基因工程菌湿细胞的收集与保存方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910486085.1 (22)申请日 2019.06.05 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 张君轩付妍付雪蓉解雨晨 任泓宇刘立明刘佳陈修来 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 彭素琴 (51)Int.Cl. C12N 1/21(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12P 13/04(2006.01) C12R 1/19(2006.01)。

2、 (54)发明名称 一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法 (57)摘要 本发明公开了一种基因工程菌湿细胞的收 集与保存方法， 属于生物工程技术领域。 利用本 发明的方法对共表达苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶 和亮氨酸脱氢酶的大肠杆菌进行湿细胞收集与 保存， 湿菌体保存2个月后， 利用解冻后湿细胞转 化生产L-2-氨基丁酸， 底物L-苏氨酸转化率达到 96.8， 三种酶的相对于新鲜湿细胞的酶活均能 达到90.0以上。 权利要求书1页 说明书5页 序列表7页 附图2页 CN 110229773 A 2019.09.13 CN 110229773 A 1.一种基因工程菌株湿细胞的收集与保存方法， 其特征。

3、在于， 将基因工程菌株的发酵 液降温至415， 加入50100mmol/L半胱氨酸和/或520 mol/L辅酶磷酸吡哆醛， 混匀 后60008000rpm离心510min获得湿细胞； 所述基因工程菌株以大肠杆菌为宿主， 共表达 苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。 2.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 离心温度为415。 3.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 收集的湿细胞菌泥的含水量为 7580。 4.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 将工程菌株置于-10-20冷冻 保存。 5.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 所述苏氨酸脱。

4、氨酶的氨基酸序列 如SEQ ID NO.4所示， 所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示， 所述甲酸脱氢 酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。 6.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 所述基因工程菌株中， 用 pETDuet-1质粒表达苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶， 用pRSFDuet-1质粒表达亮氨酸脱氢酶。 7.如权利要求1所述的收集与保存方法， 其特征在于， 所述大肠杆菌为大肠杆菌 (Escherichia coli)BL21。 8.权利要求1-7任一所述方法在生产L-2-氨基丁酸中的应用。 9.如权利要求8所述的应用， 其特征在于， 基因工程菌株是。

5、以大肠杆菌为宿主， 共表达 苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶、 亮氨酸脱氢酶三种酶， 将基因工程菌株的发酵液降温至415 ， 加入50100mmol/L半胱氨酸， 520 mol/L辅酶磷酸吡哆醛， 混匀后60008000rpm离 心510min获得湿细胞， 以L-苏氨酸为底物， 以得到的基因工程菌株湿细胞为全细胞催化 剂生产L-2-氨基丁酸。 10.如权利要求9所述的应用， 其特征在于， 其特征在于， 所述基因工程菌株用于转化实 验时， 加入3.5-4.5倍体积1525去离子水， 自然解冻或2550rpm低速搅拌解冻。 权利要求书 1/1 页 2 CN 110229773 A 2 一种基因工程菌湿。

6、细胞的收集与保存方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法， 属于生物工程技术领域。 背景技术 0002 L-2-氨基丁酸(L-ABA)是一种非天然氨基酸， 作为一种重要的化工原材料和手性 医药中间体， 目前已广泛应用于抑菌抗结核药物盐酸乙胺丁醇、 新型抗癫痫药物左乙拉西 坦和布瓦西坦等药物合成领域。 0003 目前， 已被报道的L-ABA的合成方法包括化学法和生物法。 化学法主要包括酮丁酸 还原法、 脱硫反应法等， 化学法易形成消旋体， 不利于手性化合物的合成， 并且反应条件严 苛， 试剂成本高， 环境污染严重， 不易进行工业化生产。 0004 生物法因其反应条。

7、件温和、 立体选择性高和绿色环保等特点受到广泛的关注。 酶 法主要利用苏氨酸脱氨酶(L-TD)、 亮氨酸脱氢酶(LDH)， 偶联甲酸脱氢酶(FDH)或葡萄糖脱 氢酶(GDH)， 以L-苏氨酸为底物合成L-ABA， 同时FDH或GDH实现辅酶NADH的循环。 国外较早开 展了利用氨基酸脱氢酶转化生产L-ABA的工作。 1997年Galkin等以2-酮丁酸为底物， 通过偶 联T.intermedius来源的亮氨酸脱氢酶(LDH)和NADH循环再用酶甲酸脱氢酶(FDH)， 最终获 得36g/L的L-ABA， 产物得率为88， 但底物2-酮丁酸不稳定且价格高。 2014年Tao等在大肠 杆菌中分别表达。

8、L-TD、 LDH和FDH， 在30L转化体系中将30mol L-苏氨酸转化为29.2mol L- ABA， 产率为97.3， 时空产率达到了6.37g/(Lh)。 2018年张蔡喆构建两株分别表达TD和 共表达LDH/GDH的重组大肠杆菌， 在此基础上构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联 产L-ABA和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统， 采用分批补料策略， 最终转化得到141.6g/L的L- ABA和269.4g/L的D-葡萄糖酸， 该方法转化效果较好， 但是需要添加两种菌体、 两种底物， 分 离两种产物， 增加了工艺的复杂性。 0005 发明人前期利用双质粒的重组菌株共表达了L-TD、 。

9、LDH和FDH， 实现添加单一菌株， 全细胞转化L-苏氨酸生产L-ABA(专利公开号： CN109266595A)， 简化了生产工艺。 在实际应 用过程中， 发酵收集的菌泥需要保藏后解冻用于转化实验， 收集与储存的方式会影响酶活， 进而影响转化效果。 如在较低温度时， FDH会因为游离的巯基被氧化而失活。 因此， 提供一种 高效、 低成本、 易于放大、 减少保藏过程中酶活损失的全细胞收集与保存的方法， 对于实现 酶法工业化生产有重要的应用价值。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种基因工程菌株湿细胞的收集与保存方法， 是将基因工 程菌株的发酵液降温至415， 加入50100mmol/L。

10、半胱氨酸和/或520 mol/L辅酶磷酸 吡哆醛， 混匀后60008000rpm离心510min获得湿细胞； 所述基因工程菌株以大肠杆菌为 宿主， 共表达苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶。 0007 本发明的一种实施方式中， 离心温度为415。 0008 本发明的一种实施方式中， 收集的湿细胞菌泥的含水量为7580。 说明书 1/5 页 3 CN 110229773 A 3 0009 本发明的一种实施方式中， 将工程菌株置于-10-20冷冻保存。 0010 本发明的一种实施方式中， 基因工程菌株需分批保存， 不能反复冻融。 0011 本发明的一种实施方式中， 所述工程菌株用于转化实验时。

11、， 加入3.5-4.5倍体积15 25去离子水， 自然解冻或2550rpm低速搅拌解冻。 0012 本发明的一种实施方式中， 所述苏氨酸脱氨酶来源于大肠杆菌Escherichia coli W3110， 基因序列如SEQ ID NO.1所示， 氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。 0013 在本发明的一种实施方式中， 所述亮氨酸脱氢酶来源于苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis serovar kurstaki YBT-1520， 基因序列如SEQ ID NO.2所示， 氨基酸序列 如SEQ ID NO.5所示。 0014 在本发明的一种实施方式中， 所述甲酸脱氢酶来源。

12、于假丝酵母(Candida)， 基因序 列如SEQ ID NO.3所示， 氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。 0015 本发明的一种实施方式中， pETDuet-1质粒用于表达苏氨酸脱氨酶、 甲酸脱氢酶， pRSFDuet-1质粒用于表达亮氨酸脱氢酶。 0016 本发明的一种实施方式中， 所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。 0017 本发明的另一个目的在于提供上述方法生产L-2-氨基丁酸中的应用， 是以L-苏氨 酸为底物， 以上述基因工程菌株湿细胞为全细胞催化剂。 0018 本发明的一种实施方式中， 转化条件为： 5L发酵罐中， 搅拌转速400r/min， 温度37 ， 通气3vvm， 用。

13、纯化水溶解L-苏氨酸80g/L， 甲酸铵40g/L， NAD+为30mg/L， 湿菌体20g/L， 用 4mol/L NaOH溶液控制pH 8.0， 转化体积为2L。 0019 本发明的有益效果： 0020 (1)本发明所述的方法中， 不需经过冷冻干燥、 添加大量保护剂等处理过程， 只需 要将发酵液降温后加入50100mmol/L半胱氨酸， 520 mol/L辅酶磷酸吡哆醛PLP后低温 离心收集菌体， 成本较低且操作简便。 0021 (2)按照本方法收集菌体后， 保存于冷库中-10-20可以长达2个月， 酶活维持 90以上， 转化率仍可达到96.8， 具有工业应用价值。 附图说明 0022 图。

14、1： 保护剂添加对FDH保存酶活的影响(a)L-TD酶活变化曲线； (b)LDH酶活变化曲 线； (c)FDH酶活变化曲线 0023 图2： 冷冻基因工程菌株转化生产L-2-氨基丁酸 具体实施方式 0024 以下实施案例都是采用常规实验方法， 实验材料均从商业途径可得， 双质粒共表 达L-TD、 LDH和FDH基因工程菌株由课题组前期构建(专利公开号： CN109266595A)。 0025 (一)2-氨基丁酸含量的测定方法 0026 样品预处理： 取转化液12000rpm离心10min收集上清液， 并以 -丁酮酸或者2-氨基 丁酸作为标准品， 配制标准溶液。 将适度稀释后的上清液和标准溶液分。

15、别经0.22 m微孔滤 膜过滤后， 用高效液相色谱法测定2-氨基丁酸。 0027 2-氨基丁酸含量的测定： 高效液相色谱法， 以邻苯二甲醛(OPA)为衍生化试剂， 色 说明书 2/5 页 4 CN 110229773 A 4 谱柱:ZO RBAX SB-C18， 流动相A为10mmol/L KH2PO4(4mol/L KOH调节pH 5.3)， 流动相B为乙 腈： 甲醇： A相5:3:1(冰醋酸调pH 5.3)梯度洗脱， 流速1mL/min， 荧光检测器， 检测波长 330， 460nm， 柱温30。 0028 (二)L-TD、 LDH和FDH酶活的定义及检测方法 0029 苏氨酸脱氨酶酶活检。

16、测： 取200 L适当稀释的BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet- CbFDH-EcTD菌液， 加入1800 L底物(底物体系： 采用50mmol/L pH 7.5磷酸二氢钾-磷酸氢二 钾缓冲液溶解50mmol/L苏氨酸)， 于37恒温水浴反应15min， 然后煮沸以终止反应。 样品稀 释10倍， 采用HPLC-OPA柱前衍生法测量苏氨酸减少量。 酶活单位U定义为1min内苏氨酸减少 1 mol所需的酶量。 0030 亮氨酸脱氢酶酶活检测： 取200 L适当稀释的BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet- CbFDH-EcTD菌液， 加入1800 L底物。

17、(底物体系： 采用50mmol/L pH 8.0磷酸二氢钠-磷酸氢二 钠缓冲液溶解30mg/L NAD+、 50mmol/L 2-丁酮酸、 40mmol/L的甲酸铵)， 于37恒温水浴反 应15min， 然后煮沸以终止反应。 样品稀释10倍， 采用HPLC-OPA柱前衍生法测量2-氨基丁酸 生成量。 酶活单位U定义为1min内2-氨基丁酸增加1 mol所需的酶量。 0031 甲酸脱氢酶酶活检测： 取200 L适当稀释的BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet- CbFDH-EcTD菌液， 加入1600 L底物(底物体系： 采用50mmol/L pH 8.0磷酸二氢钠-磷酸氢二。

18、 钠缓冲液溶解0.167mmol/L的甲酸铵， 1.67mmol/L NAD+)， 在37条件下反应， 利用酶标仪 每隔30s检测NADH在340nm处的吸光度， 并作图。 配置不同浓度的NADH标准溶液(0-0.6mmol/ L)在340nm处测定吸光值， 绘制标准曲线， 拟合回归方程。 酶活单位U定义为1min内生成1 mol NADH所需的酶量。 0032 100酶活定义： 发酵结束收集新鲜湿细胞时检测到的酶活。 0033 (三)培养基 0034 种子培养基配方： LB培养基， 酵母粉5g/L， 胰蛋白胨10g/L， NaCl 10g/L。 0035 发酵培养基配方： 甘油8g/L， 酵。

19、母粉8g/L， 大豆蛋白胨10g/L， K2HPO412H2O 6.0g/ L， KH2PO4 10.0g/L。 0036 补料培养基的成分： 甘油500g/L， MgSO47H2O 10g/L。 0037 实施例1保护剂添加对酶活的影响 0038 将BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD按照5接种量接种于发酵培养 基， 通气量2.0vvm， 温度37， 搅拌速率500rpm， 发酵56h， 溶氧突然上升时， 开始溶氧关联 补料， 控制溶氧在3040， 培养至OD600为20.025.0， 将温度下降至25， 加入10g/L乳糖 诱导目标蛋白L-TD、。

20、 LDH和FDH的表达， 发酵培养2224h， OD600在7075， 此时结束发酵， 关 闭通气， 搅拌转速降至50rpm， 发酵罐降温至1015。 0039 发酵液中分别加入50mmol/L Cys、 10 mol/L PLP、 同时加入50mmol/L Cys和10 mol/L PLP， 混匀， 离心温度415， 离心6000rpm， 5min收集湿细胞。 将湿细胞冷冻于-20 ， 间隔不同天数取样， 由于FDH储存酶活最不稳定， 以检测FDH酶活变化情况为指标。 实验 结果如图1(a-c)： 随着冷冻保存时间的延长， L-TD、 LDH和FDH酶活不断下降； 不添加任何保 护剂时， L。

21、-TD、 LDH和FDH酶活降至最初的88.2、 70.2、 72.6， 冷冻酶活稳定性L-TD FDHLDH； 保存30天时， 同时添加50mmol/L Cys和10 mol/L PLP时， 三种酶酶活均维持在 95.0以上。 说明书 3/5 页 5 CN 110229773 A 5 0040 实施例2不同离心方式对酶活的影响 0041 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L Cys和10 mol/L PLP， 离心温度425， 离心转速设置4000 8000rpm， 5min收集湿细胞。 。

22、将湿细胞冷冻于-20， 冷冻30天检测L-TD、 LDH和FDH的相对酶 活， 实验结果如表1， 实验1、 2、 3组和2、 4、 5组分别考察离心转速和时间对酶活的影响， 当离 心转速低， 时间短， 湿细胞含水量高， 冷冻过程中形成冰晶导致蛋白质有损伤， 冷冻30天后， 仅稳定性最佳的L-TD酶活能维持在90左右； 2、 6、 7、 8组考察不同离心温度对酶活的影响， 当离心温度在4和15时， 三种酶酶活均能维持在94.9以上， 当离心温度上升至25和 30时， 高温使得部分蛋白变性失活， LDH和FDH酶活下降至90以下。 0042 表1不同离心方式对酶活的影响 0043 0044 实施例。

23、3反复冻融与解冻方式对酶活的影响 0045 5L发酵罐转化L-苏氨酸生产L-2-氨基丁酸体系： 搅拌转速400r/min， 温度37， 通 气3vvm， 用纯化水溶解L-苏氨酸80g/L， 甲酸铵40g/L， NAD+为30mg/L， 湿菌体20g/L， 用4mol/ L NaOH溶液控制pH 8.0， 转化体积为2L。 0046 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L Cys和10 mol/L PLP， 离心温度10， 离心转速设置8000rpm， 5min收 集湿细胞， 将湿细胞冷冻于-2。

24、0， 冷冻30天后用于转化实验。 冷冻湿细胞解冻后再冷冻即 为冻融一次， 自然解冻或使用磁力搅拌器搅拌菌体进行解冻， 考察反复冻融和解冻方式对 湿细胞转化生产L-2-氨基丁酸的影响， 结果如表2， 实验1、 2、 3组中解冻菌体直接用于转化， L-2-氨基丁酸产量为68.1g/L， 冻融一次和两次产量分别降低至63.2g/L和56.9g/L； 实验1、 4、 5、 6组考察不同搅拌速率对酶活的影响， 自然解冻与底物50rpm搅拌解冻的菌体用于转化 实验， L-苏氨酸转化率在98.0以上， 增加搅拌转速， 转化率显著降低； 菌体冻融或快速搅 拌解冻会导致细胞膜不完整， 异源表达的胞内酶没有稳定的。

25、保护体系， 导致酶活降低， 转化 周期延长。 说明书 4/5 页 6 CN 110229773 A 6 0047 表2反复冻融与解冻方式对酶活的影响 0048 0049 实施例4冷冻基因工程菌株转化生产L-2-氨基丁酸 0050 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L Cys和10 mol/L PLP， 8000rpm， 15， 离心5min收集湿细胞。 将湿细胞 冷冻于-20， 冷冻30、 60、 90天后检测L-TD、 LDH和FDH酶活， 自然解冻后投入转化体系中进 行转化实验， 转化方。

26、式同实施例3， 实验结果如图2： 按照本发明的方法保藏湿菌体， 冷冻60 天， 基因工程菌株中三种酶酶活均能达到新鲜菌体的90以上； 冷冻60天， 用于转化生产目 标产物L-2-氨基丁酸产量为67.0g/L， L-苏氨酸转化率为96.8； 冷冻90天， L-TD、 LDH和FDH 相对酶活分别降为93.2、 85.3和89.3， 此时L-2-氨基丁酸产量仅能够达到62.1g/L。 0051 对比例1 0052 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L -巯基乙醇和10 mol/L PLP， 离心。

27、温度10， 离心转速设置8000rpm， 5min收集湿细胞。 保存30天后， L-TD、 LDH和FDH的相对酶活分别为84.8、 81.9和80.8。 0053 对比例2 0054 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFDuet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L谷胱甘肽和10 mol/L PLP， 离心温度10， 离心转速设置8000rpm， 5min收集湿细胞。 保存30天后， L-TD、 LDH和FDH的相对酶活分别为85.6、 82.3和80.3。 0055 对比例3 0056 按照实施例1中培养方式发酵BL21/pRSFD。

28、uet-BtLeuDH+pETduet-CbFDH-EcTD， 发 酵液中加入50mmol/L二硫苏糖醇和10 mol/L PLP， 离心温度10， 离心转速设置8000rpm， 5min收集湿细胞。 保存30天后， L-TD、 LDH和FDH的相对酶活分别为82.6、 83.7和87.6。 0057 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 5/5 页 7 CN 110229773 A 7 SEQUENCE LISTING 江南大。

29、学 一种基因工程菌湿细胞的收集与保存方法 6 PatentIn version 3.3 1 1545 DNA 人工合成 1 atggctgact cgcaacccct gtccggtgct ccggaaggtg ccgaatattt aagagcagtg 60 ctgcgcgcgc cggtttacga ggcggcgcag gttacgccgc tacaaaaaat ggaaaaactg 120 tcgtcgcgtc ttgataacgt cattctggtg aagcgcgaag atcgccagcc agtgcacagc 180 tttaagctgc gcggcgcata cgccatg。

30、atg gcgggcctga cggaagaaca gaaagcgcac 240 ggcgtgatca ctgcttctgc gggtaaccac gcgcagggcg tcgcgttttc ttctgcgcgg 300 ttaggcgtga aggccctgat cgttatgcca accgccaccg ccgacatcaa agtcgacgcg 360 gtgcgcggct tcggcggcga agtgctgctc cacggcgcga actttgatga agcgaaagcc 420 aaagcgatcg aactgtcaca gcagcagggg ttcacctggg tgccg。

31、ccgtt cgaccatccg 480 atggtgattg ccgggcaagg cacgctggcg ctggaactgc tccagcagga cgcccatctc 540 gaccgcgtat ttgtgccagt cggcggcggc ggtctggctg ctggcgtggc ggtgctgatc 600 aaacaactga tgccgcaaat caaagtgatc gccgtagaag cggaagactc cgcctgcctg 660 aaagcagcgc tggatgcggg tcatccggtt gatctgccgc gcgtagggct atttgctgaa 720。

32、 ggcgtagcgg taaaacgcat cggtgacgaa accttccgtt tatgccagga gtatctcgac 780 gacatcatca ccgtcgatag cgatgcgatc tgtgcggcga tgaaggattt attcgaagat 840 gtgcgcgcgg tggcggaacc ctctggcgcg ctggcgctgg cgggaatgaa aaaatatatc 900 gccctgcaca acattcgcgg cgaacggctg gcgcatattc tttccggtgc caacgtgaac 960 ttccacggcc tgcgctac。

33、gt ctcagaacgc tgcgaactgg gcgaacagcg tgaagcgttg 1020 ttggcggtga ccattccgga agaaaaaggc agcttcctca aattctgcca actgcttggc 1080 gggcgttcgg tcaccgagtt caactaccgt tttgccgatg ccaaaaacgc ctgcatcttt 1140 gtcggtgtgc gcctgagccg cggcctcgaa gagcgcaaag aaattttgca gatgctcaac 1200 gacggcggct acagcgtggt tgatctctcc ga。

34、cgacgaaa tggcgaagct acacgtgcgc 1260 tatatggtcg gcggacgtcc atcgcatccg ttgcaggaac gcctctacag cttcgaattc 1320 ccggaatcac cgggcgcgct gctgcgcttc ctcaacacgc tgggtacgta ctggaacatt 1380 tctttgttcc actatcgcag ccatggcacc gactacgggc gcgtactggc ggcgttcgaa 1440 cttggcgacc atgaaccgga tttcgaaacc cggctgaatg agctggg。

35、cta cgattgccac 1500 gacgaaacca ataacccggc gttcaggttc tttttggcgg gttaa 1545 2 1101 序列表 1/7 页 8 CN 110229773 A 8 DNA 人工合成 2 atgacattag aaatcttcga atacttagaa aaatatgatt atgagcaagt agtattttgt 60 caagataaag aatctggttt aaaagcaatt attgcaattc atgatacaac acttggaccg 120 gctcttggtg gaacaagaat gtggacatat gattct。

36、gaag aagcggcgat tgaagatgca 180 ttgcgtcttg caaaagggat gacatataaa aacgcagcag ctggtttaaa cttaggtggt 240 gcgaaaacag taattatcgg tgatcctcgt aaagataaga gcgaagcaat gttccgtgca 300 ctaggacgtt atatccaagg actaaacgga cgttacatta cagctgaaga tgttggtaca 360 acagtagatg atatggatat tatccatgaa gaaactgact ttgtaacagg tatc。

37、tcacca 420 tcattcggtt cttctggtaa cccatctcca gtaactgcat acggtgttta ccgtggtatg 480 aaagcagctg caaaagaagc tttcggtact gacaatttag aaggaaaagt aattgctgtt 540 caaggcgttg gtaacgtagc atatcaccta tgcaaacatt tacacgctga aggagcaaaa 600 ttaatcgtta cagatattaa taaagaagct gtacaacgtg ctgtagaaga attcggtgca 660 tcagcagtt。

38、g aaccaaatga aatttatggt gttgaatgcg atatttacgc accatgtgca 720 ttaggcgcaa cagttaatga tgaaactatt ccacaactta aagcaaaagt aatcgcaggt 780 tctgcaaata accaattaaa agaaaatcgt cacggtgaca tcattcatga aatgggtatt 840 gtatacgcac cagattatgt aattaatgca ggtggcgtaa ttaacgtagc agacgaatta 900 tatggataca atagagaacg tgcacta。

39、aaa cgtgttgagt ctatttatga cacaattgca 960 aaagtaatcg aaatttcaaa acgcgatggc atagcaactt atgtagcggc agatcgtcta 1020 gctgaagagc gcattgcaag cttgaaaaat tctcgtagca cttacttacg caacggtcac 1080 gatattatta gccgtcgcta a 1101 3 1098 DNA 人工合成 3 atgaaaattg tgctggtgct gtatgatgcg ggcaaacatg cggcggatga agaaaaactg 60 t。

40、atggctgca ccgaaaataa actgggcatt gcgaactggc tgaaagatca gggccatgaa 120 ctgattacca cctctgataa agaaggcggc aacagcgttc tggatcagca tattccggat 180 gcggatatta ttattaccac cccgtttcat ccggcgtata tcaccaaaga acgcatcgat 240 aaagcgaaaa aactgaaact ggtggtggtg gcgggcgtgg gcagcgatca tattgatctg 300 gattatatca accagaccgg。

41、 taaaaaaatt agcgtgctgg aagtgaccgg cagcaacgtg 360 gtgagcgtgg cggaacatgt ggtgatgacc atgctggtgc tggtgcgtaa ctttgtgccg 420 gcgcatgaac aaattattaa ccacgattgg gaagtggcgg cgattgcgaa agatgcgtat 480 gatatcgaag gcaaaaccat tgcgaccatt ggcgcgggtc gtattggcta tcgtgtgctg 540 gaacgtctgg tgccgtttaa tccgaaagaa ctgctgta。

42、tt atgattatca ggcgctgccg 600 aaagatgcgg aagaaaaagt gggtgcgcgt cgtgtggaaa acattgaaga actggtggcg 660 caggcggata ttgtgaccgt gaacgcgccg ctgcatgcgg gcaccaaagg cctgatcaac 720 序列表 2/7 页 9 CN 110229773 A 9 aaagagctgc tgtctaagtt taaaaaaggc gcgtggctgg tgaataccgc gcgtggcgcg 780 atttgcgtgg ccgaagatgt tgcggcggcg。

43、 ctggaaagcg gtcagctgcg tggctatggc 840 ggtgatgtgt ggtttccgca gccggcgccg aaagatcatc cgtggcgtga tatgcgtaac 900 aaatatggcg cgggtaacgc catgaccccg cattatagcg gcaccaccct ggatgcgcag 960 acccgttatg cgcagggcac caaaaacatt ctggaaagct ttttcaccgg caaatttgat 1020 tatcgtccgc aggacattat tctgctgaac ggcgaatatg tgaccaa。

44、agc gtatggcaaa 1080 cacgataaaa aataataa 1098 4 514 PRT 人工合成 4 Met Ala Asp Ser Gln Pro Leu Ser Gly Ala Pro Glu Gly Ala Glu Tyr 1 5 10 15 Leu Arg Ala Val Leu Arg Ala Pro Val Tyr Glu Ala Ala Gln Val Thr 20 25 30 Pro Leu Gln Lys Met Glu Lys Leu Ser Ser Arg Leu Asp Asn Val Ile 35 40 45 Leu Val Lys Arg Gl。

45、u Asp Arg Gln Pro Val His Ser Phe Lys Leu Arg 50 55 60 Gly Ala Tyr Ala Met Met Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Ala His 65 70 75 80 Gly Val Ile Thr Ala Ser Ala Gly Asn His Ala Gln Gly Val Ala Phe 85 90 95 Ser Ser Ala Arg Leu Gly Val Lys Ala Leu Ile Val Met Pro Thr Ala 100 105 110 Thr Ala Asp Ile Lys 。

46、Val Asp Ala Val Arg Gly Phe Gly Gly Glu Val 115 120 125 Leu Leu His Gly Ala Asn Phe Asp Glu Ala Lys Ala Lys Ala Ile Glu 130 135 140 Leu Ser Gln Gln Gln Gly Phe Thr Trp Val Pro Pro Phe Asp His Pro 145 150 155 160 Met Val Ile Ala Gly Gln Gly Thr Leu Ala Leu Glu Leu Leu Gln Gln 165 170 175 Asp Ala His 。

47、Leu Asp Arg Val Phe Val Pro Val Gly Gly Gly Gly Leu 180 185 190 Val Ala Gly Val Ala Val Leu Ile Lys Gln Leu Met Pro Gln Ile Lys 195 200 205 Val Ile Ala Val Glu Ala Glu Asp Ser Ala Cys Leu Lys Ala Ala Leu 序列表 3/7 页 10 CN 110229773 A 10 210 215 220 Asp Ala Gly His Pro Val Asp Leu Pro Arg Val Gly Leu P。

48、he Ala Glu 225 230 235 240 Gly Val Ala Val Lys Arg Ile Gly Asp Glu Thr Phe Arg Leu Cys Gln 245 250 255 Glu Tyr Leu Asp Asp Ile Ile Thr Val Asp Ser Asp Ala Ile Cys Ala 260 265 270 Ala Met Lys Asp Leu Phe Glu Asp Val Arg Ala Val Ala Glu Pro Ser 275 280 285 Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Met Lys Lys Tyr I。

49、le Ala Leu His Asn 290 295 300 Ile Arg Gly Glu Arg Leu Ala His Ile Leu Ser Gly Ala Asn Val Asn 305 310 315 320 Phe His Gly Leu Arg Tyr Val Ser Glu Arg Cys Glu Leu Gly Glu Gln 325 330 335 Arg Glu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ile Pro Glu Glu Lys Gly Ser Phe 340 345 350 Leu Lys Phe Cys Gln Leu Leu Gly Gly A。

50、rg Ser Val Thr Glu Phe Asn 355 360 365 Tyr Arg Phe Ala Asp Ala Lys Asn Ala Cys Ile Phe Val Gly Val Arg 370 375 380 Leu Ser Arg Gly Leu Glu Glu Arg Lys Glu Ile Leu Gln Met Leu Asn 385 390 395 400 Asp Gly Gly Tyr Ser Val Val Asp Leu Ser Asp Asp Glu Met Ala Lys 405 410 415 Leu His Val Arg Tyr Met Val G。