一株富铜酵母及酵母铜制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910034614.4 (22)申请日 2019.01.15 (83)生物保藏信息 CGMCC No.17018 2018.12.21 (71)申请人 中国科学院微生物研究所 地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院 3号， 中国科学院微生物研究所A725 (72)发明人 郭雪娜和晓贤程艳飞王肇悦 何秀萍 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 魏少伟 (51)Int.Cl. C12N 1/16(2006.01) C12P 3/00(。

2、2006.01) C12R 1/865(2006.01) (54)发明名称 一株富铜酵母及酵母铜制备方法 (57)摘要 本发明公开了一株富铜酵母及酵母铜制备 方法。 本发明公开的富铜酵母， 在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号 为CGMCCNo.17018。 利用本发明的富铜酵母发酵 制备的酵母铜可用于制备药品、 保健品、 以及食 品或饲料添加剂， 制备的药品、 保健药品及食品 或饲料添加剂， 可以提高生物体对铜的吸收和利 用率， 而且酵母菌还含有丰富而均衡的其它营 养。 本发明的富铜酵母作为一种安全有效的有机 强化铜源， 具有广泛的应用前景。 权利要求书1页 说明书7页 。

3、附图1页 CN 111434767 A 2020.07.21 CN 111434767 A 1.酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17018。 2.一种菌剂， 其特征在于： 所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5。 3.权利要求1所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养方法， 包括： 将权 利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5在用。

4、于培养酿酒酵母的培养基 中进行培养， 完成所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述培养基由溶剂和溶质组成， 所述溶剂 为水， 所述溶质及其在所述培养基中的浓度分别为葡萄糖或糖蜜还原糖20-100g/L、 可溶性 铜盐0.47-3.15mmol/L、 (NH4)2SO4 1-10g/L、 KH2PO4 0.5-5g/L和MgSO47H2O 0.5-5g/L。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于： 所述培养基中葡萄糖或糖蜜还原糖的浓度 为20g/L， 所述可溶性铜盐的浓度为2.36mmol/L， (。

5、NH4)2SO4的浓度为5g/L， KH2PO4的浓度为 1g/L， MgSO47H2O的浓度为1g/L。 6.根据权利要求4或5所述的方法， 其特征在于： 所述可溶性铜盐为氯化铜或硫酸铜； 和/或， 所述培养基的pH值为a1)或a2)： a1)4.5-6.5； a2)6。 7.根 据 权 利要 求 3 - 6中 任 一 所 述的 方 法 ， 其 特 征 在 于 ： 培 养 所 述 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养体系中的溶氧量为20-60； 和/或， 所述培养的温度为b1)或b2)： b1)25-35； b2)30； 和/或， 所述培养在如下。

6、c1)或c2)的转速下进行： c1)200-800rpm； c2)180-250rpm； 和/或， 所述培养的时间为30-40h。 8.酵母铜的制备方法， 包括： 按照权利要求3-7中任一所述方法培养权利要求1所述的 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 得到酵母铜。 9.利用权利要求1所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5制备的酵母铜。 10.权利要求1所述的的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5或权利要求2所述 的菌剂的下述任一应用： X1)在制备酵母铜中的应用； X2)在制备酵母铜产品中。

7、的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111434767 A 2 一株富铜酵母及酵母铜制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中， 一株富铜酵母及酵母铜制备方法。 背景技术 0002 铜是生物体必需的微量元素。 一方面作为酶的激活因子， 铜离子通过影响铁离子 的吸收和代谢参与造血功能， 增强机体造血机能； 通过激活赖氨酰氧化酶和单氨氧化酶等 促进血管和骨骼发育， 维持正常的血管弹性和骨骼强度； 通过激活酪氨酸酶促进黑色素形 成， 维持毛发的健康和光亮。 另一方面铜离子作为抗氧化因子， 具有抗应激功能， 能有效清 除氧自由基， 保护细胞免受氧胁迫损伤， 在氧胁迫损伤相关疾病的防。

8、治方面发挥重要作用。 此外铜离子还参与调节机体的细胞免疫和体液免疫， 增强免疫功能。 因此机体如果铜缺乏， 会导致相应的功能障碍， 如贫血、 黑色素合成受阻、 免疫力低下等， 从而导致生长迟缓、 发育 不良， 甚至产生严重疾病等等。 由于铜在食物中普遍存在， 正常饮食人群很少有缺铜的现 象， 但在一些特殊地域或一些特殊人群中仍存在铜缺乏现象。 在动物饲养中常常由于日粮 中铜元素的缺乏影响动物的生产性能。 目前作为铜元素补充剂的常常是无机态的铜盐， 毒 副作用大， 容易导致腹泻； 而且动物对这类无机态的铜吸收利用率低， 为达到生理效果而采 用的大剂量服用， 导致大量排出体外造成严重的环境污染。 。

9、0003 酵母菌能够通过生物吸收和生物转化将无机态的铜转化为具有更高生物相容性 和吸收利用率的生物态铜， 从而突破无机铜在实际应用中的局限性， 可以在满足生理需要 的基础上实现低剂量、 高吸收和低排放； 同时结合酵母菌本身丰富而均衡的营养， 提高与其 它营养成分的协同性和配伍性。 因此， 在食品、 保健食品、 医药产品及饲料行业具有非常广 阔的应用前景。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是如何制备酵母铜。 酵母铜是富含铜元素的酵母。 0005 为解决上述技术问题， 本发明首先提供了一株酿酒酵母， 其名称为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 该酿。

10、酒酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心的保藏编号为CGMCC No.17018。 0006 本发明还提供了一种菌剂， 所述菌剂的活性成分为所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5。 0007 所述菌剂可用于制备酵母铜。 0008 上述菌剂中， 所述菌剂还可以包括载体。 所述载体可为可食用的固体载体或液体 载体。 所述菌剂中， 所述活性成分可以以被培养的活细胞或死细胞、 活细胞或死细胞和发酵 液的混合物的形式存在。 所述组合物的剂型可为多种剂型， 如液剂、 乳剂、 悬浮剂、 粉剂、 颗 粒剂、 可湿性粉剂或水分散粒剂。 0009 根据需要， 所述菌剂。

11、中还可添加表面活性剂(如吐温20、 吐温80等)、 稳定剂(如抗 氧化剂)、 pH调节剂等。 说明书 1/7 页 3 CN 111434767 A 3 0010 本发明还提供了所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养方法， 所 述方法包括： 将所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5在用于培养酿酒酵母的培 养基中进行培养， 完成所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养。 0011 上述方法中， 所述培养基可由溶剂和溶质组成， 所述溶剂为水， 所述溶质及其在所 述培养基中的浓度分别为葡萄糖。

12、或糖蜜还原糖20-100g/L、 所述可溶性铜盐0 .47- 3.15mmol/L、 (NH4)2SO4 1-10g/L、 KH2PO4 0.5-5g/L和MgSO47H2O 0.5-5g/L。 0012 所述培养基中葡萄糖或糖蜜还原糖的浓度可为20g/L， 所述可溶性铜盐的浓度可 为2.36mmol/L， (NH4)2SO4的浓度可为5g/L， KH2PO4的浓度可为1g/L， MgSO47H2O的浓度可为 1g/L。 0013 其中糖蜜还原糖是指糖蜜中的还原糖。 0014 所述可溶性铜盐具体可为氯化铜或硫酸铜。 0015 所述培养基的pH值可为a1)或a2)： 0016 a1)4.5-6.。

13、5； 0017 a2)6。 0018 上述方法中， 培养所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养体系中 的溶氧量可为20-60。 0019 所述培养的温度可为b1)或b2)： 0020 b1)25-35； 0021 b2)30。 0022 所述培养可在如下c1)或c2)的转速下进行： 0023 c1)200-800rpm； 0024 c2)180-250rpm。 0025 所述培养的时间可为30-40h。 所述培养的时间进一步可为36h。 0026 所述培养的条件具体可为： 培养温度为30， 培养第0-4小时转速为200rpm， 培养 第4小时至培养结束转。

14、速为200-800rpm， 培养过程中培养体系的溶氧量为20-60， 培养体 系中溶氧量大于60时结束培养。 0027 本发明还提供了酵母铜的 制备方法 ， 所述方法包括 ： 按照所述酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的培养方法培养所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 得到酵母铜。 0028 本发明还提供了利用所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5制备的酵 母铜。 0029 本发明还提供了所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5或所述菌剂的 下述任一应用：。

15、 0030 X1)在制备酵母铜中的应用； X2)在制备酵母铜产品中的应用。 0031 本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5具有生物量高和酵母铜含 量高的优点， 发酵培养该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 每升培养液的细胞 干重可达15g， 每克干细胞含铜达7mg。 本发明的培养酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的方法及制备酵母铜的方法实用性强、 操作简便、 成本低廉， 对发酵设备 及生产条件没有特殊要求， 利用一般发酵厂的设备和生产条件即可生产， 投资少、 见效快、 说明书 2/7 。

16、页 4 CN 111434767 A 4 效益高， 既可以根据需要进行小批量的生产， 也适合于大规模的生产， 具有广阔的应用前 景。 0032 利用本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5发酵制备的酵母铜可 用于制备药品、 保健品、 以及食品或饲料添加剂。 以本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5为活性成分制备的药品、 保健药品及食品或饲料添加剂， 可以提高生物体 对铜的吸收和利用率， 而且酵母菌还含有丰富而均衡的其它营养； 以酵母为载体的微量元 素具有稳定性好、 抗干扰、 与其它成分协同配伍性好， 并具有良好风味等优点。

17、。 本发明的酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5作为一种安全有效的有机强化铜源， 具有广泛的 应用前景。 0033 生物材料保藏说明 0034 生物材料的分类命名： 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 0035 生物材料的菌株编号： Cu-5 0036 生物材料的保藏单位名称： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0037 生物材料的保藏单位简称： CGMCC 0038 生物材料的保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 中国科学院微生物 研究所， 邮政编码： 100101 0039 生物材料的保藏日期： 2018年1。

18、2月21日 0040 生物材料的保藏中心登记入册编号： CGMCC No.17018 附图说明 0041 图1为原子吸收光谱法测定铜离子浓度的标准曲线。 具体实施方式 0042 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为 常规方法。 下述实施例中所用的材料、 试剂、 仪器等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平均值。 0043 实施例1、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的获得 0。

19、044 本实施例中培养基中的铜离子通过添加氯化铜进行。 0045 1、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的选育 0046 1)根据酵母菌对铜离子的抗性测定结果进行初筛。 分别在含有300 g/mL、 400 g/ mL、 500 g/mL、 600 g/mL和700 g/mL铜离子浓度的YEPD固体培养基(YEPD固体培养基的组成 为： 酵母粉10g/L、 蛋白胨20g/L、 葡萄糖20g/L、 琼脂粉10g/L)上， 对申请人保存的酿酒酵母 的生长情况进行比较， 从中选出10株在含有500 g/mL铜离子浓度的YEPD固体培养基上能够 生长的菌株。 004。

20、7 2)通过液体培养， 测定步骤1)初筛得到的10株菌在含有50 g/mL铜离子浓度的 YEPD液体培养基中培养36hr的细胞生物量和细胞铜含量。 通过筛选， 获得1株细胞铜含量和 生物量均较高的菌株F0(每克干细胞的含铜量约为1mg， 每升培养液的细胞干重约为8g)。 细 胞生物量和细胞中铜含量的测定方法如下： 说明书 3/7 页 5 CN 111434767 A 5 0048 细胞生物量的测定方法： 将培养有酵母菌的培养液于8000rpm离心5min， 收集菌体 沉淀， 用去离子水洗涤三次， 将菌体沉淀放置在60烘箱中烘至恒重， 称量菌体的重量。 细 胞生物量为每升培养液中的细胞干重。 0。

21、049 铜标准曲线的制备： 分别配制铜离子浓度为0、 0.2mg/L、 0.5mg/L、 1.0mg/L和 2.0mg/L的标准溶液， 测定这几种标准溶液在324.8nm处的吸光度值， 吸光度值分别为 0.015、 0.035、 0.073和0.143。 根据铜离子浓度和吸光度值绘制标准曲线， 如图1所示。 根据 绘制的标准曲线得到铜离子浓度的计算公式： 铜离子浓度(mg/L)(OD324 .8-0.0002)/ 0.0716， 相关系数r0.9998。 0050 细胞中铜含量的测定： 在装有约0.20g左右酵母干菌体的100mL磨口圆底烧瓶中加 入5mL消化液(消化液为硝酸与高氯酸以体积比4。

22、:1混合得到的溶液)， 静置处理1-2h后， 将 烧瓶置于电炉上加热消化， 大火煮沸后改成小火保持微沸， 直至烧瓶中的液体变为无色透 明为止； 待烧瓶中的液体接近2-3mL时， 取下冷却， 用蒸馏水稀释至合适的浓度， 测定其在在 324.8nm处的吸光度值， 计算细胞中铜的含量， 即每克干细胞中铜离子的毫克数。 0051 3)利用等离子体诱变仪处理上述步骤2)获得的菌株F0对数期细胞， 在550 g/mL铜 离子浓度的YEPD固体培养基上筛选突变株。 获得能够在含有550 g/mL铜离子浓度的YEPD固 体培养基上生长的突变株。 然后测定突变株在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基。

23、 中的细胞生物量和发酵液中的铜含量， 获得5株发酵液铜含量降低至35 g/mL以下和生物量 均较高的突变株。 测定这5株突变株在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基中的细胞 铜含量， 从中筛选出3株细胞铜含量均比出发菌株F0提高的突变菌株。 0052 4)以步骤3)获得的3株突变菌株为出发菌株， 制备3株突变株的原生质体， 将其进 行原生质体融合， 获得能够在含有600 g/mL铜离子浓度的YEPD固体培养基上生长的融合 菌。 分别测定融合菌在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基中的细胞生物量和发酵 液中的铜含量， 获得7株发酵液铜含量降低至30 g/mL以下和生物量均。

24、较高的融合菌株。 测 定这7株融合菌株在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基中的细胞铜含量， 从中筛选 出6株细胞中铜含量均比步骤3)获得的突变菌株提高的融合菌株。 0053 5)再以步骤4)获得的6株融合菌株作为出发菌株， 按步骤4)的方法进行原生质体 融合， 获得能够在含有650 g/mL铜离子浓度的YEPD固体培养基上生长的融合菌， 分别测定 融合菌在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基中的细胞生物量和发酵液中的铜含 量， 获得2株发酵液铜含量降低至25 g/mL以下和生物量均较高的融合菌株， 测定这2株融合 菌株在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD液体培养基。

25、中的细胞铜含量， 其细胞铜含量均比步 骤4)获得的融合菌株提高， 将这两株融合菌株记为菌株F2-1和F2-2。 0054 6)比较步骤5)中得到的2株融合菌株在含有50 g/mL铜离子浓度的YEPD培养基中 培养的细胞生物量和细胞铜含量。 其中融合菌株F2-2每升培养液的细胞干重在8.5g以上， 每克干细胞的含铜量在3mg以上 ， 是一株优良的富铜酵母， 将其命名为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 并于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(简称CGMCC， 地址为： 北京市朝阳区大屯路， 中国科学院微生物研究 所)， 。

26、保藏编号为CGMCC No.17018。 0055 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的菌落呈椭圆形， 菌落凸起、 光滑、 乳 白色、 边缘整齐。 说明书 4/7 页 6 CN 111434767 A 6 0056 2、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的遗传稳定性分析 0057 将上述步骤1获得的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5在YEPD固体培养 基上传代培养30次， 随机挑取100个单菌落接种于无菌水中， 室温条件下饥饿培养4-6小时。 取饥饿培养后的菌液分别接种于含有650 g/mL。

27、铜离子的YEPD培养基中， 培养结果证明， 挑 取的100个单菌落在含有650 g/mL铜离子的YEPD固体培养基上均能够生长。 随机挑取其中 的10个单菌落接种在含有50 g/mL铜离子的YEPD液体培养基中培养， 测定细胞生物量和细 胞铜含量， 结果表明， 这10个单菌落的细胞生物量和细胞铜含量均无明显变化。 上述结果证 明， 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5具有良好的遗传稳定性。 0058 实施例2、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5培养条件的优化 0059 采用单因子发酵实验对实施例1得到的酿酒酵母(Sacchar。

28、omyces cerevisiae) Cu-5的培养条件进行优化(包括培养基组分、 糖浓度、 铜盐种类、 铜盐浓度、 培养基的pH值、 通气量及发酵时间等)， 确定的最优的培养条件如下： 0060 将实施例1得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的种子液以10的 接种量接种至装有40ml发酵培养基的三角瓶(容积为250ml)中， 在30、 200rpm下培养36h， 得到优化培养后的发酵液。 其中， 发酵培养基由溶质和溶剂组成， 溶剂为水， 溶质及其在发 酵培养基中的浓度分别为糖蜜还原糖40g/L(即糖蜜中还原糖在发酵培养基中的浓度)、 铜 离子(氯化铜)2。

29、.36mmol/L、 (NH4)2SO4 5g/L、 KH2PO4 1g/L， MgSO47H2O 1g/L， 发酵培养基的 pH值为6.0。 种子液由向种子培养基(酵母粉10g/L、 蛋白胨20g/L、 葡萄糖20g/L， 余量为水) 中接种实施例1得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5， 并在30， 220rpm下培 养16-18小时得到。 0061 在上述优化的培养条件下， 每升发酵液的细胞干重可以达10g以上， 每克干细胞的 含铜量达7mg以上， 具体结果如表1所示。 0062 表1优化条件与初始条件下酿酒酵母的生物量和细胞铜含量的比较 0063 生。

30、物量(g/L)细胞铜含量(mg/g)铜产量(mg/L) 初始培养8.673.2528.18 优化培养10.237.2173.76 提高百分比()17.99122162 0064 表1中， 铜产量指每升发酵液发酵产生的富铜酵母的铜富集量， 铜产量细胞铜含 量生物量。 0065 初始培养的培养条件为 ： 将实施例1得到的酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)Cu-5的种子液以10的接种量接种至装有50ml YEPD液体培养基的三角瓶(容 积为250ml)中， 在30、 220rpm下培养30h， 得到优化培养后的发酵液。 0066 实施例3、 酿酒酵母(Saccharomy。

31、ces cerevisiae)Cu-5发酵制备酵母铜 0067 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5发酵制备酵母铜成品的生产工艺 包括以下步骤： 斜面菌种液体菌种一级液体种子培养二级液体种子培养三级液体 种子培养发酵罐发酵培养收集酵母细胞及干燥粉碎得到酵母铜成品。 下面对生产 工艺中的各个步骤做进一步的说明： 0068 (1)斜面菌种： 将上述实施例1筛选得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 说明书 5/7 页 7 CN 111434767 A 7 Cu-5接种于含有50 g/mL铜离子的YEPD固体斜面培养基上， 30培养48小。

32、时后， 放入4冰 箱保存。 0069 (2)液体菌种： 将上述步骤(1)保存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5 活化后， 接一满环细胞于装有20毫升YEPD培养基的三角瓶中， 30振荡培养18小时， 得到液 体菌种。 0070 (3)一级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(2)的液体菌种接入装有0.2 升YEPD培养基的三角瓶中， 30振荡培养18小时， 得到一级液体种子培养物。 0071 (4)二级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(3)的一级种子培养物接入装 有2升YEPD培养基的小发酵罐中， 在25-35的条件下， 搅拌培养18小时， 得到。

33、二级液体种子 培养物。 0072 (5)三级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(4)的二级种子培养物接入装 有20升YEPD培养基的发酵罐中， 30搅拌培养18小时， 得到三级液体种子培养物。 0073 (6)发酵罐发酵培养： 按10的接种量将上述步骤(5)的三级种子培养物接入装有 100升实施例2中的发酵培养基的发酵罐中， 30， 搅拌转速： 发酵开始至发酵4hr内转速为 200rpm， 发酵4hr至发酵结束转速为200-800rpm(控制溶氧大于20)， 当溶氧升高至大于 60结束发酵。 0074 (7)收集酵母细胞及干燥： 采用板框压榨法或离心收集上述步骤(6)获得的酿酒酵 母(S。

34、accharomyces cerevisiae)Cu-5细胞， 将收获的菌体细胞在4585的条件下风干， 使酵母细胞的含水量小于5。 结果表明， 在上述培养条件下， 每升发酵培养基获得的细胞 干重为10g， 每克干细胞的含铜量为7mg。 0075 (8)粉碎及包装： 用粉碎机将上述步骤(7)干燥后的酿酒酵母细胞粉碎。 然后用不 透气的包装袋包装， 得到酵母铜成品。 0076 实施例4、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5通过流加工艺发酵制备酵 母铜 0077 以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5发酵制备酵母铜成品的生产工艺 包。

35、括以下步骤： 斜面菌种液体菌种一级液体种子培养二级液体种子培养三级液体 种子培养发酵罐流加工艺发酵培养收集酵母细胞及干燥粉碎得到酵母铜成品。 下 面对生产工艺中的各个步骤做进一步的说明： 0078 (1)斜面菌种： 将上述实施例1筛选得到的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Cu-5接种于含有50 g/mL铜离子的YEPD固体斜面培养基上， 30培养48小时后， 放入4冰 箱保存。 0079 (2)液体菌种： 将上述步骤(1)保存的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5 活化后， 接一满环细胞于装有20毫升YEPD培养基的三角瓶中， 30。

36、振荡培养18小时， 得到液 体菌种。 0080 (3)一级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(2)的液体菌种接入装有0.2 升YEPD培养基的三角瓶中， 30振荡培养18小时， 得到一级液体种子培养物。 0081 (4)二级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(3)的一级种子培养物接入装 有2升YEPD培养基的小发酵罐中， 在25-35的条件下， 搅拌培养18小时， 得到二级液体种子 培养物。 说明书 6/7 页 8 CN 111434767 A 8 0082 (5)三级液体种子培养： 按10的接种量将上述步骤(4)的二级种子培养物接入装 有20升YEPD培养基的发酵罐中， 30搅拌。

37、培养18小时， 得到三级液体种子培养物。 0083 (6)发酵罐发酵培养： 按10的接种量将上述步骤(5)的三级种子培养物接入装有 75升底糖发酵培养基的发酵罐中进行发酵， 发酵第4hr开始流加25L发酵培养基甲， 流加速 度为5L/hr， 发酵第4hr开始， 一次性加入铜离子浓度为0.236mol/L的氯化铜水溶液250ml。 发酵条件为： 30， 搅拌转速： 发酵开始至发酵4hr内转速为200rpm， 发酵4hr至发酵结束转 速为200-800rpm(控制溶氧大于20)， 当溶氧升高至大于60结束发酵。 0084 其中， 底糖发酵培养基由溶质和溶剂组成， 溶剂为水， 溶质及其在底糖发酵培养。

38、基 中的浓度分别为糖蜜还原糖20g/L(即糖蜜中还原糖在发酵培养基中的浓度)、 铜离子(氯化 铜)2.36mmol/L、 (NH4)2SO4 5g/L、 KH2PO4 1g/L， MgSO47H2O 1g/L， 底糖发酵培养基的pH值 为6.0。 0085 发酵培养基甲由溶质和溶剂组成， 溶剂为水， 溶质及其在发酵培养基甲中的浓度 分别为糖蜜还原糖180g/L(即糖蜜中还原糖在发酵培养基中的浓度)、 (NH4)2SO4 5g/L、 KH2PO4 1g/L， MgSO47H2O 1g/L， pH为6.0。 0086 (7)收集酵母细胞及干燥： 采用板框压榨法或离心收集上述步骤(6)获得的酿酒酵 母(Saccharomyces cerevisiae)Cu-5细胞， 将收获的菌体细胞在4585的条件下风干， 使酵母细胞的含水量小于5。 结果表明， 在上述培养条件下， 每升发酵培养基获得的细胞 干重为15g， 每克干细胞的含铜量为7mg。 0087 (8)粉碎及包装： 用粉碎机将上述步骤(7)干燥后的酿酒酵母细胞粉碎。 然后用不 透气的包装袋包装， 得到酵母铜成品。 说明书 7/7 页 9 CN 111434767 A 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 111434767 A 10 。