与心梗诊疗相关的靶点DUSP6及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910039276.3 (22)申请日 2019.01.16 (71)申请人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号北 京大学分子医学研究所 (72)发明人 熊敬维周小海朱小君 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. A61K 45/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 9/00(2006.01) (54)发明名称 与心梗诊疗相关的靶点DUSP6及其应用 (57。

2、)摘要 本发明公开了与心梗诊疗相关的靶点DUSP6 及其应用。 本发明公开了抑制DUSP6蛋白活性的 物质或抑制或沉默Dusp6基因表达的物质在如下 1)-11)中任一种中的应用： 1)制备治疗心梗的产 品； 2)制备改善心梗后心脏功能的产品； 3)制备 抑制心梗后心室负性重构的产品； 4)制备抑制心 梗后梗死面积扩大的产品； 5)制备减少心梗后非 梗死区心肌细胞死亡数量的产品； 6)制备上调中 性粒细胞ERK磷酸化水平的产品； 7)制备下调中 性粒细胞p38磷酸化水平的产品； 8)制备降低中 性粒细胞超氧释放水平的产品； 9)制备降低中性 粒细胞脱颗粒水平的产品； 10)制备降低中性粒 细胞。

3、组织杀伤活性的产品； 11)制备降低心衰风 险的产品。 权利要求书3页 说明书13页 附图7页 CN 111437390 A 2020.07.24 CN 111437390 A 1.抑制DUSP6蛋白活性的物质在如下1)-12)中任一种中的应用： 1)制备治疗或辅助治疗心梗的产品； 2)制备改善心梗后心脏功能的产品； 3)制备抑制心梗后心室负性重构的产品； 4)制备抑制心梗后梗死面积扩大的产品； 5)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的产品； 6)制备上调中性粒细胞ERK磷酸化水平的产品； 7)制备下调中性粒细胞p38磷酸化水平的产品； 8)制备降低中性粒细胞超氧释放水平的产品； 9)制备。

4、降低中性粒细胞脱颗粒水平的产品； 10)制备降低中性粒细胞组织杀伤活性的产品； 11)制备减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤的产 品； 12)制备降低心衰风险的产品。 2.抑制或沉默Dusp6基因表达的物质在如下1)-12)中任一种中的应用： 1)制备治疗或辅助治疗心梗的产品； 2)制备改善心梗后心脏功能的产品； 3)制备抑制心梗后心室负性重构的产品； 4)制备抑制心梗后梗死面积扩大的产品； 5)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的产品； 6)制备上调中性粒细胞ERK磷酸化水平的产品； 7)制备下调中性粒细胞p38磷酸化水平的产品； 8)制备降低中性粒细胞超氧释。

5、放水平的产品； 9)制备降低中性粒细胞脱颗粒水平的产品； 10)制备降低中性粒细胞组织杀伤活性的产品； 11)制备减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤的产 品； 12)制备降低心衰风险的产品。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于： 所述改善心梗后心脏功能体现在如下 a1)-a6)中任一种： a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度； a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度； a3)减轻心梗后心室纤维化程度； a4)减轻心梗后室壁变薄程度； a5)减轻心梗后室腔扩张程度； a6)提高心梗后生存率。 4.根据权利要求2所述的应用， 其特征在于： 所述减少心梗后。

6、非梗死区心肌细胞死亡数 量体现在如下b1)-b4)中任一种： b1)下调促凋亡蛋白Bax水平； 权利要求书 1/3 页 2 CN 111437390 A 2 b2)上调凋亡抑制蛋白Bcl-2水平； b3)下调Bax/Bcl-2比值； b4)下调TUNEL阳性心肌细胞数量。 5.根据权利要求1-4中任一所述的应用， 其特征在于： 所述抑制DUSP6蛋白活性的物质为抑制DUSP6蛋白合成或促进DUSP6蛋白降解或抑制 DUSP6蛋白功能的蛋白质、 多肽或小分子化合物； 或， 所述抑制或沉默Dusp6基因表达的物质为干扰Dusp6基因表达的RNA或敲除、 敲低或 突变Dusp6基因的物质。 6.一种。

7、产品， 其活性成分为抑制DUSP6蛋白活性的物质或抑制或沉默Dusp6基因表达的 物质； 所述产品的功能为如下c1)-c12)中任一种： c1)治疗或辅助治疗心梗； c2)改善心梗后心脏功能； c3)抑制心梗后心室负性重构； c4)抑制心梗后梗死面积扩大； c5)减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量； c6)上调中性粒细胞ERK磷酸化水平； c7)下调中性粒细胞p38磷酸化水平； c8)降低中性粒细胞超氧释放水平； c9)降低中性粒细胞脱颗粒水平； c10)降低中性粒细胞组织杀伤活性； c11)减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤； c12)降低心衰风险。 7.根据权利。

8、要求6所述的产品， 其特征在于： 所述改善心梗后心脏功能的体现在如下 a1)-a6)中任一种： a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度； a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度； a3)减轻心梗后左心室纤维化程度； a4)减轻心梗后室壁变薄程度； a5)减轻心梗后室腔扩张程度； a6)提高心梗后生存率； 或， 所述减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量体现在如下b1)-b4)中任一种： b1)下调促凋亡蛋白Bax水平； b2)上调凋亡抑制蛋白Bcl-2水平； b3)下调Bax/Bcl-2比值； b4)下调TUNEL阳性心肌细胞数量。 8.根据权利要求6或7所述的产品， 其特征在于： 所述抑制DU。

9、SP6蛋白活性的物质为抑制 DUSP6蛋白合成或促进DUSP6蛋白降解或抑制DUSP6蛋白功能的蛋白质、 多肽或小分子化合 物； 权利要求书 2/3 页 3 CN 111437390 A 3 或， 所述抑制或沉默Dusp6基因表达的物质为干扰Dusp6基因表达的RNA或敲除、 敲低或 突变Dusp6基因的物质。 9.DUSP6蛋白作为靶点在开发或设计治疗心梗的产品中的应用。 10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-8所述的产品或权利要求9所述的 应用， 其特征在于： 所述产品为药物。 权利要求书 3/3 页 4 CN 111437390 A 4 与心梗诊疗相关的靶点DUSP6及其应。

10、用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及与心梗诊疗相关的靶点DUSP6及其应用。 背景技术 0002 心肌梗死是高发病率、 高死亡率的疾病， 为个人、 家庭及社会造成了重大经济和健 康负担。 目前临床治疗策略包括如下方法： (1)发病阶段： 静脉注射吗啡或者是哌替啶， 减轻 心绞痛症状及濒死感； 联合服用硝酸酯类药物 受体阻滞剂， 增加冠状动脉血流量并减少心 肌耗氧量， 改善心肌缺血症状； 服用双联抗血小板药物(阿司匹林联合替格瑞洛)， 防止血栓 继续形成。 (2)再灌注治疗： 利用冠状动脉造影、 支架植入术、 冠脉搭桥术及其他溶栓手段， 尽快开通血管堵塞部位， 使心肌恢复供。

11、血， 防止梗死面积扩大。 同时及时处理严重心律失常 及其他并发症， 防止猝死。 (3)心室重构及心衰的防治： 继续服用溶栓药物， 防止血栓再度形 成； 同时长期给予 受体阻滞剂、 他汀类药物、 醛固酮拮抗剂、 内皮素(ET)拮抗剂等， 抑制心 肌负荷并改善心脏功能。 但目前临床上尚无有效逆转心衰的治疗手段。 发明内容 0003 本发明第一方面保护抑制DUSP6蛋白活性的物质的新用途。 0004 本发明提供了抑制DUSP6蛋白活性的物质在如下1)-12)中任一种中的应用： 0005 1)制备治疗或辅助治疗心梗的产品； 0006 2)制备改善心梗后心脏功能的产品； 0007 3)制备抑制心梗后心室。

12、负性重构的产品； 0008 4)制备抑制心梗后梗死面积扩大的产品； 0009 5)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的产品； 0010 6)制备上调中性粒细胞ERK磷酸化水平的产品； 0011 7)制备下调中性粒细胞p38磷酸化水平的产品； 0012 8)制备降低中性粒细胞超氧释放水平的产品； 0013 9)制备降低中性粒细胞脱颗粒水平的产品； 0014 10)制备降低中性粒细胞组织杀伤活性的产品； 0015 11)制备减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤 的产品； 0016 12)制备降低心衰风险的产品。 0017 本发明还保护抑制或沉默Dusp6基因表达的物质。

13、的新用途。 0018 本发明保护抑制或沉默Dusp6基因表达的物质在如下1)-12)中任一种中的应用： 0019 1)制备治疗或辅助治疗心梗的产品； 0020 2)制备改善心梗后心脏功能的产品； 0021 3)制备抑制心梗后心室负性重构的产品； 0022 4)制备抑制心梗后梗死面积扩大的产品； 说明书 1/13 页 5 CN 111437390 A 5 0023 5)制备减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量的产品； 0024 6)制备上调中性粒细胞ERK磷酸化水平的产品； 0025 7)制备下调中性粒细胞p38磷酸化水平的产品； 0026 8)制备降低中性粒细胞超氧释放水平的产品； 0027 9。

14、)制备降低中性粒细胞脱颗粒水平的产品； 0028 10)制备降低中性粒细胞组织杀伤活性的产品； 0029 11)制备减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤 的产品； 0030 12)制备降低心衰风险的产品。 0031 进一步的， 所述改善心梗后心脏功能体现在如下a1)-a6)中任一种： 0032 a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度； 所述心脏功能性指标具体可为EF或 FS； 0033 a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度； 所述心室扩张指标具体可为LVEDV或 LVESV； 0034 a3)减轻心梗后心室纤维化程度； 所述心室纤维化程度具体可为左心室纤维化程 度。

15、； 0035 a4)减轻心梗后室壁变薄程度； 0036 a5)减轻心梗后室腔扩张程度； 0037 a6)提高心梗后生存率。 0038 所述减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量体现在如下b1)-b4)中任一种： 0039 b1)下调促凋亡蛋白Bax水平； 0040 b2)上调凋亡抑制蛋白Bcl-2水平； 0041 b3)下调Bax/Bcl-2比值； 0042 b4)下调TUNEL阳性心肌细胞数量。 0043 所述降低中性粒细胞脱颗粒水平体现在降低Lactoferrin水平和/或MMP9水平。 0044 更进一步的， 所述抑制DUSP6蛋白活性的物质可为抑制DUSP6蛋白合成或促进 DUSP6蛋白降。

16、解或抑制DUSP6蛋白功能的物质， 例如， 抑制DUSP6蛋白合成或促进DUSP6蛋白 降解或抑制DUSP6蛋白功能的蛋白质、 多肽或小分子化合物等DUSP6蛋白抑制剂。 所述小分 子化合物具体可为DUSP6小分子抑制剂： BCI hydrochloride(Sigmaaldrich， B4313)。 0045 所述抑制或沉默Dusp6基因表达的物质可为干扰Dusp6基因表达的RNA， 也可为敲 除、 敲低或突变Dusp6基因的物质。 0046 所述干扰Dusp6基因表达的RNA可为干扰Dusp6基因表达的单链RNA， 如miRNA， 也可 为干扰Dusp6基因表达的双链RNA， 如siRNA。

17、、 dsRNA、 shRNA。 0047 所述敲除、 敲低或突变Dusp6基因的物质可为用于敲除、 敲低或突变Dusp6基因的 物质， 例如， 利用CRISPR/cas9系统或ZFN技术或TALEN技术或T-DNA插入或EMS诱变等方法对 Dusp6基因进行敲除、 敲低或突变(包括插入突变或缺失突变或碱基替换等突变形式)， 以抑 制或沉默Dusp6基因表达的物质。 0048 在本发明的一个具体实施例中， 利用CRISPR/cas9系统对Dusp6基因进行突变， 所 述CRISPR/cas9系统的靶序列可为如下序列： AGGACCGGGACCGCTTTACCAGG。 说明书 2/13 页 6 C。

18、N 111437390 A 6 0049 所述中性粒细胞可为哺乳动物中性粒细胞， 例如哺乳动物外周血中性粒细胞。 所 述哺乳动物包括人。 0050 本发明第二方面保护一种产品： 0051 所述产品的功能为如下c1)-c12)中任一种： 0052 c1)治疗或辅助治疗心梗； 0053 c2)改善心梗后心脏功能； 0054 c3)抑制心梗后心室负性重构； 0055 c4)抑制心梗后梗死面积扩大； 0056 c5)减少心梗后非梗死区心肌细胞死亡数量； 0057 c6)上调中性粒细胞ERK磷酸化水平； 0058 c7)下调中性粒细胞p38磷酸化水平； 0059 c8)降低中性粒细胞超氧释放水平； 00。

19、60 c9)降低中性粒细胞脱颗粒水平； 0061 c10)降低中性粒细胞组织杀伤活性； 0062 c11)减少心肌梗死炎症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤； 0063 c12)降低心衰风险。 0064 本发明保护的产品的活性成分为上述抑制DUSP6蛋白活性的物质或上述抑制或沉 默Dusp6基因表达的物质。 0065 上述产品中， 所述改善心梗后心脏功能的体现在如下a1)-a6)中任一种： 0066 a1)减轻心梗后心脏功能性指标的下降程度； 所述心脏功能性指标具体为EF或FS； 0067 a2)减轻心梗后心室扩张指标的升高程度； 所述心室扩张指标具体为LVEDV或 LVESV； 。

20、0068 a3)减轻心梗后心室纤维化程度； 所述心室纤维化程度具体可为左心室纤维化程 度； 0069 a4)减轻心梗后室壁变薄程度； 0070 a5)减轻心梗后室腔扩张程度； 0071 a6)提高心梗后生存率； 0072 所述减少心梗后非梗死区心肌细胞的死亡数量体现在如下b1)-b4)中任一种： 0073 b1)下调促凋亡蛋白Bax水平； 0074 b2)上调凋亡抑制蛋白Bcl-2水平； 0075 b3)下调Bax/Bcl-2比值； 0076 b4)下调TUNEL阳性心肌细胞数量。 0077 DUSP6蛋白作为靶点在开发或设计治疗心梗的产品中的应用也属于本发明的保护 范围。 0078 上述应用。

21、或产品中， 所述产品可为药物。 0079 本发明的有益效果如下： 1)通过去除/降低DUSP6表达或抑制DUSP6的活性， 降低中 性粒细胞超氧释放与脱颗粒水平； 2)通过去除/降低DUSP6表达或抑制DUSP6的活性， 降低中 性粒细胞组织杀伤活性； 3)通过去除/降低DUSP6表达或抑制DUSP6的活性， 减少心肌梗死炎 症反应过程中中性粒细胞对心肌细胞和心肌组织的损伤； 4)通过去除/降低DUSP6表达或抑 说明书 3/13 页 7 CN 111437390 A 7 制DUSP6的活性， 抑制心梗后心室重构、 心脏纤维化， 改善心脏功能， 降低心衰风险； 5)抑制 其他组织的炎症性损伤导。

22、致的纤维化过程。 附图说明 0080 图1为Dusp6突变体大鼠DUSP6蛋白含量与活性检测。 (A)大鼠Dusp6基因突变位点 示意图。 (B-E)Western-blot检测D9品系肺、 心脏DUSP6蛋白及ERK磷酸化水平及定量分析结 果。 n3/组， *P0.05， *P0.01。 其中， WT为SD大鼠； Dusp6 mutant为Dusp6突变体大鼠。 0081 图2为DUSP6缺失显著改善大鼠急性心梗后心脏结构及功能。 (A-B)野生型与Dusp6 突变体大鼠冠状动脉结扎4w后超声心动图及相应心脏功能指标(EF、 FS)与心室扩张指标 (LVEDV、 LVESV)测定结果。 野生。

23、型n11， 突变体n13。 (C-D)野生型与Dusp6突变体大鼠冠 状动脉结扎4w后Masson染色及纤维化面积统计结果。 n8/组。 标尺为500 m。 (E)野生型与 Dusp6突变体大鼠冠状动脉结扎4w内生存曲线。 野生型n15， 突变体n11。 *P0.05， *P 0.01。 0082 图3为DUSP6缺失抑制心梗后梗死面积扩大。 (A)野生型与Dusp6突变体大鼠冠状动 脉结扎后1d TTC染色及梗死面积测定结果。 (B)野生型与Dusp6突变体大鼠冠状动脉结扎后 3d TTC染色及梗死面积测定结果。 LV： 左心室， 蓝色示正常区， 红色示缺血区(AAR)， 白色示 梗死区(I。

24、R)。 标尺为500 m， n6/组， *P0.05。 0083 图4为DUSP6缺失减少大鼠心梗非急性期心肌细胞死亡。 (A-B)野生型与Dusp6突变 体冠状动脉结扎后6h、 24h、 72h及非手术情况下左心室TUNEL染色及统计结果， 心肌以cTnT 免疫荧光染色示出。 n3/组， 标尺为100 m， *P0.01。 (C)Western-blot检测冠状动脉结扎 后72h野生型与Dusp6突变体大鼠左心室Bax、 Bcl-2蛋白水平及统计结果。 n3/组， *P 0.01。 0084 图5为DUSP6高表达于心梗组织中性粒细胞。 (A-B)抗体标记与流式细胞检测心梗 后72h野生型大。

25、鼠心肌组织不同细胞中DUSP6蛋白水平及统计结果。 n6。 (C)心梗前后心肌 组织DUSP6免疫组织化学检测。 n6/组， 标尺为100 m。 (D-F)心梗后72h野生型大鼠DUSP6与 HIS48、 MPO及PR3免疫荧光双标记。 DAPI标记细胞核。 n3/组， 标尺为10 m。 0085 图6为DUSP6蛋白高表达于外周血多形核粒细胞。 (A)Giemsa染色检测外周血多形 核细胞与单个核细胞分离后纯度， 可见多形核粒细胞多具有杆状与分叶状等不规则核型， 单个核细胞核型几乎全部为单一球状， 示两组细胞实现高纯度分离。 (B)qRT-PCR检测非手 术组与心梗不同时期野生型大鼠外周血多。

26、形核粒细胞与单个核细胞Dusp6mRNA水平， (C) Western-blot检测非手术组与心梗不同时期野生型大鼠外周血多形核粒细胞与单个核细 胞DUSP6蛋白水平。 每组样品n3， 标尺为100 m。 0086 图7为DUSP6缺失使外周血中性粒细胞ERK磷酸化水平上调， 抑制p38磷酸化。 (A) Western blot检测Dusp6突变体大鼠和野生型大鼠外周血粒细胞中磷酸化ERK、 磷酸化p38、 磷酸化JNK水平。 n3/组。 (B-D)Western blot检测统计结果。 分别以ERK、 p38、 JNK表达量作 为参照。 *P0.05。 0087 图8为DUSP6缺失抑制中性。

27、粒细胞呼吸爆发。 (A)DHR123标记与流式细胞术检测PMA 体外激活的粒细胞呼吸爆发水平。 (B)糖原体内激活的粒细胞呼吸爆发水平检测。 (C)免疫 组织化学检测心梗后72h左心室组织氧化损伤标志物8-OHdG水平。 标尺为100m， *P 说明书 4/13 页 8 CN 111437390 A 8 0.05， *P0.01， 每组样品数n3。 0088 图9为Dusp6缺失抑制中性粒细胞脱颗粒。 (A-B)PMA体外激活的粒细胞脱颗粒水平 检测。 (C-D)糖原体内激活的腹腔粒细胞脱颗粒水平检测。 (E-F)浸润到心脏梗死区的粒细 胞脱颗粒水平检测。 统计结果显示， Dusp6突变体粒细。

28、胞的脱颗粒能力与野生型相比显著降 低， *P0.05， *P0.01， 每组样品数n3。 0089 图10为Dusp6突变体粒细胞对心肌细胞杀伤力减弱。 (A)乳鼠心肌细胞与腹腔粒细 胞共培养实验示意图。 (B)cTnT细胞免疫荧光检测野生型乳鼠心肌与野生型及DUSP6缺失腹 腔粒细胞共培养前及培养12h后心肌细胞残留数量。 (B)野生型乳鼠心肌与野生型及DUSP6 缺失腹腔粒细胞共培养前及培养12h后cell viability半定量检测。 n9/组， *P0.01。 具体实施方式 0090 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 在不背离本发明精神 和实质的情况下， 对本发。

29、明方法、 步骤或条件的修改或者替换， 均属于本发明的范围。 下述 实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无 特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重 复实验， 结果取平均值。 0091 下述实施例中所用的实验动物及细胞系： SD大鼠购自北京维通利华实验动物有限 公司； 大鼠的饲养、 繁殖和使用遵循北京大学实验动物管理委员会的规章制度， 相关设施已 通过国际实验动物AAALAC认证。 0092 下述实施例中所用的实验仪器和耗材： 移液器： Rainin； 荧光定量PCR系统： Bio- Rad； PCR。

30、仪： Eppendorf； 荧光显微镜： Leica 5000B； SDS-PAGE与转膜系统： Bio-Rad； 细胞培 养箱： Thermo； 体视镜： Leica 160F； 激光共聚焦显微镜： Carl Zeiss LSM 510； 离心机： Eppendorf； 全自动脱水机： SAKURA Tissue-全自动包埋机： SAKURA Tissue- 切片机、 展片机、 烤片机： Leica； 冷光源： Leica； 小动物呼吸机： Kent MouseVent； 小动物超 声： Vevo 2100小动物影像系统； 塑料滴管、 培养皿、 载玻片、 盖玻片、 切片盒、 移液器枪头、 离。

31、 心管等均为国产。 0093 下述实施例中所用的主要溶液配方： 0094 1.5mol/L Tris(pH8.8)： 称取181.7g Tris， 加入约800mL去离子水， 充分搅拌溶 解， 用浓盐酸调节pH至8.8， 定容至1L， 高压灭菌后室温保存。 0095 1mol/L Tris(pH6.8)： 称取121.1g Tris， 加入约800mL去离子水， 充分搅拌溶解， 用浓盐酸调pH至6.8， 定容至1L， 高压灭菌后室温保存。 0096 30丙烯酰胺： 称取丙烯酰胺29g和双丙烯酰胺1g， 溶于100mL去离子水， 过滤后于 棕色瓶中4保存。 0097 10SDS： 称取10g S。

32、DS， 溶于100mL去离子水， 调pH至7.2， 过滤后室温保存。 0098 10过硫酸铵： 称取1g过硫酸铵， 溶于10mL去离子水， 分装储存于-20。 0099 5Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)： 称取15.1g Tris、 94g甘氨酸， 加入10SDS 50mL， 加入约900mL去离子水溶解。 定容至1L， 室温保存。 0100 转膜缓冲液： 称取2.9g甘氨酸， 5.8g Tris， 0.37g SDS， 200mL甲醇， 加去离子水至 1000mL， 现用现配。 说明书 5/13 页 9 CN 111437390 A 9 0101 10T。

33、BS： 称取24.2g Tris、 80g NaCl， 用盐酸调pH至7.6， 加去离子水至1000mL， 过 滤除菌后室温保存。 0102 TBST： 1TBS加0.1Tween-20， 充分搅拌混匀。 0103 Western-blot封闭液/抗体稀释液： 1TBS加5脱脂奶粉。 0104 PBS： 称取8g NaCl、 0.2g KCl、 1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4， 溶于800mL去离子 水， 调pH至7.4， 过滤除菌。 0105 5马来酸缓冲液： 称取58g马来酸与44g NaCl稀释到1L， 用固体NaOH调pH至7.5， 过滤除菌。 0106 Tric。

34、aine麻醉剂(斑马鱼)： 称取0.02g Tricaine， 溶于0.01mol/L Tris-HCl (pH7.0)， 过滤后于棕色瓶中4保存。 0107 10水合氯醛麻醉剂(大鼠)： 称取10g水合氯醛， 溶于100mL生理盐水， 过滤除菌后 室温保存。 0108 4多聚甲醛固定液： 4g多聚甲醛加热溶于100mL PBS(pH7.4)， 过滤后冷冻保存。 0109 1伊文氏蓝： 称取伊文氏蓝1g， 加入100mL PBS中， 溶解后加1mL 1Na2CO3， 过滤 后室温保存。 0110 1TTC： 称取TTC 1g， 溶于100mL PBS， 现用现配。 0111 肝素抗凝剂： 称取。

35、2.5mg肝素钠， 溶于1mL生理盐水， 过滤除菌后室温保存。 0112 免疫组化封闭液/抗体稀释液： 1TBS加10FBS和1DMSO， 现用现配。 0113 下述实施例中所用的主要抗体： 0114 DUSP6抗体(大鼠western-blot)： Anti-DUSP6 antibody EPR129Y(abcam， ab76310)。 0115 DUSP6抗体(大鼠免疫组化)： Anti-DUSP6 Antibody(OriGene， TA323084)。 0116 磷酸化ERK抗体： Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)D13.14.4E 。

36、Rabbit mAb(Cell Signaling， 4370)。 0117 ERK抗体： p44/42 MAPK(Erk1/2)Antibody(Cell Signaling,9102)。 0118磷酸化p38抗体： Phospho-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)(D3F9)Rabbit mAb (Cell Signaling， 4511)。 0119 p38抗体： p38 MAPK Antibody。 0120 大鼠平滑肌肌动蛋白抗体： Mouse anti-Actin(smooth muscle)Monoclonal Antibody 1A4(中杉金桥， ZM-0003)。

37、。 0121 大鼠CD31抗体： Anti-CD31(Ms)from Rat SZ31(dianova， DIA-310)。 0122 大鼠MPO抗体： MPO Antibody 8F4(Novus， NBP1-51148)。 0123 大鼠PR3抗体： PR3 antibody D-1(SantaCruz， sc-74534)。 0124 大鼠中性粒细胞表面标记物抗体： Mouse anti Rat Granulocytes and Erythroid Cells Monoclonal Antibody HIS48(Abd Serotec， MCA967)。 0125 下述实施例中所涉及的D。

38、USP6蛋白的氨基酸序列的Acession号为NP_446335.1， Dusp6基因序列的Gene ID为NM_053883.2。 0126 实施例1、 Dusp6突变体大鼠的构建与验证 0127 一、 Dusp6突变体大鼠的构建 说明书 6/13 页 10 CN 111437390 A 10 0128 按照文献 “Xinli Hu,Nannan Chang,Xuelian Wang,et al.Heritable gene- targeting with gRNA/Cas9 in rats.Cell Research(2013)23:1322-1325.” 中的方法， 利 用CRISPR系。

39、统构建了一系列Dusp6突变大鼠品系。 0129 具体构建方法如下： 1、 根据Dusp6基因I号外显子上相应序列设计guide RNA， gRNA 序列为AGGACCGGGACCGCTTTACCAGG； 2、 将上述gRNA与Cas9 mRNA分别进行体外转录合成； 3、 取合成产物显微注射至大鼠胚胎(Cas9 mRNA浓度为40ng/uL， gRNA浓度为20ng/uL)； 4、 将注 射后的胚胎移植至代孕母鼠； 5、 取出生后乳鼠基因组， 对相应突变位点进行克隆测序。 测序 引物序列如下： TAGCTTCGGCTTGGGAAAGGC和TCGTCGTAGAGCACCACGGTGT。 013。

40、0 根据测序结果选取编号为D9的Dusp6突变大鼠品系作为供试材料进行下述研究实 验。 和野生型大鼠的基因组DNA相比， Dusp6突变大鼠D9的两条同源染色体上的Dusp6基因 (NM_053883.2)CDS第258位和第259位碱基间均插入了一个腺嘌呤核苷酸 “A” ， 其余序列均 未改变。 由于在Dusp6基因CDS第258位和第259位碱基间插入一个腺嘌呤核苷酸 “A” ， 形成一 终止密码子， 翻译产物大部分缺失， 见图1A。 0131 二、 Dusp6突变体大鼠DUSP6蛋白含量与活性检测 0132 分别检测成年野生型大鼠和Dusp6突变体大鼠心、 肝、 脾、 肺器官组织中的DU。

41、SP6蛋 白含量。 同时， 对DUSP6蛋白的主要作用靶点ERK磷酸化进行分析。 使用RIPA裂解液(普利 莱， C1053)提取各器官组织与细胞总蛋白， 具体方法如下： 1)100mg大鼠器官组织经液氮研 磨后， 转移至1mL RIPA裂解液， 并加入Protease inhibitor cocktail(Roche， 11873580001)与PMSF(Sigma， 93482)抑制蛋白降解， 使用PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail(Roche， 04906845001)保护蛋白磷酸化位点。 2)冰上孵育10min， 期间 不停震荡混匀。 3)离。

42、心(10000rpm， 1min， 4)， 收集上清液， 即为蛋白样品。 所得蛋白样品用 BCA法(普利莱， P1511)定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳与转膜。 0133 western-blot检测具体步骤如下： 1)按要求装配好凝胶板。 2)按下表配方配制 12.5浓缩胶与分离胶： 分离胶： 去离子水3.3mL， 30丙烯酰胺4mL， 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8)2.5mL， 10SDS 100 L， 10过硫酸铵100 L， TEMED 4 L。 浓缩胶： 去离子水1.4mL， 30丙烯酰胺0.33mL， 1.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)0.25mL，。

43、 10SDS 20 L， 10过硫酸铵20 L， TEMED 2 L。 3)首先将配制好的分离胶灌注至凝胶板中， 其上用一层水覆盖， 待聚合完全 后， 用吸水纸吸去水分， 在其上直接灌注浓缩胶并插好梳子， 待其完全聚合。 4)将凝胶板装 入电泳装置， 装置内外槽加入适量电泳缓冲液。 5)拔去梳子， 加入煮沸后样品20 L， 将电泳 装置与电泳仪相接， 将电压调为100V， 开始电泳。 6)待溴酚蓝指示剂泳动至分离胶底部时， 停止电泳， 将凝胶取出， 去除浓缩胶后， 于转膜缓冲液中浸泡15min。 7)与此同时， 剪裁适宜 大小的PVDF膜与滤纸。 将滤纸浸泡于转膜缓冲液中； 将PVDF膜在甲醇。

44、中浸泡3-5s后， 于水中 清洗2min， 最终浸泡于转膜缓冲液中。 8)待凝胶、 膜与滤纸处理完成后， 安装转移系统， 从负 极至正极依次为： 海绵、 滤纸、 凝胶、 膜、 滤纸、 海绵。 9)将整个系统放入转移槽， 在槽的另一 边放一块冰， 并将整个装置置于冰水中， 300mA恒流转膜2h。 10)转膜结束后， 取出膜， 置于封 闭液中， 室温封闭30min。 11)弃去封闭液， 加入适量一抗稀释液， 4摇床孵育过夜。 12)室温 摇床上， 用TBST洗3次， 每次5min； 13)加入HRP标记的二抗(1:10000稀释于PBST中)， 室温摇 床上孵育1h； 14)室温摇床上， 用TB。

45、ST洗3次， 每次5min。 15)使用SuperECL Plus超敏发光液 (普利莱， P1020)， 在Bio-rad的化学发光成像系统进行曝光成像。 说明书 7/13 页 11 CN 111437390 A 11 0134 结果显示， DUSP6蛋白在成年野生型大鼠肝、 脾、 肺等器官中均有显著表达， 但在心 脏中含量极低。 而成年Dusp6突变体大鼠心、 肝、 脾、 肺等器官均检测不到完整的DUSP6蛋白 (见图1B-E)。 同时， 对DUSP6的主要作用靶点ERK磷酸化进行分析。 结果显示除心脏外， DUSP6蛋白缺失可导致成年Dusp6突变体大鼠肝、 脾、 肺等器官ERK磷酸化水平。

46、显著增加。 以 上结果表明Dusp6突变体大鼠DUSP6蛋白正常结构与功能完全消失， 可用于以下实验分析。 0135 实施例2、 Dusp6突变体大鼠心梗后心脏功能改善 0136 一、 心梗模型的制备 0137 采用冠状动脉前降支结扎法制作野生型大鼠与Dusp6突变体大鼠心梗模型。 具体 步骤如下： 0138 1、 大鼠(体重200-250g)用10水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)， 仰卧固定四 肢及头部于手术台上。 0139 2、 行气管插管， 连接呼吸机， 按体重调节参数。 观察大鼠胸廓起伏与呼吸机频率完 全一致后， 用酒精进行术野消毒， 在左胸心脏搏动最明显处剪开皮肤。 钝性。

47、分离胸大肌和前 锯肌， 在第四肋间刺破肋间肌开胸。 用开胸夹撑开肋骨， 除去心包， 找到冠状动脉前降支位 置(自左心耳与肺动脉圆锥交界处发出， 向心尖方向走行)。 0140 3、 用6-0带线缝合针结扎， 观察到结扎部位下方心肌大面积变为苍白色即为成功。 0141 4、 清理胸腔积血， 逐层关胸缝合。 至大鼠恢复自主呼吸后拔去呼吸机插管， 用酒精 再次消毒， 腹腔注射氨苄青霉素以防止术后感染(注射量为50mg/200g)， 置于电热毯上维持 体温， 至其苏醒后放回笼中饲养。 0142 二、 心脏结构和功能检测 0143 冠状动脉结扎4w后(心梗模型构建完成后4周)超声心动图检测心脏功能， 并将。

48、心 脏样品制成石蜡切片， 用Masson三色染色法进行形态学分析， 统计纤维化面积。 同时绘制冠 状动脉结扎4w内生存曲线。 0144 组织取材、 固定及石蜡切片的制备方法如下： 将大鼠心脏取出后， 立即置于4多 聚甲醛中摇动固定过夜。 按程序进行梯度酒精脱水、 二甲苯透明与石蜡浸泡， 用包埋机与适 宜模具进行包埋。 切片前将蜡块放在-10预冷10min以上， 然后将蜡块固定在切片机上进 行连续切片， 切片厚度2.5 m。 用45水浴展片， 捞片后室温下晾干， 60烤片1h以上。 0145 大鼠心脏脱水程序为： 50乙醇1h， 60乙醇1h， 70乙醇1h， 80乙醇1h， 90乙 醇1h， 。

49、95乙醇1h(两次)， 无水乙醇1h(两次)， 无水乙醇:二甲苯(1:1)30min， 二甲苯10min (两次)， 石蜡1.5h(两次， 65)。 0146 切片脱蜡程序为： 二甲苯10min(两次)， 无水乙醇3min(两次)， 95乙醇3min， 85 乙醇3min， 70乙醇3min， 50乙醇3min， 30乙醇3min， PBS洗5min(三次)。 下同。 0147 石蜡切片Masson染色方法如下： 1、 烤片、 脱蜡步骤如上述步骤。 2、 水洗后将水控 干， 不可过干， 至无水珠即可。 3、 Weigert s苏木素染5-10min， 轻轻用蒸馏水冲洗。 4、 1盐 酸酒精分化。

50、后放入水中数分钟返蓝。 5、 丽春红染5-10min， 轻轻用蒸馏水冲洗。 6、 1磷钼酸 分化10min， 至胶原纤维部位颜色明显变淡， 立即用甲苯胺蓝染色5min。 7、 1冰醋酸分化 1min。 8、 脱水： 将切片分别浸入85、 95、 100、 100的乙醇溶液中， 每次2min。 9、 将脱水 后的切片浸入二甲苯中3次， 每次5min， 封片。 0148 超声心动图及相关测量结果显示， 与术前相比， 野生型大鼠心脏EF(心脏射血分 说明书 8/13 页 12 CN 111437390 A 12 数)、 FS(左室短轴缩短率)等功能性指标明显降低， LVEDV(左室舒张末容积)、 L。