针对胡宁病毒的中和抗体、其制备方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910467822.3 (22)申请日 2019.05.30 (71)申请人 中国科学院武汉病毒研究所 地址 430071 湖北省武汉市武昌区水果湖 街小洪山中区44号 (72)发明人 潘晓彦吴妍肖庚富 (74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务 所(特殊普通合伙) 11463 代理人 王焕 (51)Int.Cl. C07K 16/10(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61K 47/68(2017.01) A61P 31/14(2006.01。

2、) (54)发明名称 一种针对胡宁病毒的中和抗体、 其制备方法 及其应用 (57)摘要 本发明实施例提供了一种针对胡宁病毒的 中和抗体、 其制备方法及其应用， 涉及生物医药 技术领域， 该制备方法包括将制备好的胡宁病毒 抗原免疫动物得到多抗， 然后对多抗进行胡宁病 毒包膜糖蛋白亚基1特异性纯化， 在短期内能制 备出具有较高中和活性的抗体， 从而大量获得用 于临床治疗阿根廷出血热的马抗血清产品， 该制 备方法及其制备出的产品将对阿根廷出血热的 应急治疗做出贡献。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图2页 CN 110204613 A 2019.09.06 CN 110204613 A 1。

3、.一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 其特征在于， 其包括将制备好的胡宁病 毒抗原免疫动物得到多抗， 然后对所述多抗进行特异性纯化； 所述特异性纯化为采用胡宁病毒包膜糖蛋白亚基1特异性亲和层析柱对多抗进行的二 次纯化。 2.根据权利要求1所述的针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 其特征在于， 所述多抗 包括： 多克隆抗体和/或多克隆抗体片段， 所述多克隆抗体片段由所述多抗进行浓缩后获 得； 优选地， 所述浓缩包括将免疫动物得到的多抗溶液调节至pH2.83.2， 添加胃蛋白酶 进行消化， 终止消化反应后采用912kD滤膜对消化反应后的反应液进行浓缩。 3.根据权利要求1所述的针对胡宁病毒的中。

4、和抗体的制备方法， 其特征在于， 所述胡宁 病毒抗原的制备包括将胡宁病毒包膜糖蛋白的全长基因构建至表达载体的多克隆区， 得到 表达质粒， 将所述表达质粒转染至宿主细胞， 进行假病毒包装， 得到胡宁病毒抗原； 优选地， 将得到的所述胡宁病毒抗原进行抗原纯化。 4.根据权利要求3所述的针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 其特征在于， 所述表达 载体为pCAGGS， 所述假病毒为水泡性口炎病毒假病毒。 5.根据权利要求2所述的针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 其特征在于， 所述动物 为马。 6.一种针对胡宁病毒的中和抗体， 其特征在于， 其由权利要求15任一项所述的制备 方法制得。 7.一种疫苗，。

5、 其特征在于， 其包括有权利要求6所述的中和抗体。 8.一种药物组合物， 其特征在于， 其包括有权利要求6所述的中和抗体。 9.一种抗体药物偶联物， 其特征在于， 其包括有权利要求6所述的中和抗体。 10.权利要求6所述的中和抗体在制备针对沙粒病毒相关药物和/或试剂中的应用， 优 选地， 所述沙粒病毒包括胡宁病毒、 马秋波病毒、 瓜纳瑞托病毒、 萨比亚病毒和/或查帕尔病 毒。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110204613 A 2 一种针对胡宁病毒的中和抗体、 其制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体而言， 涉及一种针对胡宁病毒的中和抗体、 其 制备方法。

6、及其应用。 背景技术 0002 胡宁病毒(Junin virus， JUNV)是沙粒病毒科哺乳动物沙粒病毒属中的重要成员， 是生物安全四级病原。 其主要流行于南美洲， 可导致阿根廷出血热， 致死率约为30， 仅次 于埃博拉、 马尔堡等烈性病毒。 近年来， 随着国际人员和物资的快速流通， JUNV有向北美洲、 欧洲和亚洲蔓延的趋势， 对全球的生物安全形势造成了威胁。 0003 与同科病毒拉沙病毒类似， JUNV基因组包含一个长约7.2k的大片段L和一个长约 3 .5k的小片段S。 L片段编码基质蛋白Z和RNA聚合酶L， 而S片段则编码核蛋白NP (nucleoprotein)和包膜糖蛋白GPC(。

7、glycoprotein precursor)。 NP蛋白和L蛋白、 Z蛋白在 病毒的生命周期中所行使的功能分别为基因复制和转录、 出芽并组成病毒的衣壳基质蛋 白。 GPC则由稳定信号肽(stable signal peptide， SSP)、 介导病毒与受体吸附的包膜糖蛋 白1(glycoprotein 1， GP1)和介导膜融合的包膜糖蛋白2(glycoprotein 2， GP2)三部分组 成。 沙粒病毒的GPC在成熟后组装形成了一个典型的GPC三聚体结构展示在病毒粒子表面， 介导病毒与受体的吸附以及吸附后的膜融合过程。 0004 JUNV天然宿主为野鼠， 在其体内症状较轻或无症状。 人。

8、类在工作和生活中接触携 带病毒的野鼠或其分泌物及排泄物、 被其污染的食物和带有病毒的气溶胶等而被感染。 一 部分人(约30)在感染后的1-2周内， 症状逐渐加重， 表现出持续发热、 脱水、 肾功能不全、 低血压、 多处粘膜部位严重出血、 神经紊乱、 休克等症状， 最终死于大出血和昏迷。 0005 尽管在阿根廷地区已批准使用活病毒疫苗(Candid 1)来预防JUNV的感染， 但目前 仍无针对性药物用于临床治疗阿根廷出血热。 因此， 研制针对JUNV的药物， 尤其是治疗性抗 体， 显得十分重要。 发明内容 0006 本发明提供一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 该制备方法能够在短期内 获得具。

9、有较高中和活性的用于临床治疗阿根廷出血热的马抗血清产品， 将对阿根廷出血热 的应急治疗做出贡献。 0007 本发明提供一种针对胡宁病毒的中和抗体， 该中和抗体能够有效抑制胡宁病毒感 染， 具有较高的抗病毒活性。 0008 本发明还提供包含上述中和抗体的疫苗、 药物组合物以及抗体药物偶联物， 以达 到能够有效抑制患者体内胡宁病毒感染的效果。 0009 此外， 本发明实施例还提供上述中和抗体在制备针对沙粒病毒相关药物和/或试 剂中的应用， 该应用能够制备出具有较高抑制活性的沙粒病毒相关药物和/或试剂。 0010 本发明是这样实现的： 说明书 1/5 页 3 CN 110204613 A 3 001。

10、1 一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 该制备方法包括将制备好的胡宁病毒 抗原免疫动物得到多抗， 然后对多抗进行特异性纯化； 上述特异性纯化为采用胡宁病毒包 膜糖蛋白亚基1特异性亲和层析柱对上述多抗进行的二次纯化。 0012 本申请的发明人通过付出一系列创造性的劳动后， 发现， 经过二次纯化过程制备 得到的抗体， 对于胡宁病毒具有更为有效的抗病毒活性。 在二次纯化的过程中的具体操作 为将包膜糖蛋白1固定在活化的树脂颗粒， 制备得到包膜糖蛋白1特异性亲和层析柱； 运用 此纯化柱对多抗进行二次纯化， 得到具有有效中和活性的包膜糖蛋白1特异性抗体(GP1特 异性抗体)。 0013 进一步地， 上。

11、述多抗可以为多克隆抗体和/或多克隆抗体片段， 多克隆抗体片段由 多抗进行浓缩后获得。 0014 浓缩步骤包括将由胡宁病毒抗原免疫动物得到的多抗溶液调节至pH2.83.2， 然 后添加胃蛋白酶进行消化， 终止消化反应后， 采用912kD滤膜对消化反应后的反应液进行 浓缩， 得到多克隆抗体片段。 0015 多抗包括有多克隆抗体和多克隆抗体片段， 因此， 经过二次纯化后， 得到的抗体分 别为GP1特异性抗体和GP1特异性抗体片段(包膜糖蛋白1特异性抗体片段)。 0016 进一步地， 上述胡宁病毒抗原的制备包括： 将胡宁病毒包膜糖蛋白的全长基因 (GPC)构建至表达载体的多克隆区， 得到表达质粒； 将。

12、该表达质粒转染至宿主细胞， 进行假 病毒包装， 得到胡宁病毒抗原。 0017 优选地， 将得到的针对胡宁病毒抗原进行抗原纯化。 0018 进一步地， 在本发明实施例中， 表达载体优选为pCAGGS， 上述假病毒为水泡性口炎 病毒假病毒VSVG-GFP/G。 0019 进一步地， 在该制备方法中， 免疫动物为马。 将上述获得的胡宁病毒抗原免疫马， 得到多抗(马源抗体)。 在本申请中， 马源抗体制备和纯化工艺具有生产周期短、 成本低的优 点。 而现有技术公开的鼠源单抗需要经过改造并通过生物发酵进行生产， 而改造抗体具有 不确定性， 生物发酵时间较长， 因此， 本发明提供的制备工艺更加成熟， 适用于。

13、抗体及其药 物的产业化。 0020 本发明实施例还提供一种针对胡宁病毒的中和抗体， 该中和抗体由上述制备方法 制得。 0021 本发明实施例还提供一种疫苗， 其由上述中和抗体和/或上述制备方法制得的中 和抗体。 进一步地， 该疫苗是针对沙粒病毒的疫苗， 沙粒病毒包括胡宁病毒、 马秋波病毒、 瓜 纳瑞托病毒、 萨比亚病毒和/或查帕尔病毒， 优选为胡宁病毒。 0022 本发明实施例还提供一种药物组合物， 该药物组合物包括上述中和抗体和/或由 上述制备方法制得的中和抗体。 具体地， 该药物组合物是针对沙粒病毒的疫苗， 沙粒病毒包 括胡宁病毒、 马秋波病毒、 瓜纳瑞托病毒、 萨比亚病毒和/或查帕尔病毒。

14、， 优选为胡宁病毒。 0023 本发明实施例还提供一种抗体药物偶联物， 该抗体药物偶联物包括上述中和抗体 或由上述制备方法制得的中和抗体。 具体地， 该药物组合物是针对沙粒病毒的疫苗， 沙粒病 毒包括胡宁病毒、 马秋波病毒、 瓜纳瑞托病毒、 萨比亚病毒和/或查帕尔病毒， 优选为胡宁病 毒。 0024 此外， 本发明还提供上述中和抗体在制备针对沙粒病毒相关药物和/或试剂中的 说明书 2/5 页 4 CN 110204613 A 4 应用。 优选地， 沙粒病毒包括胡宁病毒、 马秋波病毒、 瓜纳瑞托病毒、 萨比亚病毒和/或查帕 尔病毒。 0025 本发明具有以下有益效果： 0026 本发明实施例提供。

15、了一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 该制备方法包括 将制备好的胡宁病毒抗原免疫动物得到多抗， 然后对该多抗进行特异性纯化， 特异性纯化 具体为采用胡宁病毒包膜糖蛋白亚基1特异性亲和层析柱对多抗进行的二次纯化。 该制备 方法在短期内能制备出具有较高中和活性的抗体， 以大量获得用于临床治疗阿根廷出血热 的马抗血清产品， 该制备方法及其产品将对阿根廷出血热的应急治疗做出贡献。 0027 此外， 本发明实施例还提供了一种针对胡宁病毒的中和抗体、 疫苗、 药物组合物、 抗体药物偶联物以及上述中和抗体在制备针对沙粒病毒相关药物和/或试剂中的应用， 中 和抗体以及包含该中和抗体的疫苗、 药物组合物以及。

16、抗体药物偶联物均具有较高的病毒中 和活性。 附图说明 0028 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案， 下面将对实施例中所需要使用的附 图作简单地介绍， 应当理解， 以下附图仅示出了本发明的某些实施例， 因此不应被看作是对 范围的限定， 对于本领域普通技术人员来讲， 在不付出创造性劳动的前提下， 还可以根据这 些附图获得其他相关的附图。 0029 图1为本发明实施例4中提供的4组抗体对于胡宁假病毒的抑制结果； 0030 图2为本发明实施例3中提供的抗体抑制胡宁、 马秋波、 瓜纳瑞托、 萨比亚和查帕尔 假病毒的结果； 0031 图3为本发明对比例1中提供的中和抗体抑制胡宁假病毒的结果。 具体实。

17、施方式 0032 为使本发明实施例的目的、 技术方案和优点更加清楚， 下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、 完整地描述。 实施例中未注明具体条件者， 按照常规条件或制造商建 议的条件进行。 所用试剂或仪器未注明生产厂商者， 均为可以通过市售购买获得的常规产 品。 0033 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。 0034 实施例1 0035 本实施例提供一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法。 0036 1.表达载体的构建 0037 本实施例通过基因合成， 获得胡宁病毒包膜糖蛋白的全长基因(GPC)， GPC的序列 如SEQ ID No.1所示。 将GPC构建至真核表达载。

18、体pCAGGS的多克隆区， 获得含有GPC的表达质 粒pCAGGS-GPC。 0038 2.胡宁病毒抗原制备 0039 2.1.假病毒包装： 0040 将步骤1.构建好的表达质粒pCAGGS-GPC转染至HEK293T细胞(宿主细胞)， 表达24h 后， 采用水泡性口炎病毒假病毒VSVG-GFP/G感染细胞， 继续培养36h后， 收集细胞培养上 说明书 3/5 页 5 CN 110204613 A 5 清， 得到病毒液， 其中包含大量病毒粒子。 0041 2.2.抗原纯化： 0042 在超速离心管底部加入20蔗糖溶液， 在上层添加步骤2.1得到病毒液， 然后在4 ， 20000rpm/min离。

19、心2h， 弃上清， 收集底部的病毒粒子(胡宁病毒抗原)。 0043 3.免疫动物 0044 以1.1氢氧化铝溶液作为佐剂， 按照1： 1的体积比将佐剂和步骤2.2获得的胡宁 病毒抗原充分混合得到免疫混合物， 将5mL免疫混合物分别于马颈部以及背部多点进行皮 内、 皮下和肌肉注射。 间隔2周免疫一次， 共免疫四次。 0045 4.多抗的制备 0046 在步骤3最后一次免疫后， 间隔10天采集血浆。 将采集的血浆用pH8.0磷酸盐缓冲 液稀释， 随后上Protein A亲和层析柱进行抗体吸附， 洗去非特异性结合蛋白后， 用pH3.0甘 氨酸溶液对抗体进行洗脱， 并将洗脱的抗体(多抗)透析至磷酸盐缓。

20、冲液备用。 0047 5.特异性抗体的制备 0048 5.1.将胡宁病毒包膜糖蛋白1重组蛋白固定至活化的树脂颗粒上， 制备得到GP1特 异性亲和层析柱。 采用该GP1特异性亲和层析柱对步骤4制得的多抗进行纯化， 得到GP1特异 性抗体(中和抗体)。 0049 5.2.将步骤4中得到的多抗的溶液调节至pH3.0， 添加胃蛋白酶进行消化反应， 终 止消化反应后， 采用10kD滤膜对消化反应得到的反应液进行浓缩， 得到多抗片段。 0050 将得到的多抗片段进行二次纯化得到GP1特异性抗体片段， 多抗片段的二次纯化 的步骤请参照步骤5.1。 0051 实施例2 0052 验证实施例1中得到中和抗体的活。

21、性。 0053 将实施例1中得到的GP1特异性抗体或GP1特异性抗体片段采用无血清培养基进行 稀释， 从200 g/ml起稀释9-15个梯度不等， 然后与胡宁假病毒进行混合， 37孵育1h。 0054 随后将抗体和病毒的混合物加入Vero-E6细胞表面， 37感染1h， 以空白和病毒分 别作为阴性和阳性对照。 随后， 充分去除感染物之后， 继续培养细胞24h， 通过荧光素酶活性 检测试剂盒对各细胞孔的荧光值进行定量检测。 0055 通过计算抗体对病毒感染的抑制率来评价抗体的活性， 通过此方案， 最终获得多 抗、 多抗片段、 GP1特异性抗体和GP1特异性抗体片段在体外抑制胡宁病毒的EC50分别。

22、为 13.88 g/ml、 7.68 g/ml、 0.76 g/ml和1.98 g/ml。 0056 实施例3 0057 验证实施例1提供的抗体对于高致病性新世界沙粒病毒具有广谱中和作用。 0058 采用实施例1中提供的中和抗体分别对胡宁病毒(Junin virus,JUNV)、 对马秋波 病毒(Machupo virus,MACV)、 瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus,GTOV)、 萨比亚病毒(Sabia virus,SABV)和查帕尔病毒(Chapare virus,CHPV)进行抗血清抑制实验。 将实施例1中得到 的多抗血清采用无血清培养基进行稀释， 从1： (20-5120。

23、)起稀释9个梯度， 然后分别与JUNV、 MACV、 GTOV、 SABV或CHPV假病毒进行混合， 37孵育1h。 0059 随后将抗血清和病毒的混合物加入Vero-E6细胞表面， 37感染1h， 以空白和病毒 分别作为阴性和阳性对照。 随后， 充分去除感染物之后， 继续培养细胞24h， 通过荧光素酶活 说明书 4/5 页 6 CN 110204613 A 6 性检测试剂盒对各细胞孔的荧光值进行定量检测。 抗血清抑制JUNV、 MACV、 GTOV、 SABV和 CHPV假病毒的结果如附图2所示。 0060 由图2可知， 中和抗体对JUNV的中和滴度(NT50)为1:2560， 对MACV、。

24、 GTOV、 SABV和 CHPV的中和滴度(NT50)分别为1:(80-160)、 1:(160-320)、 1:(320-640)和1:(160-320)。 0061 实施例4 0062 验证实施例1提供的抗体的活性。 0063 将实施例1中制备得到的多抗、 多抗片段多抗、 GP1特异性抗体和GP1特异性抗体片 段分别对胡宁病毒进行抑制， 抑制实验的操作方法请参照实施例2， 抑制结果如附图1所示。 0064 在附图1中， IgG为多抗， F(ab )2为多抗片段， GP1特异性IgG为GP1特异性抗体， GP1 特异性F(ab )2为GP1特异性抗体片段。 0065 通过GP1特异性亲和层。

25、析纯化， 从总IgG和F(ab )2中获得了GP1特异性IgG和F (ab )2。 经过特异性纯化， 总IgG和F(ab )2的中和活性分别提高了约18倍和4倍， 请参照附图 1。 0066 对比例1 0067 验证实施例1提供的抗体与现有技术制备的抗体进行比较。 0068 实验方法 0069 对照例1采用DNA(真核表达载体搭载GPC)抗原制备抗体， 其他步骤与实施例1中的 抗体制备步骤相同。 4匹马分为两组， #1859和#1863是假病毒免疫组(本发明实施例1)， # 1887和#1888是DNA免疫组(对照例1)。 0070 4次免疫后， 检测实施例1和对照例1中的中和抗体滴度， 检测。

26、结果请参照附图3， 附 图3中， 数据为抑制胡宁假病毒的结果。 中和滴度(NT50)： 抑制50病毒所用血清稀释倍数。 具体检测方法参照实施例3。 0071 由附图3可知， 实施例1提供的假病毒免疫组血清的中和抗体滴度高达1:(2560- 5120)， 而对照例1中DNA组血清的中和抗体滴度仅达到1:20。 0072 综上， 本发明实施例提供了一种针对胡宁病毒的中和抗体的制备方法， 该制备方 法包括将制备好的胡宁病毒抗原免疫动物得到多抗， 然后对该多抗进行特异性纯化， 特异 性纯化具体为采用胡宁病毒包膜糖蛋白亚基1特异性亲和层析柱对多抗进行的二次纯化。 该制备方法在短期内能制备出具有较高中和活。

27、性的抗体， 以大量获得用于临床治疗阿根廷 出血热的马抗血清产品， 该制备方法及其产品将对阿根廷出血热的应急治疗做出贡献。 0073 此外， 本发明实施例还提供了一种针对胡宁病毒的中和抗体、 疫苗、 药物组合物、 抗体药物偶联物以及上述中和抗体在制备针对沙粒病毒相关药物和/或试剂中的应用， 中 和抗体以及包含该中和抗体的疫苗、 药物组合物以及抗体药物偶联物均具有较高的病毒中 和活性。 0074 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本。

28、发明的保护范围之内。 说明书 5/5 页 7 CN 110204613 A 7 SEQUENCE LISTING 中国科学院武汉病毒研究所 一种针对胡宁病毒的中和抗体、 其制备方法及其应用 1 PatentIn version 3.5 1 1458 DNA 胡宁病毒 1 atgggccagt tcatctcctt catgcaagag atccctacct tcctgcagga ggctctgaac 60 atcgccctgg tggctgtgtc cctcatcgcc attatcaagg gcatcgtcaa cctgtacaag 120 tccggcctgt tccagttctt tgt。

29、cttcctg gccctggccg gcaggtcctg taccgaagag 180 gccttcaaga tcggcctgca caccgagttt cagaccgtca gcttttccat ggtcggcctg 240 ttctccaaca atccccacga cctgcccctg ctctgtaccc tcaataagag ccacctctac 300 atcaagggag gcaatgcctc cttccaaatc tccttcgacg atatcgccgt gctcctgccc 360 cagtacgatg tgatcatcca gcatcccgcc gacatgagct g。

30、gtgcagcaa gtccgacgac 420 caaatttggc tgagccagtg gttcatgaac gccgtgggac acgattggca cctggaccct 480 cccttcctgt gcaggaacag aaccaagacc gagggcttca tcttccaggt caacacctcc 540 aagaccggcg tgaacgaaaa ctacgccaag aagttcaaga caggcatgca ccacctgtac 600 agggagtatc ccgacagctg ccccaacggc aagctctgcc tgatgaaggc tcagcctaca。

31、 660 agctggcccc tgcagtgccc tctggaccat gtgaacaccc tccacttcct gaccaggggc 720 aagaacattc agctgcccag gagatccctg aaggcttttt tctcctggag cctgaccgac 780 agcagcggaa aggacacccc cggaggctac tgcctggagg agtggatgct cgtggctgcc 840 aaaatgaagt gcttcggcaa taccgccgtg gccaagtgca atctcaatca cgattccgaa 900 ttttgcgata tgct。

32、gagact cttcgactac aacaagaatg ccattaagac cctgaacgac 960 gagaccaaga aacaggtgaa cctcatgggc cagaccatca atgccctgat tagcgacaac 1020 ctgctcatga agaacaagat tagggagctc atgagcgtgc cctactgcaa ttataccaag 1080 ttctggtacg tgaatcacac actgtccggc cagcactccc tgcccagatg ctggctgatc 1140 aagaacaaca gctacctcaa catttccgac。

33、 ttcaggaacg actggatcct ggagagcgat 1200 ttcctgatct ccgagatgct gtccaaggaa tactccgaca ggcagggcaa aacccccctg 1260 accctggtgg atatctgctt ctggtccacc gtgttcttta ccgccagcct gttcctgcac 1320 ctcgtgggaa tccccaccca caggcacatt agaggcgagg cctgtcccct gccccacaga 1380 ctgaattccc tgggcggctg tagatgtggc aagtacccca acctgaagaa gcccaccgtg 1440 tggaggagag gccactga 1458 序列表 1/1 页 8 CN 110204613 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 110204613 A 9 图3 说明书附图 2/2 页 10 CN 110204613 A 10 。