结合CD40的抗体及其用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010302900.7 (22)申请日 2019.03.04 (62)分案原申请数据 201910160181.7 2019.03.04 (71)申请人 北京天广实生物技术股份有限公司 地址 101100 北京市大兴区北京经济技术 开发区科创十四街20号院16号楼5单 元一层 申请人 北京华放天实生物制药有限责任公 司 (72)发明人 胡稳奇李江美李锋 (74)专利代理机构 上海德禾翰通律师事务所 31319 代理人 陈艳娟 (51)Int.Cl. C07K 16/28(2。

2、006.01) C12N 15/13(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 38/19(2006.01) A61K 38/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (54)发明名称 结合CD40的抗体及其用途 (57)摘要 本发明提供一种与人CD40特异结合的分离 的单克隆抗体。 还提供编码该抗体的核酸分子， 以及用于表达该抗体的表达载体、 宿主细胞和方 法。 本发明还提供包含该抗体的免疫交联物、 双 特异性分子、 嵌合抗原受体、 溶瘤病毒和药物组 合物， 以及使用本发明抗体的治疗方法。 权利要求书1。

3、页 说明书31页 序列表43页 附图11页 CN 111454361 A 2020.07.28 CN 111454361 A 1.一种分离的单克隆抗体， 或其抗原结合部分， 包含重链可变区和轻链可变区， 该重链 可变区包含CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 该轻链可变区包含CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 其中重 链CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 以及轻链CDR1区、 CDR2区和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NOs： 7、 14、 20、 26、 30和36所示， 其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。 2.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部。

4、分， 其中所述重链可变区 包含SEQ ID NO： 44所示的氨基酸序列。 3.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中所述轻链可变区 包含SEQ ID NO： 58所示的氨基酸序列。 4.根据权利要求2所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其中所述重链可变区 和所述轻链可变区分别包含SEQ ID NOs： 44和58所示的氨基酸序列。 5.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其为IgG1、 IgG2、 或 IgG4亚型。 6.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 包含重链恒定区和轻 链恒定区， 其中所述重链恒定区和轻链恒定区分别包。

5、含如(1)SEQ ID NOs： 62和66； (2)SEQ ID NOs： 63和65； 或(3)SEQ ID NOs： 64和65所示的氨基酸序列。 7.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其(a)与人CD40结合； (b)与猴CD40结合； (c)不与小鼠CD40结合； (d)促进CD40-CD40L的结合； (e)激活CD40信号通 路； (f)促进树突细胞成熟； 和(g)促进CD8+和/或CD4+T细胞增殖。 8.根据权利要求1所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分， 其为鼠源、 嵌合或人源 化抗体。 9.一种双特异性分子、 免疫交联物、 嵌合抗原受体、 基因改造。

6、T细胞受体、 或溶瘤病毒， 包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。 10.一种组合物， 包含权利要求1-8中任一项所述的分离的单克隆抗体或其抗原结合部 分， 以及药学上可接受的载体。 11.根据权利要求10所述的组合物， 还包含第二抗体、 和/或细胞因子。 12.根据权利要求11所述的组合物， 其中所述第二抗体选自VISTA抗体、 PD-1抗体、 PD- L1抗体、 LAG-3抗体、 TIM-3抗体、 STAT3抗体和ROR1抗体。 13.根据权利要求11所述的组合物， 其中所述细胞因子为GM-CSF和/或IL-4。 14.一种核酸， 编码权利要求1-8中任一项所述。

7、的分离的单克隆抗体或其抗原结合部 分。 15.一种表达载体， 包含权利要求14所述的核酸。 16.一种宿主细胞， 包含权利要求15所述的表达载体。 17.权利要求1-8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合部分、 或权利要求10-13中 任一项所述的组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。 18.根据权利要求17所述的用途， 其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、 慢性淋巴细胞白血 病、 多发性骨髓瘤、 黑色素瘤、 肠腺癌、 胰腺癌、 肠癌、 胃肠癌、 前列腺癌、 膀胱癌、 肾癌、 卵巢 癌、 子宫颈癌、 乳癌、 肺癌和鼻咽癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111454361 A 2 结合CD40的抗。

8、体及其用途 0001 本申请是2019年3月4日提交的题为 “结合CD40的抗体及其用途” 的中国专利申请 CN201910160181.7的分案。 技术领域 0002 本发明涉及一种与人CD40特异结合的抗体、 及其制备和用途， 尤其是其在治疗与 CD40相关的人类疾病中的用途， 例如癌症、 炎性疾病、 感染性疾病、 动脉粥样硬化血栓、 和呼 吸系统疾病。 背景技术 0003 CD40， 又称为肿瘤坏死因子受体超家族成员5或TNFR5， 是一种跨膜共刺激蛋白， 在 抗原提呈细胞例如B细胞、 巨噬细胞和树突细胞上表达。 该蛋白与CD40L(CD154)， 一种主要 由激活的T淋巴细胞和血小板表。

9、达的主要配体， 的结合， 激活抗原提呈细胞， 激发多个下游 信号通路， 包括免疫细胞激活和增殖、 以及细胞因子和趋化因子的生产， 增强细胞功能和免 疫功能(Ara A et al， .(2018)Immunotargets Ther 7： 55-61)。 0004 另一方面， CD40也存在于非免疫细胞和肿瘤上(Costello et al.， (1999)Immunol Today 20(11)： 488-493； Tong et al.， (2003)Cancer Gene Ther 10(1)： 1-13； Lee et al.， (2014)Curr Cancer Drug Targe。

10、ts 14(7)： 610-620； Ara A et al， .(2018)同上)， 并 报道其与多种免疫疾病(包括自免疫疾病)、 动脉粥样硬化血栓、 癌症和呼吸系统疾病有关 联。 例如， CD40/CD40L表达在动脉粥样化相关细胞中上调。 CD40在几乎所有的B细胞恶性肿 瘤以及高达70的实体瘤中表达， 且某些B细胞恶性肿瘤中的CD40配体结合会促成多种保 护肿瘤细胞免受细胞凋亡的因子的表达增加(Lee et al.， (1999)Proc Natl Acad Sci USA 96： 9136-9141)。 0005 尽管CD40在肿瘤发生中的作用非常复杂， 已经开发出一些CD40抗体用。

11、于潜在的肿 瘤治疗。 CP-870， 893， 开发的完全人源的IgG2激动型CD40抗体， 可以激活树突细胞， 并已在 多种背景的晚期癌症病患中显示出了临床效用(Vonderheide et al.， (2007)J Clin Oncol 25(7)： 876-883； Gladue et al.， (2011)Cancer Immunol Immunother 60(7)： 1009- 1017； Beatty et al.， (2013)Expert Rev Anticancer Ther 17(2)： 175-186； Vonderheide et al.， (2013)Oncoimm。

12、unology 2(1)： e23033； Nowak et al.， Ann Oncol 26(12)： 2483- 2490； 2015 U.S.patent no.7,338,660)。 Dacetuzumab， 也称作SGN-40， 是Seattle Genetics开发的人源化IgG1激动型CD40抗体， 每周静脉施用下显示出抗肿瘤活性， 特别是 在患有弥漫性大B细胞性淋巴瘤的患者中。 临床前数据也示出Dacetuzumab与其他药物例如 CD20单抗利妥昔单抗的协同效应(Lapalombella et al.， (2009)Br J Haematol 144(6)： 848-855。

13、； Hussein et al.， (2010)Haematologica 95(5)： 845-848； de Vos et al.， (2014) J He-matol Oncol 7： 44)。 Chi Lob 7/4， 英国癌症研究中心(Cancer Research UK)开发的 嵌合IgG1激动型抗人CD40抗体， 正在进行初始的临床测试。 21名患者中的11名病情稳定， 而 没有部分或完全缓解(Chowdhury et al.， (2014)CancerImmunolRes 2(3)： 229-240)。 此 说明书 1/31 页 3 CN 111454361 A 3 外， 拮抗。

14、型CD40抗体也在人多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞白血病中显示出抗肿瘤作用 (Bensinger W et al.， (2012)BrJ Haematol.159(1)： 58-66； Mohammad Luqman et al.， (2008)Blood 112： 711-720)。 0006 需要更多具有更好药理特性的CD40抗体。 发明内容 0007 本发明提供一种分离的单克隆抗体， 例如， 与CD40(例如， 人CD40和猴CD40)结合的 鼠源、 人源、 嵌合或人源化的单克隆抗体。 其可以是激活CD40信号通路的激动型CD40抗体。 0008 本发明的抗体可以用于多种应用， 包括检测CD。

15、40蛋白， 治疗或预防CD40相关疾病， 例如癌症、 炎性疾病、 感染性疾病、 动脉粥样硬化血栓、 和呼吸系统疾病。 0009 因此， 在一个方面， 本发明涉及一种分离的单克隆抗体(例如， 人源化抗体)、 或其 抗原结合部分， 含有重链可变区， 该重链可变区含有CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 其中， CDR1 区、 CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs： 1、 8和15； (2)SEQ ID NOs： 1、 9和15； (3)SEQ ID NOs： 2、 9和15； (4)SEQ ID NOs： 3、 10和16； (5)SEQ ID NOs： 4、 11和17； 。

16、(6)SEQ ID NOs： 5、 12和18； (7)SEQ ID NOs： 6、 13和19； 或(8)SEQ ID NOs： 7、 14和20的氨基酸序列； 或分别包含 与这些序列具有至少80、 85、 90、 95、 98或99同一性的氨基酸序列， 其中该抗体 或其抗原结合部分与CD40结合。 0010 在一个方面， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区， 其 包含SEQ ID NOs： 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49或50的氨基酸序列， 或包含 与这些序列具有至少80、 85、 90、 95、 9。

17、8或99同一性的氨基酸序列， 其中该抗体 或其抗原结合部分与CD40结合。 0011 在一个方面， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分含有轻链可变区， 该 轻链可变区含有CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 其中， CDR1区、 CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs： 21、 27和31； 或(2)SEQ ID NOs： 22、 28和32； (3)SEQ ID NOs： 23、 29和33； (4)SEQ ID NOs： 24、 27和34； (5)SEQ ID NOs： 25、 27和35； 或(6)SEQ ID NOs： 26、 30和36的氨基酸序列； 或分。

18、别包含与这些序列具有至少80、 85、 90、 95、 98或99同一性的氨基酸序列， 其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。 0012 在一个方面， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含轻链可变区， 其 包含SEQ ID NOs： 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60或61， 或包含与这些序列具有至少 80、 85、 90、 95、 98或99同一性的序列， 其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结 合。 0013 在一个方面， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻 链可变区， 各包含CDR1区、 CDR2区和CDR3区。

19、， 其中重链可变区CDR1区、 CDR2区和CDR3区， 轻链 可变区CDR1区、 CDR2区和CDR3区分别包含(1)SEQ ID NOs： 1、 8、 15、 21、 27和31； (2)SEQ ID NOs： 1、 9、 15、 21、 27和31； (3)SEQ ID NOs： 2、 9、 15、 21、 27和31； (4)SEQ ID NOs： 3、 10、 16、 22、 28和32； (5)SEQ ID NOs： 4、 11、 17、 23、 29和33； (6)SEQ ID NOs： 5、 12、 18、 24、 27和34； (7)SEQ ID NOs： 6、 13、 19。

20、、 25、 27和35； 或(8)SEQ ID NOs： 7、 14、 20、 26、 30和36的氨基酸序列； 或分别 包含与这些序列具有至少80、 85、 90、 95、 98或99同一性的氨基酸序列， 其中该 抗体或其抗原结合部分与CD40结合。 说明书 2/31 页 4 CN 111454361 A 4 0014 在一个实施方式中， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变 区和轻链可变区， 该重链可变区和轻链可变区分别包含(1)SEQ ID NOs： 37和51； (2)SEQ ID NOs： 38和52； (3)SEQ ID NOs： 39和53； (4)SEQ ID 。

21、NOs： 40和54； (5)SEQ ID NOs： 41和55； (6) SEQ ID NOs： 44和58； (7)SEQ ID NOs： 45和59； (8)SEQ ID NOs： 46和60； (9)SEQ ID NOs： 46 和61； (10)SEQ ID NOs： 47和60； (11)SEQ ID NOs： 47和61； (12)SEQ ID NOs： 48和59； (13) SEQ ID NOs： 49和60； (14)SEQ ID NOs： 49和61； (15)SEQ ID NOs： 50和60； 或(16)SEQ ID NOs： 50和61的氨基酸序列； 或分别包含与这。

22、些序列具有至少80、 85、 90、 95、 98或 99同一性的氨基酸序列， 其中该抗体或其抗原结合部分与CD40结合。 0015 在一个实施方式中， 本发明的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链和轻 链， 该重链包含重链可变区和重链恒定区， 轻链包含轻链可变区和轻链恒定区， 其中， 重链 可变区和轻链可变区含有上述的氨基酸序列， 重链恒定区包含SEQ ID NOs： 62、 63或64的氨 基酸序列， 轻链恒定区包含SEQ ID NOs： 65或66的氨基酸序列， 或包含与这些序列具有至少 80、 85、 90、 95、 98或99同一性的氨基酸序列， 其中该抗体或其抗原结合部分与 C。

23、D40结合。 0016 本发明的抗体在一些实施方式中包含两条重链和两条轻链， 或由两条重链和两条 轻链构成， 其中各重链包含上述的重链恒定区序列、 重链可变区序列或CDR序列， 且各轻链 包含上述的轻链恒定区序列、 轻链可变区序列或CDR序列。 本发明的抗体可以是全长抗体， 例如IgG1、 IgG2或IgG4亚型。 在一些实施方式中， 本发明的抗体可以是单链抗体， 或由抗体 片段构成， 例如Fab或Fab 2片段。 0017 本发明的抗体或其抗原结合部分与人或猴CD40特异结合， 阻断或促进CD40-CD40L 相互作用。 本发明的抗体是激动型CD40抗体， 激活CD40信号通路， 促进免疫细。

24、胞例如树突细 胞的成熟。 本发明的抗体或其抗原结合部分具有与现有技术CD40抗体相当或更好的体内抗 肿瘤效果， 且毒性相当或更低。 肿瘤在抗体停止施用后不再生长， 甚至完全消失。 0018 本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分的免疫交联物， 该抗体或其抗原 结合部分与治疗剂例如细胞毒素相连接。 本发明还提供含有本发明抗体或其抗原结合部分 的双特异性分子， 该抗体或其抗原结合部分连接有第二功能基团， 例如， 第二抗体， 该第二 功能基团具有不同于本发明抗体或其结合部分的结合特异性。 在另一方面， 本发明的抗体 或其抗原结合部分可以是嵌合抗原受体(CAR)的一部分。 本发明的抗体或其抗原结合。

25、部分 可以由溶瘤病毒编码或由溶瘤病毒携带使用。 0019 本发明还提供组合物， 其包含本发明的抗体或其抗原结合部分、 或免疫交联物或 双特异性分子或CAR， 以及药学上可接受的载体。 0020 本发明还包括编码本发明抗体或其抗原结合部分的核酸分子， 以及包含该核酸的 表达载体以及包含该表达载体的宿主细胞。 本发明还提供使用含有上述表达载体的宿主细 胞来制备CD40抗体的方法， 包括以下步骤： (i)在宿主细胞中表达抗体， 以及(ii)从宿主细 胞或其培养物中分离抗体。 0021 另一方面， 本发明提供一种增强受试者免疫应答的方法， 包括向受试者施用治疗 有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。 在。

26、一些实施方式中， 方法包括施用本发明的组合 物、 双特异性分子、 免疫交联物、 CAR-T细胞、 或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。 0022 在另一方面， 本发明提供一种治疗受试者中炎性疾病、 感染性疾病、 动脉粥样硬化 说明书 3/31 页 5 CN 111454361 A 5 血栓或呼吸系统疾病的方法， 包括向受试者施用治疗有效量的本发明抗体或抗原结合部 分。 在一些实施方式中， 方法包括施用本发明的组合物、 双特异性分子、 免疫交联物、 CAR-T 细胞、 或编码抗体或携带抗体的溶瘤病毒。 在一些实施方式中， 可以与本发明抗体或其抗原 结合部分一起施用其他药物， 例如抗炎剂和抗微生物剂。。

27、 在一些实施方式中， 炎性疾病包括 自免疫疾病。 0023 在另一个方面， 本发明提供在受试者中预防、 治疗或减缓癌症疾病的方法， 包括向 受试者施用治疗有效量的本发明抗体或其抗原结合部分。 癌症可以是实体瘤或非实体瘤， 包括但不限于， B细胞淋巴瘤、 慢性淋巴细胞白血病、 多发性骨髓瘤、 黑色素瘤、 肠腺癌、 胰腺 癌、 肠癌、 胃肠癌、 前列腺癌、 膀胱癌、 肾癌、 卵巢癌、 子宫颈癌、 乳癌、 肺癌和鼻咽癌。 在一些 实施方式中， 该方法包括施用本发明的组合物、 双特异性分子、 免疫交联物、 CAR-T细胞、 或 编码或承载抗体的溶瘤病毒。 在一些实施方式中， 至少一种其他抗癌抗体可以与。

28、本发明抗 体或其抗原结合部分一起施用， 例如VISTA抗体、 PD-1抗体、 PD-L1抗体、 LAG-3抗体和/或 CTLA-4抗体。 在另一个实施方式中， 本发明的抗体或其抗原结合部分与细胞因子(例如IL-2 和/或IL-21)或共刺激抗体(例如CD137抗体和/或GITR抗体)一起施用。 在另一个实施方式 中， 本发明的抗体或其抗原结合部分可以与化疗剂一起施用， 该化疗剂可以是细胞毒性剂， 例如表阿霉素、 奥沙利铂、 和/或5-氟尿嘧啶(5-FU)。 本发明的抗体可以是例如鼠源、 人源、 嵌合或人源化抗体。 0024 基于以下具体描述和实施例， 当前公开内容的其他特征和优势之处将会更加明。

29、 晰， 具体描述和实施例不应解读为限制性的。 在本申请中引用的所有文献、 Genbank记录、 专 利和已公开专利申请的内容通过引用的方式明确地包含在本文中。 0025 附图描述 0026 图1示出108个杂交瘤克隆的CD40信号通路激动活性排名。 0027 图2示出CD40抗体对CD40-CD40L相互作用的促进或抑制性作用， 其中抗体16A6、 7B4和13A2促进CD40-CD40L相互作用(A)而抗体92F6抑制CD40-CD40L相互作用(B)。 0028 图3示出CD40抗体的CD40信号通路激动活性。 0029 图4示出经CD86(A)、 CD80(B)和CD83(C)的染色而测。

30、量的CD40抗体对树突细胞成熟 的促进作用。 0030 图5示出CD40嵌合抗体对HEK293A/人CD40细胞(A)或HEK293A/猴CD40细胞(B)的结 合力。 0031 图6示出CD40嵌合抗体的CD40信号通路激动活性。 0032 图7示出经CD86染色而测量的CD40抗体对树突细胞成熟的促进作用。 0033 图8示出嵌合和人源化CD40抗体对人或猴CD40的结合力， 其中嵌合和人源化13A2 抗体(A)以及人源化7B4抗体(B)与人CD40结合， 且嵌合和人源化13A2抗体(C)以及人源化 7B4抗体(D)与猴CD40结合。 0034 图9示出嵌合和人源化7B4抗体(A)以及嵌合。

31、和人源化13A2抗体(B)的CD40信号通 路激动活性。 0035 图10示出经CD86(A)、 CD80(B)和CD83(C)的染色而测量的CD40抗体对供体1体内树 突细胞成熟的促进作用。 0036 图11示出经CD86(A)和CD80(B)染色而测量的CD40抗体对供体2体内树突细胞成熟 说明书 4/31 页 6 CN 111454361 A 6 的促进作用。 0037 图12示出经CD86(A)、 CD80(B)和IL-12(C)的染色而测量的供体3体内CD40抗体对 树突细胞成熟的促进作用。 0038 图13示出由SPR测量的嵌合或人源化CD40抗体7B4(A)、 7B4-VH0VL。

32、0(B)、 7B4- VH2VL2(C)、 7B4-VH2VL3(D)、 7B4-VH3VL2(E)、 7B4-VH3VL3(F)、 13A2(G)、 13A2-VH0VL0(H)、 13A2-VH2VL2(I)、 13A2-VH2VL3(J)、 13A2-VH3VL2(K)和13A2-VH3VL3(L)、 以及参照抗体 RO7009789(M)和ADC1013(N)对人CD40的结合亲和力。 0039 图14示出嵌合或人源化CD40抗体对全长CD40 ECD或其截短体(A)以及对全长 CD40ECD或其突变体(B)的结合亲和力。 0040 图15示出人源化CD40抗体7B4-VH2VL2(A。

33、)和13A2-VH3VL3(B)对人CD40的结合特异 性。 0041 图16示出经CD86(A)、 CD80(B)和CD83(C)的染色而测量的基因改造CD40抗体对树 突细胞成熟的作用。 0042 图17示出施用人源化CD40抗体或对照药物的各组的平均肿瘤体积(A)， 以及溶剂 组(B)、 7B4VH2VL2组(C)、 13A2VH3VL3组(D)、 RO7009789组(E)和APX005(F)组的个体肿瘤体 积。 0043 图18示出施用人源化CD40抗体或对照药物的各组的平均动物体重。 0044 图19示出人源化CD40抗体对肿瘤浸润CD4+T细胞(A)和CD8+T细胞(B)增殖的效。

34、果。 0045 图20示出经CD80、 CD83和CD86的染色而测量人源化CD40抗体对肿瘤浸润树突细胞 (CD45+CD11c+细胞)成熟的促进作用。 具体实施方式 0046 为更好理解本发明， 首先定义一些术语。 其他定义则贯穿具体实施方式部分而列 出。 0047 术语” CD40” 是指肿瘤坏死因子超家族成员五。 该术语包括变体、 异体、 同源物、 直 向同源物和平行同源物。 例如， 对人CD40特异的抗体可以在某些情况下与另一物种例如猴 的CD40蛋白交叉反应。 在其他实施方式中， 对人CD40蛋白特异的抗体可以完全地对人CD40 蛋白特异而不与其他物种或其他类型的蛋白交叉反应， 或。

35、者可以与一些其他物种而非所有 其他物种的CD40蛋白交叉反应。 0048 术语 “人CD40” 是指具有人氨基酸序列的CD40蛋白， 人氨基酸序列为例如Genbank 登录号为NP_001241.1的氨基酸序列(SEQ ID NO.： 68)。 术语 “猴CD40” 和 “鼠CD40” 分别指具 有猴和小鼠序列的CD40蛋白， 例如分别具有Genbank登录号为NP_001252791.1(SEQ ID NO.： 70)和Genbank登录号为NP_035741.2(SEQ ID NO.： 72)的序列。 0049 本文中的术语 “抗体” 意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即， 抗原结合部。

36、 分)或单链。 全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白， 重链和轻链由二硫 键连接。 各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。 重链恒定区由三个结构域构成， 即CH1、 CH2和CH3。 各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。 轻链恒定区由一个结构 域CL构成。 VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区， 其由较为保守的框架区 (FR)区分隔开。 各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成， 从氨基端到羧基端以FR1、 CDR1、 FR2、 说明书 5/31 页 7 CN 111454361 A 7 CDR2、 FR3、 CDR3、 FR4的顺。

37、序排布。 重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。 抗体 的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 包括多种免疫系统细胞(例如， 效 应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。 0050 本文中的术语， 抗体的 “抗原结合部分” (或简称为抗体部分)， 是指抗体的保持有 特异结合抗原(例如， CD40蛋白)能力的一个或多个片段。 已证实， 抗体的抗原结合功能可以 通过全长抗体的片段来实施。 包含在抗体的 “抗原结合部分” 中的结合片段的例子包括(i) Fab片段， 由VL、 VH、 CL和CH1构成的单价片段； (ii)F(ab )2片段， 包含铰链区二硫桥连接的两 个Fab。

38、片段的二价片段； (iii)由VH和CH1构成的Fd片段； (iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片 段； (v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.， (1989)Nature 341： 544-546)； (vi)分离的互补 决定区(CDR)； 以及(vii)纳米抗体， 一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变 区。 此外， 尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码， 它们可以通过重组法经由使 两者成为单蛋白链的合成接头而连接， 其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc (scFv)； 参见例如Bird et al.， (1988)Science 242： 。

39、423-426； and Huston et al.， (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85： 5879-5883)。 这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。 这些 抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到， 且片段可以通过与完整抗体相 同的方式进行功能筛选。 0051 本文所用的术语 “分离的抗体” 是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的 抗体。 例如， 与CD40蛋白特异结合的分离抗体基本不含特异结合CD40蛋白之外抗原的抗体。 但是， 特异结合人CD40蛋白的分离抗体可能对其他抗原例如其他物种的CD40蛋白具有交叉 结合性。 此外， 分离的抗体基本。

40、不含其他细胞材料和/或化学物质。 0052 术语 “单克隆抗体” 或 “单抗” 或 “单克隆抗体组成” 是指单一分子组成的抗体分子 制品。 单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。 0053 术语 “小鼠源抗体” 是指可变区框架和CDR区得自小鼠种系免疫球蛋白序列的抗 体。 此外， 如果抗体包含恒定区， 其也得自小鼠种系免疫球蛋白序列。 本发明的鼠源抗体可 以包含不由小鼠种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基， 例如通过体外随机突变或点突变 或通过体内体细胞突变而导入的突变。 然而， 术语 “鼠源抗体” 不包括在小鼠框架序列中插 入得自其他哺乳动物物种的CDR序列的抗体。 005。

41、4 术语 “嵌合抗体” 是指通过组合非人源遗传物质与人源遗传物质而得来的抗体。 或 者更笼统地说， 嵌合抗体是指组合有一个物种的遗传物质与另一物种遗传物质的抗体。 0055 术语 “人源化抗体” 是指来源于非人物种但其蛋白序列已经被修改以增加其与人 天然生成抗体的相似度的抗体。 0056 术语 “识别抗原的抗体” 以及 “对抗原特异的抗体” 在本文中与术语 “特异结合抗原 的抗体” 交替使用。 0057 在本文中，“特异结合人CD40” 的抗体是指与人CD40(还可能是其他非人物种的 CD40)结合但是基本不与非CD40蛋白结合的抗体。 优选地， 抗体以 “高亲和力” 结合人CD40蛋 白， 。

42、即KD值为5.0 x10-8M以下， 优选1.0 x10-8M以下， 更优选为5.0 x10-9M以下。 0058 术语 “基本不结合” 蛋白或细胞是指， 不与蛋白或细胞结合， 或者不以高亲和力与 其结合， 即结合蛋白或细胞的KD为1.0 x10-6M以上， 更优选1.0 x10-5M以上， 更优选1.0 x10-4M 以上、 1.0 x10-3M以上， 更优选1.0 x10-2M以上。 说明书 6/31 页 8 CN 111454361 A 8 0059 术语 “高亲和性” 对于IgG抗体而言， 是指对于抗原的KD为1.0 x10-6M以下， 优选 5.0 x10-8M以下， 更优选1.0 。

43、x10-8M以下、 5.0 x10-9M以下， 更优选1.0 x10-9M以下。 对于其他抗体 亚型，“高亲和性” 结合可能会变化。 例如， IgM亚型的 “高亲和性” 结合是指KD为10-6M以下， 优 选10-7M以下， 更优选10-8M以下。 0060 术语 “Kassoc” 或 “Ka” 是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率， 而术语 “Kdis” 或 “Kd” 是指特定抗体-抗原相互作用的离解速率。 术语 “KD” 是指解离常数， 由Kd与Ka比(Kd/Ka)得到， 并以摩尔浓度(M)表示。 抗体的KD值可以通过领域内已知的方法确定。 优选的确定抗体KD的 方式是使用表面等离子共振仪。

44、(SPR)测得的， 优选使用生物传感系统例如BiacoreTM系统测 得。 0061 术语 “EC50” ， 又叫半最大效应浓度， 是指引起50最大效应的抗体浓度。 0062 术语 “受试者” 包括任何人或非人动物。 术语 “非人动物” 包括所有脊椎动物， 例如 哺乳类和非哺乳类， 例如非人灵长类、 羊、 狗、 猫、 牛、 马、 鸡、 两栖类、 和爬行类， 尽管优选哺 乳动物， 例如非人灵长类、 羊、 狗、 猫、 牛和马。 0063 本文中所用的术语 “激动型CD40抗体” 是指能够与CD40结合并激活或引发CD40信 号通路从而促进免疫细胞激活和增殖以及细胞因子和趋化因子的生成的CD40抗体。

45、。 而术语 “拮抗型CD40抗体” 是指阻断或抑制可以由CD40L结合引发的CD40信号通路。 0064 术语 “治疗有效量” 是指足以防止或减缓与疾病或病症(例如癌症)相关的症状和/ 或减轻疾病严重程度的本发明抗体量。 治疗有效量与被治疗的疾病相关， 其中本领域技术 人员可以方便地判别出实际的有效量。 0065 本发明的多个方面在以下更加具体地加以描述。 0066 CD40抗体具有对人CD40的结合特异性以及其他有益的功能特征 0067 本发明的抗体以高亲和力特异性地结合人CD40， 例如， KD值为1x10-8M以下。 抗体还 具有与猴CD40的交叉反应性， 不与小鼠CD40结合。 006。

46、8 本发明的抗体是激活或引发CD40信号通路并参与免疫细胞激活和增殖以及细胞 因子和趋化因子的生成的激动型CD40抗体。 0069 本发明的抗体， 与现有技术CD40抗体相比， 具有与现有CD40抗体相比相当或更好 的体内抗肿瘤效应， 毒性相当或更低。 在停止施用抗体后， 肿瘤停止生长， 甚至完全消除。 0070 优选的本发明抗体是单克隆抗体。 此外， 抗体可以是例如鼠源的、 嵌合的或人源化 的单克隆抗体。 0071 CD40单克隆抗体 0072 优选的本发明抗体是结构和化学特性在以下描述的单克隆抗体。 CD40抗体的VH氨 基酸序列为SEQ ID NOs： 37、 38、 39、 40、 4。

47、1、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49或50。 CD40抗体的VL 氨基酸序列为SEQ ID NOs： 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 或61。 抗体的重链/轻链可变 区序列列于以下表1中， 一些抗体具有相同的VH或VL。 优选的抗体重链恒定区氨基酸序列为 SEQ ID NOs： 62、 63或64， 轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NOs： 65或66。 说明书 7/31 页 9 CN 111454361 A 9 0073 0074 与人CD40结合的其他CD40抗体的VH和/或VL序列(或CDR序列)可以与本。

48、发明抗体的 VH和/或VL序列(或CDR序列) “混合并配对” 。 优选地， 当VH和VL(或其中的CDR)混合并配对时， 特定VH/VL配对中的VH序列可以由结构近似的VH序列取代。 相似地， 优选特定VH/VL配对中的 VL序列由结构近似的VL序列取代。 0075 因此， 在一个实施方式中， 本发明的抗体或其抗原结合部分包括： 说明书 8/31 页 10 CN 111454361 A 10 0076 (a)包含列于表1中氨基酸序列的重链可变区； 以及 0077 (b)包含列于表1中氨基酸序列的轻链可变区， 或者另一CD40抗体的VL， 其中该抗 体特异结合人CD40。 0078 在另一实施。

49、方式中， 本发明的抗体或其抗原结合部分包括： 0079 (a)列于表1中的重链可变区的CDR1、 CDR2和CDR3； 以及 0080 (b)列于表1中的轻链可变区的CDR1、 CDR2和CDR3， 或者另一CD40抗体的CDR， 其中 该抗体特异结合人CD40。 0081 在另一实施方式中， 本发明的抗体或其抗原结合部分包括CD40抗体的重链可变区 CDR2以及其他结合人CD40的抗体的CDR， 例如重链可变区CDR1和/或CDR3， 和/或另一CD40抗 体的轻链可变区CDR1、 CDR2和/或CDR3。 0082 此外， 领域内公知的是， CDR3结构域， 独立于CDR1和/或CDR2，。

50、 可单独确定抗体对同 种抗原的结合特异性， 且可以预测到基于该CDR3序列可生成具有相同结合特异性的多种抗 体。 参见， 例如Klimka et al.， British J.of Cancer 83(2)： 252-260(2000)； Beiboer et al.， J.Mol.Biol.296： 833-849(2000)； Rader et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.95： 8910-8915(1998)； Barbas et al.， J.Am.Chem.Soc.116： 2161-2162(1994)； Barbas et al.， Proc.Nat。