利用蓝藻治理土壤并固氮的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910612112.5 (22)申请日 2019.07.08 (71)申请人 山东多芬农业有限公司 地址 262500 山东省潍坊市青州市开发区 青垦路南首157号 (72)发明人 赵广林钟美娟范孝芹 (51)Int.Cl. C09K 17/14(2006.01) A01N 65/00(2009.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 21/00(2006.01) C09K 101/00(2006.01) (54)发明名称 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法。

2、 (57)摘要 本发明涉及一种利用蓝藻治理土壤并固氮 的方法， 其特征在于， 将蓝藻晾干粉碎后施入土 壤中， 本申请可以疏松土壤， 并减少肥料的使用 量。 权利要求书1页 说明书6页 CN 110205135 A 2019.09.06 CN 110205135 A 1.一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 将蓝藻施入到土壤中。 2.如权利要求1所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 所述蓝藻为粉碎蓝 藻； 所述施入为基施。 3.如权利要求1或2所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 还包括施入蓝 藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 4.如权利要求3所述利。

3、用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 所述固氮蓝藻是鱼 腥藻、 速丝藻、 拟柱藻、 胶刺藻和节球藻中的一种或几种； 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 5.如权利要求4所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 所述酶提取选用的 酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 6.如权利要求5所述利用蓝藻。

4、治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 还包括向提取液中 加入抗氧剂； 所述抗氧剂为水溶性抗氧剂。 7.如权利要求6所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 抗氧剂和步骤3） 中 的提取液的质量比为0.15:1000。 8.如权利要求5所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 步骤1） 中的水为去 氧水， 氧含量低于5mg/L。 9.如权利要求5所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 其特征在于， 步骤2） 和步骤3） 中 所述一定条件为温度3055， 提取时间672h； 灭酶条件为温度80120,时间5 10min。 10.如权利要求5至9任意一项所述利用蓝藻治理土壤并固氮的方法，。

5、 其特征在于， 粉碎 后的蓝藻和水的质量比为13:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.15:1000； 纤维素酶和 粗提液的质量比是0.15:1000。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110205135 A 2 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法。 背景技术 0002 蓝藻又名蓝绿藻 （bluegreen algae） ， 是一类进化历史悠久、 革兰氏染色阴性、 无鞭毛、 含叶绿素a， 但不含叶绿体(区别于真核生物的藻类)、 能进行产氧性光合作用的大 型单细胞原核生物。 有的蓝细菌在受氮、 磷等元素污染后引起富营养化的海水 “绿。

6、潮” 和湖 泊的 “水华” ， 给渔业和养殖业带来严重危害。 通常处理为将蓝藻打捞后， 进行填埋或焚烧。 由于蓝藻中含有环肽、 生物碱等毒素， 采用填埋的方式可能会对水体造成污染； 而采用焚烧 的方法则会对大气造成污染。 0003 目前也有将蓝藻进行处理后用作肥料的方法， 一种是将蓝藻通过堆肥的方式腐熟 后， 施入到土壤中， 一种是采用酸碱、 微生物或酶提取的方式， 对蓝藻进行提取， 将提取液直 接或混以其它物质施入到土壤中。 然而蓝藻伪孔胞包含有大量中空的亚显微圆柱体-气囊， 亲气疏水， 这些气囊由蛋白质壁组成的柱状气泡， 两端锥形， 横断面为六边形， 蓝藻通过气 囊的破裂和重组实现下沉和升。

7、降。 采用上述几种方法均会破坏蓝藻的细胞壁， 致使蓝藻的 气囊破裂， 从而失去了上升和下降的功能。 施入土壤中， 成为了不能活动的死物， 在调理土 壤方面仅能为土壤提供有机质， 不能通过自身的移动起到疏松土壤的作用， 调理土壤效果 欠佳。 0004 固氮蓝藻中含有固氮酶， 可以起到固氮的作用， 然而将上述三种方法制备的固氮 蓝藻提取液应用于土壤中， 其几乎起不到的固氮的效果。 究其原因， 申请人认为酸碱化学方 法制备的提取液， 由于提取时是在酸碱条件下提取的， 且提取时间较长， 容易造成酶的失 活， 因此， 施入土壤无法起到固氮的效果； 使用微生物发酵， 则会对酶造成破坏分解， 因此， 应用于。

8、土壤也达不到固氮的效果； 采用酶提取， 由于酶具有专一性， 酶的选择成为了关键， 选择酶不适当也很容易对固氮酶造成破坏， 如采用蛋白酶提取， 由于固氮酶其主要成分为 蛋白质， 因此采用蛋白酶提取会对固氮酶中的蛋白质造成破坏， 使酶失活， 施入土壤中也达 不到固氮的效果。 0005 目前， 尚未有将固氮蓝藻施入土壤， 可以更好的起到疏松土壤的效果， 并可以更好 的发挥固氮酶的作用， 减少肥料使用量的产品和方法。 发明内容 0006 本发明提供一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 解决技术问题是1） 进一步提升 蓝藻调理土壤的性能； 2） 进一步发挥蓝藻固氮酶的固氮效果， 以减少肥料的使用量。 00。

9、07 为了解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案： 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0008 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0009 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 说明书 1/6 页 3 CN 110205135 A 3 0010 所述固氮蓝藻是鱼腥藻、 速丝藻、 拟柱藻、 胶刺藻和节球藻中的一种或几种； 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0011 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶。

10、酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 0012 还包括向提取液中加入抗氧剂； 所述抗氧剂为水溶性抗氧剂。 0013 抗氧剂和步骤3） 中的提取液的质量比为0.15:1000。 0014 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量低于5mg/L。 0015 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度3055， 提取时间672h； 灭酶条件为 温度80120,时间510min。 0016 粉碎后的蓝藻和水的质量比为14:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.15: 1000； 纤维。

11、素酶和粗提液的质量比是0.15:1000。 0017 发明具有以下有益技术效果： 1.本申请将蓝藻直接施入土壤中， 不会对蓝藻中的气囊造成破坏， 施入土壤中的蓝藻 通过气囊在土壤中小范围活动， 可以更好的起到疏松土壤的效果。 0018 2.本申请采用果胶酶和纤维素酶并在除氧的条件下对蓝藻进行提取， 可以保留蓝 藻固氮酶的活性。 0019 3.本申请加入抗氧剂， 可以延长蓝藻固氮酶的时效， 以便在土壤中更好的发挥其 固氮效果， 减少肥料的使用量。 0020 4.本申请制备蓝藻提取液选择固氮蓝藻， 施入土壤可以起到固氮， 减少肥料使用 量。 0021 5.本申请蓝藻提取液采用滴灌的方式施入， 可以。

12、更好的发挥固氮酶固氮的作用， 由于目前土壤酸化板结严重， 透气性差， 采用基施的话， 会使含有固氮酶的提取液无法与空 气中的氮气接触， 导致无法发挥固氮的作用。 具体实施方式 0022 下面结合具体实例进一步说明本发明。 0023 实施例1 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0024 所述蓝藻为粉碎的鱼腥藻； 所述施入为基施。 0025 实施例2 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0026 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0027 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 0028 所述蓝藻均为鱼腥藻； 所述蓝藻提取液提取方。

13、法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为基施。 说明书 2/6 页 4 CN 110205135 A 4 0029 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 0030 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量为1mg/L。 0031 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度40， 提取时间12h； 灭酶条件为温度85 ,时间8mi。

14、n。 0032 粉碎后的蓝藻和水的质量比为3:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.5:1000； 纤维 素酶和粗提液的质量比是0.6:1000。 0033 实施例3 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0034 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0035 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 0036 所述蓝藻均为鱼腥藻； 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0037 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶。

15、加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 0038 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量为1mg/L。 0039 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度40， 提取时间12h； 灭酶条件为温度85 ,时间8min。 0040 粉碎后的蓝藻和水的质量比为3:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.5:1000； 纤维 素酶和粗提液的质量比是0.6:1000。 0041 实施例4 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0042 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为。

16、基施。 0043 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 0044 所述蓝藻均为鱼腥藻。 0045 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0046 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 说明书 3/6 页 5 CN 110205135 A 5 取液。 0047 还包括向提取液中加入抗氧。

17、剂； 所述抗氧剂为维生素C。 0048 抗氧剂和步骤3） 中的提取液的质量比为0.2:1000。 0049 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量为1mg/L。 0050 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度40， 提取时间12h； 灭酶条件为温度85 ,时间8min。 0051 粉碎后的蓝藻和水的质量比为3:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.5:1000； 纤维 素酶和粗提液的质量比是0.6:1000。 0052 实施例5 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0053 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0054 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮。

18、蓝藻。 0055 所述固氮蓝藻是鱼腥藻和速丝藻按照质量比3:1的组合物。 0056 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0057 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 0058 还包括向提取液中加入抗氧剂； 所述抗氧剂为维生素C和茶多酚按照质量不比1:1 的组合物。 0059 抗氧剂和步骤3。

19、） 中的提取液的质量比为1:1000。 0060 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量为0.5mg/L。 0061 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度35， 提取时间48h； 灭酶条件为温度100 ,时间5min。 0062 粉碎后的蓝藻和水的质量比为4:10； 果胶酶和混合液的质量比是3:1000； 纤维素 酶和粗提液的质量比是2:1000。 0063 实施例6 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0064 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0065 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 0066 所述固氮蓝藻是鱼腥藻、 拟柱藻和节球藻按照。

20、质量比3:1:2的组合物。 0067 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0068 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 说明书 4/6 页 6 CN 110205135 A 6 取液。 0069 还包括向提取液中加入抗氧剂； 所述抗氧剂为茶多酚。 0070 抗氧剂和步骤3） 中的提取液的质量比为0。

21、.6:1000。 0071 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量0.3mg/L。 0072 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度50， 提取时间29h； 灭酶条件为温度95 ,时间8min。 0073 粉碎后的蓝藻和水的质量比为2:10； 果胶酶和混合液的质量比是0.8:1000； 纤维 素酶和粗提液的质量比是2:1000。 0074 实施例7 一种利用蓝藻治理土壤并固氮的方法， 将蓝藻施入到土壤中。 0075 所述蓝藻为粉碎蓝藻； 所述施入为基施。 0076 还包括施入蓝藻提取液； 蓝藻提取液中的蓝藻为固氮蓝藻。 0077 所述固氮蓝藻是鱼腥藻、 速丝藻、 拟柱藻、 胶刺藻和节球藻中的一。

22、种或几种 所述蓝藻提取液提取方法为酶提取； 蓝藻提取液施入方法为滴灌。 0078 所述酶提取选用的酶为果胶酶和纤维素酶； 提取方法按照以下步骤进行： 1） 制备混合液： 将蓝藻粉碎后加入到水中， 得混合液； 2） 制备粗提取液： 将果胶酶加入到混合液中， 在一定条件下进行提取， 灭酶， 得粗提取 液； 3） 制备提取液： 向粗提取液中加入纤维素酶， 在一定条件下提取， 经灭酶和过滤， 得提 取液。 0079 还包括向提取液中加入抗氧剂； 所述抗氧剂为水溶性抗氧剂。 0080 抗氧剂和步骤3） 中的提取液的质量比为1:1000。 0081 步骤1） 中的水为去氧水， 氧含量为3mg/L。 008。

23、2 步骤2） 和步骤3） 中所述一定条件为温度45， 提取时间8h； 灭酶条件为温度85, 时间10min。 0083 粉碎后的蓝藻和水的质量比为3:10； 果胶酶和混合液的质量比是1:1000； 纤维素 酶和粗提液的质量比是3:1000。 0084 下面结合实验数据进一步说明本发明的有益效果： 供试材料 1材料与方法： 1.1试验地点： 青岛科创质量检测有限公司。 0085 1.2实验检测： 检测固氮酶活性 （mmC2H4/OD/分） 以及置于空气中48h的固氮酶活性 （mmC2H4/OD/分） 。 0086 1.3供试材料： 对比1 （除采用水为未除氧的水， 氧含量为8 mg/L外， 其它。

24、制备方法 均与实施例2中提取液的制备方法一致） 、 实施例2的提取液、 对比2 （除步骤3） 中还加入与纤 维素酶等质量的蛋白酶外， 其它制备方法均与实施例4中提取液的制备方法一致） 和实施例 4的提取液。 0087 1.4实验方法： 采用乙炔还原法进行固氮酶活性检测。 说明书 5/6 页 7 CN 110205135 A 7 0088 本实验除实验处理不同外， 其它操作均一致。 0089 2结果与分析 各处理中固氮酶活性 （mmC2H4/OD/min） 以及置于空气中48h后的固氮酶活性 （mmC2H4/ OD/min） 见表1 表1 酶活性 （mmC2H4/OD/min）48h后酶活性 （。

25、mmC2H4/OD/min） 对比177237 实施例21363672 对比2460 实施例41359859 由表1中对比1和实施例2的数据可以看出， 在生产工艺中采用非除氧水和除氧水， 直接 影响到了固氮酶的活性， 采用除氧水具有较好的效果； 由实施例2和实施例4效果比较， 可以 看出加入抗氧剂可以相对保持固氮酶的活性； 由对比2和实施例4的数据可以看出， 酶的选 择也会影响固氮酶的活性， 尤其是采用蛋白质酶， 其会将固氮酶降解， 使固氮酶失活。 0090 实验2 1.1试验地点： 青州市庙子镇。 0091 1.2实验检测： 土壤空隙、 玉米产量以及玉米秸秆和籽粒中粗蛋白的含量。 0092 。

26、1.3供试材料： 对比3 （除施入的蓝藻为发酵过的蓝藻外， 其它均与实施例1一致） 、 实施例1、 实施例2、 实施例3和实施例4。 0093 1.4实验方法： 试验田取地况相近相邻的10亩田， 田中土壤为板结土壤， 以每两亩为一组。 每亩播种玉 米种2.4kg， 采用机械播种， 玉米种为登海605， 每组分别采用对比3 （除施入的蓝藻为发酵过 的蓝藻外， 其它均与实施例1一致） 、 实施例1、 实施例2、 实施例3和实施例4进行处理， 基施 200kg/亩； 孔隙度检测为施用后第30天进行检测。 0094 1.5检测方法： 凯氏定氮法检测秸秆和籽粒中氮的百分含量 （N%） ， 粗蛋白含量 （。

27、CPC%） =N%*6.25。 0095 本实验除实验处理不同外， 其它操作均一致。 0096 2结果与分析 土壤空隙、 玉米产量及玉米籽粒和秸秆粗蛋白含量， 见表2 表2 施用前孔隙度 （%）施用后孔隙度 （%）产量 （kg）籽粒粗蛋白含量 （%）秸秆粗蛋白 （%） 对比36.87.0652.88.175.23 实施例16.77.3661.98.195.25 实施例26.87.3672.68.315.42 实施例36.87.4684.58.565.63 实施例46.77.3705.48.955.88 由表2可以看出， 施用未处理的蓝藻相较于施用发酵过的蓝藻， 可以更好得起到疏松土 壤的效果， 采用将蓝藻和蓝藻提取液一起基施的实施例2虽然可以相对提高玉米产量以及 籽粒和秸秆的粗蛋白含量， 但是明显与蓝藻采用基施， 提取液采用滴灌的实施例3有差距； 相对而言， 加入抗氧剂的实施例4的效果最好。 说明书 6/6 页 8 CN 110205135 A 8 。