910DA009)进行两种方案纯化后抗体4A11纯度的鉴定。 明显观察到纯化方 案(2)纯化抗体4A11的轻重链对应的位置出现的条带比纯化方案(1)纯化抗体4A11的轻重 链对应的位置出现的条带浅1/2, 该现象表明纯化方案(2)纯化抗体的纯度高于纯化方案 (1)。 两个鉴定实验共同说明了本发明优化的纯化方案(2)使抗体效价得到了提高。 0097 7、 单抗的类型及亚类鉴定和腹水效价。

47、测定 0098 用鉴定单抗类型的试剂盒(SouthernBiotech, 货号: 5300-05)鉴定单抗的类型及 亚类, 结果显示除了编号为6H2的抗体亚型为IgM, 其余的抗体亚型都是IgG2a, 所有抗体的 轻链类型都为 链。 采用间接ELISA法检测单抗腹水的效价, 结果表明单抗效价在241000 以下的有4株(A11H7、 4A11H8、 4A11C10、 6H2); 效价在241000271000之间的有16株 (6D10、 2H2、 5H12、 5A9、 5H9、 3C11F5、 3C11F9、 2C11、 5A11、 4A11B9、 4G10、 5E2、 4D5、 3G9、 3。

48、H7、 4H7); 效价为281000的有1株(4A11)。 0099 8、 单抗的特异性检测 0100 用PEDV、 猪伪狂犬病毒(PRV)疫苗毒株Bartha-K61(由广东永顺生物制药股份有限 公司提供)、 猪胃肠炎病毒(TGEV)华毒疫苗株(由广东海大畜牧兽医研究院提供)包被ELISA 板, 用间接ELISA方法分析单抗的特异性反应。 0101 结果显示, 本发明的单抗仅与猪流行性腹泻病毒反应, 而与猪伪狂犬病毒和猪胃 肠炎病毒均不发生免疫反应。 0102 9、 双抗体夹心ELISA方阵法配对实验 0103 从筛选出的21株抗PEDV单抗中挑选出14株效价较高的单抗进行双抗体夹心ELI。

49、SA 方阵法配对实验。 针对不同株抗体的效价不同, 在配对之前要对酶标抗体的效价进行确定。 选用B型的HRP标记试剂盒(购自北京泰天河生物技术有限公司, 货号: MD030)标记待配对的 纯化抗体, 其标记后的效价用直接ELISA法进行测定。 0104 确认好酶标抗体的效价后, 将抗体包被在酶标板上, PEDV稀释成相同浓度作为一 抗, 根据酶标抗体的效价将其稀释到合适浓度, 建立双抗体夹心ELISA方阵。 如表1所示,“-” 表示OD4501,“+” 表示1OD4502, 有7个抗体配对的OD450值大于1, 其中3H7 和HRP-4A11配对的OD450值高于2, 表明3H7和4A11配对。

50、的检测效果最好。 0105 表1 说明书 7/13 页 11 CN 110144330 A 11 0106 0107 0108 10、 杂交瘤细胞株的优化 0109 通过间接ELISA法检测单抗腹水的效价, 3H7的效价为271000, 4A11的效价为28 1000, 高于其他19株抗体的效价; 特异性检测结果显示3H7和4A11与猪伪狂犬病毒和猪胃肠 炎病毒均不发生免疫反应; 配对实验表明3H7和4A11配对的检测效果最好, 故选择这两株抗 体进行后续检测技术的建立。 0110 杂交瘤细胞株3H7已于2018年6月13日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典 型培养物保藏中心(CCTCC)。

展开阅读全文
内容关键字: 分泌 PEDV 杂交瘤 细胞 单克隆抗体 应用
关于本文
本文标题:可分泌抗PEDV单抗的杂交瘤细胞、单克隆抗体及应用.pdf
链接地址:https://www.zhuanlichaxun.net/pdf/11346724.html
关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

copyright@ 2017-2018 zhuanlichaxun.net网站版权所有
经营许可证编号:粤ICP备2021068784号-1