适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910509166.9 (22)申请日 2019.06.13 (71)申请人 华中农业大学 地址 430073 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 柴利军蒋靖东韦壮敏邓秀新 (74)专利代理机构 武汉泰山北斗专利代理事务 所(特殊普通合伙) 42250 代理人 程千慧 (51)Int.Cl. A01H 1/02(2006.01) (54)发明名称 一种适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否 的方法 (57)摘要 一种适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否 的方法， 包括以。

2、下步骤： 1.收集柑橘花粉； 2.配制 柑橘花粉萌发培养基， 将花粉洒在培养基上,用 显微镜观察花粉活力是否正常； 3.蘸取活力正常 的花粉授在柱头上， 用授粉袋包住花朵； 4.等待 一定时间后， 等待时间根据柑橘物种确定， 取花 柱放于固定液中固定， 然后用乙醇溶液清洗， 清 洗后水浴加热软化， 软化时间根据柑橘物种确 定， 软化后的柱头用清水清洗后利用水溶性苯胺 蓝溶液进行染色； 5.用显微镜观察染色后花柱上 花粉的萌发情况， 确定柑橘自交亲和与否。 本发 明提供了一套用于鉴定柑橘自交亲和与否的规 范化流程， 提供柑橘不同物种授粉后花柱采集时 间及软化时间， 可准确高效鉴定柑橘植株是否自 。

3、交亲和。 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 110199868 A 2019.09.06 CN 110199868 A 1.一种适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤1.收集柑橘植株的花粉； 步骤2.配制柑橘植株花粉的萌发培养基， 对柑橘植株的花粉进行培养； 步骤3.利用花粉对原柑橘植株上的花朵进行授粉； 步骤4.等待一定时间后， 等待时间根据柑橘物种确定， 取花柱的柱头部分进行固定处 理， 固定处理后水浴加热软化， 软化时间根据柑橘物种确定， 再对软化后的柱头进行染色； 步骤5.用显微镜观察染色完成后的花柱上花粉的萌发情况， 确定柑橘是否自交亲。

4、和。 2.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 其特征在于， 所 述步骤2具体包括以下步骤： 步骤2.1、 配制柑橘植株花粉的萌发培养基， 将培养基加在离心管管盖上； 步骤2.2、 使培养基在管盖中均匀分布， 将花粉均匀分布在培养基表面； 步骤2.3、 3-5h后用光学显微镜观察花粉管萌发情况， 确认花粉活力。 3.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 其特征在于， 所 述步骤3具体包括以下步骤： 去除待授粉花朵雄蕊， 蘸取活力正常的花粉， 授在未开放的成 熟花朵的柱头上， 然后用授粉袋包住花朵。 4.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘自交。

5、亲和与否的方法， 其特征在于， 所 述步骤4具体包括以下步骤： 步骤4.1、 等待一定时间后， 摘下授粉袋， 等待时间根据柑橘物种确定； 步骤4.2、 取花柱的柱头部分放于卡诺固定液中进行固定， 固定时间不超过24h； 步骤4.3、 固定结束后， 用乙醇溶液清洗柱头， 清洗后取柱头放于于NaOH溶液中， 水浴加 热软化， 软化时间根据柑橘物种确定； 步骤4.4、 将软化后的柱头用清水清洗3-4遍， 然后利用水溶性苯胺蓝溶液对柱头染色 30min以上。 5.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 其特征在于， 所 述步骤4中与等待时间与柑橘物种之间的关系是： 若物种是山金柑。

6、， 则等待时间为3天半， 若 物种是柠檬类， 则等待时间为7天， 若物种是橘类， 则等待时间为5天， 若物种是柚类， 则等待 时间为6天。 6.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘是否自交亲和与否的方法， 其特征在 于， 所述步骤4中与软化时间与柑橘物种之间的关系是： 若物种是山金柑， 则软化时间为 7min， 若物种是柠檬类， 则软化时间为20min， 若物种是橘类， 则软化时间为20min， 若物种是 柚类， 则软化时间为60min。 7.根据权利要求1所述的适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 其特征在于， 所 述步骤4中， 水溶性苯胺蓝溶液的浓度为0.1。 权利要求书 1/1 。

7、页 2 CN 110199868 A 2 一种适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法 技术领域 0001 本发明涉及鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 具体涉及一种适合活体快速鉴定柑橘 自交亲和与否的方法。 背景技术 0002 柑橘是世界第一大果树， 中国南方第一大果树， 具有巨大的产业价值。 在柑橘生产 中， 果实无籽是一种非常重要的特性， 其来源于自交不亲和及单性结实， 因此， 柑橘类果实 自交不亲和性状的研究在生产实践中有着重要的价值。 0003 自交不亲和性是被子植物防止自花授粉、 受精及保持物种适应性最重要的机制之 一， 该机制通过调节柱头识别， 来拒绝或接受具有相似遗传关系个体的花粉， 。

8、最终达到优化 后代基因型的目的。 自交不亲和性在遗传上受单一位点的复等位基因控制， 称为S位点， 不 亲和反应表现为当花粉与花柱S基因型相同时， 花粉管在花柱中停止生长， 从而使植物不能 受精。 0004 生产中， 判断柑橘自交亲和与否， 多数是由农户的经验决定， 或是参考授粉结实 率， 但这种方式工作量大， 周期长， 且受人为及环境影响因素较大。 因此， 授粉后对花柱进行 苯胺蓝染色， 观察花粉管在柱头中的生长状态， 成为了判断亲和与否的常用方法。 胼胝质是 一种以 -1,3键结合的葡聚糖， 分布于高等植物的筛管、 花粉粒、 花粉管及新近形成的细胞 壁中， 苯胺蓝与花粉管中的胼胝质结合在紫外。

9、光下呈现黄绿色荧光， 从而能有效观察其生 长形态。 在配子体自交不亲和中， 信号分子是由柱头表面细胞所产生， 不亲和反应是发生在 不亲和的花粉管之中， 最终导致花粉管生长被抑制。 苯胺蓝染色发现绝大多数具有配子体 自交不亲和的物种花粉管都在花柱内部停止生长。 传统的苯胺蓝染色方法多用于茄科、 蔷 薇科等作物上， 而在柑橘类物种中， 苯胺蓝染色授粉后采样时间、 组织固定液配方、 及组织 软化、 染色等时间未被系统的报道过。 0005 本课题组利用柚类、 橘类、 柠檬及山金柑等柑橘中主要物种为材料， 确定各物种苯 胺蓝染色准确流程与方法。 相对于传统的方式而言， 利用苯胺蓝染色活体鉴定柑橘自交亲 。

10、和与否的方法具有稳定性高、 可重复性强、 周期短、 工作量少及结果准确性高等优势。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种适合活体的快 速鉴定柑橘自交亲和与否的方法。 0007 本发明解决上述技术问题的技术方案如下： 0008 一种适合活体快速鉴定柑橘自交亲和与否的方法， 包括以下步骤： 0009 步骤1.收集柑橘植株的花粉； 0010 步骤2.配制柑橘植株花粉的萌发培养基， 对柑橘植株的花粉进行培养； 0011 步骤3.利用花粉对原柑橘植株上的花朵进行授粉； 0012 步骤4.等待一定时间后， 等待时间根据柑橘物种确定， 取花柱的柱头部分进行固 说明。

11、书 1/4 页 3 CN 110199868 A 3 定处理， 固定处理后水浴加热软化， 软化时间根据柑橘属物种确定， 再对软化后的柱头进行 染色； 0013 步骤5.用显微镜观察染色完成后的花柱上花粉的萌发情况， 确定柑橘自交亲和与 否。 0014 进一步的， 所述步骤2具体包括以下步骤： 0015 步骤2.1、 配制柑橘植株花粉的萌发培养基， 将培养基加在离心管管盖上； 0016 步骤2.2、 使培养基在管盖中均匀分布， 将花粉均匀分布在培养基表面； 0017 步骤2.3、 3-5h后用光学显微镜观察花粉管萌发情况， 确认花粉活力。 0018 进一步的， 所述步骤3具体包括以下步骤： 去除。

12、待授粉花朵雄蕊， 蘸取活力正常的 花粉， 授在未开放的成熟花朵的柱头上， 然后用授粉袋包住花朵。 0019 进一步的， 所述步骤4具体包括以下步骤： 0020 步骤4.1、 等待一定时间后， 摘下授粉袋， 等待时间根据柑橘物种确定； 0021 步骤4.2、 取花柱的柱头部分放于卡诺固定液中进行固定， 固定时间不超过24h； 0022 步骤4.3、 固定结束后， 用乙醇溶液清洗柱头， 清洗后取柱头放于于NaOH溶液中， 水 浴加热软化， 软化时间根据柑橘物种确定； 0023 步骤4.4、 将软化后的柱头用清水清洗3-4遍， 然后利用水溶性苯胺蓝溶液对柱头 染色30min以上。 0024 进一步的。

13、， 所述步骤4中与等待时间与柑橘物种之间的关系是： 若物种是山金柑， 则等待时间为3天半， 若物种是柠檬类， 则等待时间为7天， 若物种是橘类， 则等待时间为5 天， 若物种是柚类， 则等待时间为6天。 0025 进一步的， 所述步骤4中与软化时间与柑橘物种之间的关系是： 若物种是山金柑， 则软化时间为7min， 若物种是柠檬类， 则软化时间为20min， 若物种是橘类， 则软化时间为 20min， 若物种是柚类， 则软化时间为60min。 0026 进一步的， 所述步骤4中， 水溶性苯胺蓝溶液的浓度为0.1。 0027 本发明的有益效果为： 本发明提供一套规范化的流程， 用以对柑橘花粉管进行。

14、苯 胺蓝染色， 鉴定自交亲和与否， 本发明提供柑橘不同物种授粉后花柱采集时间及软化时间， 可以准确高效鉴定柑橘植株是否自交亲和。 附图说明 0028 图1为山金柑花粉活力检测结果图。 0029 图2为山金柑、 柠檬类、 橘类、 柚类自交授粉后花粉管的萌发荧光图。 具体实施方式 0030 以下对本发明的原理和特征进行描述， 所举实例只用于解释本发明， 并非用于限 定本发明的范围。 0031 1.材料选取 0032 选取8个柑橘品种为待测材料， 如表1所示。 0033 表1八个柑橘待测材料 说明书 2/4 页 4 CN 110199868 A 4 0034 0035 2.花粉采集 0036 采上述。

15、8种柑橘材料的花朵， 将花药采下收集到干净滤纸或白纸上， 在28烘箱中 烘干12h， 使花药散粉， 收集到离心管中。 0037 3.花粉活力鉴定 0038 配制柑橘属植株花粉的萌发培养基， 如表2所示， pH值调至6.0， 不能超过6.2。 将培 养基加在1.5ml离心管管盖上， 再将8种柑橘花粉均匀分布在培养基表面， 注意不要出现明 显聚集的花粉， 4h后用光学显微镜观察花粉管萌发情况， 确认花粉活力良好， 观察结果如图 1所示。 0039 表2柑橘花粉萌发培养基配方 0040 0041 4.授粉 0042 用镊子去除待授粉花朵雄蕊， 用授粉毛笔蘸取活力正常的花粉， 授在未开放的成 熟花朵的。

16、柱头上， 而后用硫酸授粉袋包住花朵， 标注好授粉品种。 0043 5.固定软化染色 说明书 3/4 页 5 CN 110199868 A 5 0044 山金柑在授粉后3天半摘下授粉袋， 柠檬类在授粉后7天摘下授粉袋， 橘类在授粉 后5天摘下授粉袋， 柚类在授粉后6天摘下授粉袋。 取花柱的柱头部分放于卡诺固定液中(无 水乙醇 冰醋酸3 1)， 固定时间不超过24h， 固定结束后， 用95乙醇溶液清洗2-3遍， 清洗 后取柱头于4mol/LNaOH溶液中， 65水浴加热软化， 山金柑软化7min， 柠檬类软化20min， 橘 类软化20min， 柚类软化60min。 软化后的柱头用清水清洗3-4遍。

17、， 清洗后加入0.1水溶性苯 胺蓝溶液(用0.1mol/L K3P04配制)， 染色30min以上。 授粉后等待时间及软化时间见表3 0045 表3不同物种柑橘授粉后采样时间及软化时间 0046 0047 6.观察 0048 加一滴甘油于载玻片上， 将染色完成的花柱置于甘油中， 用盖玻片轻轻压住花使 花柱展平， 用紫外光显微镜观察花粉萌发情况。 观察结果如图2所示， 图2中每个图片的上部 分为花柱柱头荧光图， 下部分为花柱底端荧光图。 由图2可明显看出柑橘植株是否自交亲 和。 0049 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内， 所作的任何修改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 110199868 A 6 图1 说明书附图 1/2 页 7 CN 110199868 A 7 图2 说明书附图 2/2 页 8 CN 110199868 A 8 。