用于蛋白沉淀的装置及从蛋白混合液中分离纯化目的蛋白的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910064297.0 (22)申请日 2019.01.23 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266101 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 樊喜英刘文帅年锐孙粤 包子娴咸漠 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 邓宇 (51)Int.Cl. C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (54)发明名称 一种用于蛋白。

2、沉淀的装置及从蛋白混合液 中分离纯化目的蛋白的方法 (57)摘要 一种用于蛋白沉淀的装置及从蛋白混合液 中分离纯化目的蛋白的方法， 属于蛋白纯化技术 领域。 为解决现有沉淀盐纯化蛋白的过程中引发 的以下问题： 1)局部盐浓度过大引起蛋白质分子 发生变性问题； 2)因为沉淀盐和蛋白混合液混合 不均发生盐析现象。 本发明提供了一种沉淀盐溶 液与蛋白混合液充分混匀的装置， 利用该装置对 沉淀盐溶液纯化目的蛋白的过程进行优化， 过滤 去除未发生沉淀的蛋白， 同时截留已经沉淀的目 的蛋白于滤膜中， 有效简化纯化流程同时可用于 大体积的蛋白纯化。 经过该装置沉淀的目的蛋白 再经过一步离子交换色谱柱的纯化，。

3、 即可将杂蛋 白全部去除， 得到纯度达95以上的目的蛋白， 具有极高的经济效益， 本发明可用于蛋白分离与 纯化。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 111471084 A 2020.07.31 CN 111471084 A 1.一种用于蛋白沉淀的装置， 其特征在于， 包括溶剂瓶A、 溶剂瓶B、 溶剂瓶C、 溶剂瓶D、 速度控制器(1)、 预混容器(2)、 蠕动装置(3)、 抽动泵E(4)、 抽动泵F(6)和过滤装置(5)； 其 中： 溶剂瓶A用于盛放蛋白混合液； 溶剂瓶B用于盛放沉淀盐溶液； 溶剂瓶C用于盛放溶解缓 冲液； 溶剂瓶D用于收集经过滤装置(5)过滤获得的蛋白溶解液； 所述。

4、速度控制器(1)用于控 制所在导管内液体流速； 所述预混容器(2)为三通结构， 包括2个进料口和1个出料口， 其中2 个进料口分别与速度控制器(1)的出料端连接， 速度控制器(1)的进料端分别插入溶剂瓶A 和溶剂瓶B的液面以下， 预混容器(2)的出料口与蠕动装置(3)的进料端连接， 蠕动装置(3) 的出料端通过抽动泵E(4)与过滤装置(5)的进料口连接； 抽动泵F(6)的进料口插入至溶剂 瓶C液面以下， 抽动泵F(6)的出料口与过滤装置(5)的进料口连接； 过滤装置(5)的出料口插 入到溶剂瓶D中。 2.根据权利要求1所述的装置， 其特征在于， 所述蠕动装置(3)为内部设有铁丝或塑料 材质的丝。

5、网或条状结构的蠕动管。 3.根据权利要求1所述的装置， 其特征在于， 所述过滤装置(5)上设置有孔径大小为 0.22 m的过滤网。 4.一种利用权利要求1-3任意一项所述的装置从蛋白混合液中分离纯化目的蛋白的方 法， 其特征在于， 包括如下步骤： 1)沉淀蛋白： 将蛋白混合液装入溶剂瓶A中， 沉淀盐溶液装入溶剂瓶B中， 打开抽动泵E (4)， 利用速度控制器(1)控制所在导管内液体流速， 溶剂瓶A和溶剂瓶B内液体在预混容器 (2)内进行混合， 混合液再经过蠕动装置(3)进行混匀； 随后混匀液经过滤装置(5)过滤， 在 过滤装置(5)上获得发生沉淀的目的蛋白； 所述蛋白混合液和沉淀盐溶液的体积比。

6、例为(1： 1)(1： 4)； 所述沉淀盐溶液选自硫酸铵盐溶液、 硫酸钠盐溶液、 柠檬酸钠盐溶液、 柠檬酸钾 盐溶液和磷酸钾盐溶液中的一种， 浓度为24M； 2)溶解蛋白： 打开抽动泵F(6)， 从溶剂瓶C中抽取溶解缓冲液， 溶解过滤装置(5)上沉淀 的目的蛋白， 蛋白溶解液收集至溶剂瓶D中； 3)然后纯化获得目的蛋白。 5.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤1)所述蛋白混合液和沉淀盐溶液的体 积比例为1： 3， 所述沉淀盐溶液为硫酸铵盐溶液或柠檬酸钠盐溶液， 浓度为3M。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤2)所述溶解缓冲液选自磷酸缓冲液、 MES缓冲液、 HEP。

7、ES缓冲液中的一种， 溶解缓冲液使用体积与蛋白混合液体积比例是2： 1。 7.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 步骤3)所述纯化是指利用离子交换色谱柱 进行纯化。 8.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述离子交换色谱柱为阳离子交换色谱 柱、 阴离子交换色谱柱、 弱阳离子交换色谱柱、 弱阴离子交换色谱柱或复合型离子交换色谱 柱。 9.根据权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述离子交换色谱柱为复合型离子交换色 谱柱Capto MMC或Capto adhere。 10.根据权利要求8所述的方法， 其特征在于， 若缓冲液pH大于目的蛋白等电点pI， 目的 蛋白带负电荷， 选择阴离。

8、子交换色谱柱； 若缓冲液pH小于目的蛋白等电点pI， 目的蛋白带正 电荷， 选择阳离子交换色谱柱。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111471084 A 2 一种用于蛋白沉淀的装置及从蛋白混合液中分离纯化目的蛋 白的方法 技术领域 0001 本发明属于蛋白纯化技术领域， 具体涉及一种用于蛋白沉淀的装置及从蛋白混合 液中分离纯化目的蛋白的方法。 背景技术 0002 在对蛋白混合液进行蛋白纯化过程中， 采用向蛋白混合液中加入沉淀盐固体如硫 酸铵固体、 柠檬酸钠固体时， 会导致瞬间局部盐浓度过大， 使得蛋白结构发生变化而失去活 性； 而现有的采用缓慢加入沉淀盐或提前将沉淀盐研磨成粉末， 尽管会降。

9、低蛋白发生变性 的机率但又增加了纯化蛋白的时间。 发明内容 0003 为解决现有沉淀盐纯化蛋白的过程中引发的以下问题： 1)局部盐浓度过大引起蛋 白质分子发生变性问题； 2)因为沉淀盐和蛋白混合液混合不均发生盐析现象， 本发明提供 了一种用于蛋白沉淀的装置， 包括溶剂瓶A、 溶剂瓶B、 溶剂瓶C、 溶剂瓶D、 速度控制器1、 预混 容器2、 蠕动装置3、 抽动泵E4、 抽动泵F6和过滤装置5； 其中： 溶剂瓶A用于盛放蛋白混合液； 溶剂瓶B用于盛放沉淀盐溶液； 溶剂瓶C用于盛放溶解缓冲液； 溶剂瓶D用于收集经过滤装置 5过滤获得的蛋白溶解液； 所述速度控制器1用于控制所在导管内液体流速； 所述。

10、预混容器2 为三通结构， 包括2个进料口和1个出料口， 其中2个进料口分别与速度控制器1的出料端连 接， 速度控制器1的进料端分别插入溶剂瓶A和溶剂瓶B的液面以下， 预混容器2的出料口与 蠕动装置3的进料端连接， 蠕动装置3的出料端通过抽动泵E4与过滤装置5的进料口连接； 抽 动泵F6的进料口插入至溶剂瓶C液面以下， 抽动泵F6的出料口与过滤装置5的进料口连接； 过滤装置5的出料口插入到溶剂瓶D中。 0004 进一步地限定， 所述蠕动装置3为内部设有铁丝或塑料材质的丝网或条状结构的 蠕动管。 0005 进一步地限定， 所述过滤装置5上设置有孔径大小为0.22 m的过滤网。 0006 本发明还提。

11、供了一种利用上述装置从蛋白混合液中分离纯化目的蛋白的方法， 包 括如下步骤： 0007 1)沉淀蛋白： 将蛋白混合液装入溶剂瓶A中， 沉淀盐溶液装入溶剂瓶B中， 打开抽动 泵E4， 利用速度控制器1控制所在导管内液体流速， 溶剂瓶A和溶剂瓶B内液体在预混容器2 内进行混合， 混合液再经过蠕动装置3进行混匀； 随后混匀液经过滤装置5过滤， 在过滤装置 5上获得发生沉淀的目的蛋白； 所述蛋白混合液和沉淀盐溶液的体积比例为(1： 1)(1： 4)； 所述沉淀盐溶液选自硫酸铵盐溶液、 硫酸钠盐溶液、 柠檬酸钠盐溶液、 柠檬酸钾盐溶液和磷 酸钾盐溶液中的一种， 浓度为24M； 0008 2)溶解蛋白： 。

12、打开抽动泵F6， 从溶剂瓶C中抽取溶解缓冲液， 溶解过滤装置5上沉淀 的目的蛋白， 蛋白溶解液收集至溶剂瓶D中； 说明书 1/8 页 3 CN 111471084 A 3 0009 3)然后纯化获得目的蛋白。 0010 进一步地限定， 步骤1)所述蛋白混合液和沉淀盐溶液的体积比例为1： 3， 所述沉淀 盐溶液为硫酸铵盐溶液或柠檬酸钠盐溶液， 浓度为3M。 0011 进一步地限定， 步骤2)所述溶解缓冲液选自磷酸缓冲液、 MES缓冲液、 HEPES缓冲液 中的一种， 溶解缓冲液使用体积与蛋白混合液体积比例是2： 1。 0012 进一步地限定， 步骤3)所述纯化是指利用离子交换色谱柱进行纯化。 0。

13、013 进一步地限定， 所述离子交换色谱柱为阳离子交换色谱柱、 阴离子交换色谱柱、 弱 阳离子交换色谱柱、 弱阴离子交换色谱柱或复合型离子交换色谱柱。 0014 所述复合型离子交换柱同时具有耐高盐、 体积排阻或疏水作用等的一种和离子交 换功能。 0015 进一步地限定， 所述离子交换色谱柱为复合型离子交换色谱柱Capto MMC或Capto adhere。 0016 进一步地限定， 若缓冲液pH大于目的蛋白等电点pI， 目的蛋白带负电荷， 选择阴离 子交换色谱柱； 若缓冲液pH小于目的蛋白等电点pI， 目的蛋白带正电荷， 选择阳离子交换色 谱柱。 0017 有益效果 0018 1.现有沉淀盐纯。

14、化目的蛋白的方法中， 经常是将沉淀盐固体缓慢加入蛋白混合液 中， 待沉淀盐完全溶解后， 静置2h， 高速离心得发生沉淀的目的蛋白。 该方法很容易使目的 蛋白结构发生变化且耗时长。 本发明提供了一种沉淀盐溶液与蛋白混合液充分混匀的装置 及从蛋白混合液中纯化目的蛋白的方法， 是将沉淀盐溶液与蛋白混合液按比例混合， 避免 局部盐浓度过大， 且在蠕动装置中可以使得将发生沉淀的蛋白与沉淀盐溶液充分混匀。 0019 2.在沉淀蛋白时， 本发明先配制一定浓度的沉淀盐溶液， 将蛋白混合液和沉淀盐 溶液以一定比例混合并发生充分混匀， 使盐离子与蛋白质分子竞争水分子， 从而破坏蛋白 质表面的水化膜， 降低其溶解度。

15、， 使蛋白质从溶液中充分沉淀出来。 可以避免蛋白变性的现 象。 将发生沉淀的蛋白经过一步色谱柱的纯化即可得到较高纯度的蛋白质。 0020 3.利用色谱柱纯化蛋白时， 通常借助标签的纯化， 如在目的蛋白两端加上His标 签， 纯化时利用镍柱纯化。 但是后续会涉及将标签去除的酶催化工艺， 无形中增加纯化负 担。 而本发明采用的蛋白纯化方法无需后续标签切除， 可有效降低成本， 简化纯化过程。 0021 综上所述， 本发明纯化方法基于一步全自动沉淀盐溶液与蛋白混合液的混合发生 沉淀即沉淀盐纯化和一步离子交换色谱柱纯化， 利用自动化装置对沉淀盐溶液纯化目的蛋 白的过程进行优化， 可以过滤去除未发生沉淀的。

16、蛋白， 同时截留已经沉淀的目的蛋白于滤 膜中， 提高了目的蛋白的纯度； 利用溶解缓冲液溶解滤膜上的蛋白， 可以达到循环高效利用 的功能。 此外， 已经溶解后的蛋白再次经过一步柱纯化， 可得到纯度达99.1的目的蛋白溶 液， 有效简化纯化流程同时可用于大体积的蛋白纯化， 具有极高的经济效益。 附图说明 0022 图1.用于蛋白沉淀的装置示意图， 其中1为速度控制器， 2为预混容器， 3为蠕动装 置， 4为抽动泵E4， 控制与蠕动装置连接的管道的流速， 5为过滤装置， 6为抽动泵F6， 控制装 有溶剂瓶C内溶液管道的流速。 说明书 2/8 页 4 CN 111471084 A 4 0023 图2.。

17、SDS-PAGE展示硫酸铵沉淀蛋白的最适加入体积比， 其中M代表蛋白marker (KDa)LS代表蛋白混合液， 1/1、 1/2、 1/3、 1/4分别代表蛋白混合液与硫酸铵盐溶液的不同体 积比。 0024 图3.SDS-PAGE展示柠檬酸钠沉淀蛋白的最适加入体积比， 其中M代表蛋白marker (KDa)， LS代表蛋白混合液， 1/1、 1/2、 1/3、 1/4分别代表蛋白混合液与柠檬酸钠盐溶液的不 同体积比。 0025 图4.SEC-HPLC比较硫酸铵沉淀和柠檬酸钠沉淀对纯化蛋白的效果， 横坐标为洗脱 时间(分钟)， 纵坐标为UV 280nm(mAU),UV 260nm(mAU)， 。

18、LS代表未经沉淀处理的蛋白混合液 的液相分析结果， LS硫酸铵沉淀代表蛋白混合液经过硫酸铵盐溶液处理后， 进行液相分析 的结果， LS柠檬酸钠沉淀代表蛋白混合液经过柠檬酸钠盐溶液处理后， 进行液相分析的结 果。 0026 图5.硫酸铵沉淀处理后样品经Capto MMC色谱柱分离纯化结果， 横坐标为洗脱体 积(毫升)， 左侧纵坐标为UV 280nm(mAU)， 右侧纵坐标为电导率Conductivity(mS/cm)。 0027 图6.SDS-PAGE显示经Capto MMC纯化后， 各收集峰成分分析结果， 其中M代表蛋白 marker(KDa)， LS为蛋白混合液。 0028 图7.SEC-H。

19、PLC分析经Capto MMC纯化后， 各收集峰成分分析结果， 横坐标为洗脱时 间(分钟)， 纵坐标为UV 280nm(mAU),UV 260nm(mAU)。 具体实施方式 0029 本发明涉及的名词或术语： 0030 抽动泵： 指能够抽动液体的装置， 由于控制的管道不同， 本发明所述装置含有两个 抽动泵， 分别命名为抽动泵E和抽动泵F。 0031 蛋白溶解液： 指利用缓冲液将蛋白溶解后获得的溶液。 0032 溶解缓冲液： 指用于溶解蛋白的缓冲液。 0033 速度控制器： 控制液体流速的装置， 如液体流量计或液体流量控制计， 作用在于控 制导管内流经液体的流速。 0034 下面结合具体实施例来。

20、进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。 但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的保护范围构成任何限制。 实施例中 的实验方法， 如无特殊说明， 均采用本领域常规技术。 如无特殊说明， 所有化学试剂均为商 用常规分析纯试剂， 如无特殊说明， 所涉及的检测仪器均为本领域常规仪器或设备。 0035 本发明中目的蛋白可以为一种抗体， 如纳米抗体， 以下实施例以纯化纳米抗体VHH 为例进行说明。 0036 实施例1.用于蛋白纯化的装置。 0037 本发明提供了一种用于蛋白沉淀的装置， 如图1所示， 所述装置包括溶剂瓶A、 溶剂 瓶B、 溶剂瓶C、 溶剂瓶D、 速度控制器1、 。

21、预混容器2、 蠕动装置3、 抽动泵E4、 抽动泵F6和过滤装 置5； 其中： 溶剂瓶A用于盛放蛋白混合液； 溶剂瓶B用于盛放沉淀盐溶液； 溶剂瓶C用于盛放 溶解缓冲液； 溶剂瓶D用于收集经过滤装置5过滤获得的蛋白溶解液； 所述速度控制器1用于 控制所在导管内液体流速； 所述预混容器2为三通结构， 包括2个进料口和1个出料口， 其中2 个进料口分别与速度控制器1的出料端连接， 速度控制器1的进料端分别插入溶剂瓶A和溶 说明书 3/8 页 5 CN 111471084 A 5 剂瓶B的液面以下， 预混容器2的出料口与蠕动装置3的进料端连接， 蠕动装置3的出料端通 过抽动泵E4与过滤装置5的进料口连。

22、接； 抽动泵F6的进料口插入至溶剂瓶C液面以下， 抽动 泵F6的出料口与过滤装置5的进料口连接； 过滤装置5的出料口插入到溶剂瓶D中。 0038 所述蠕动装置3可以是内部设有铁丝或塑料材质的丝网或条状结构的蠕动管， 用 于减缓液体流动速度， 使管内流经的混合液体充分混匀， 所述过滤装置5上设置有孔径大小 为0.22 m的过滤网。 0039 工作时， 打开抽动泵E4， 将溶剂瓶A中蛋白混合液和溶剂瓶B中的沉淀盐溶液以一 定比例混合通过速度控制器1抽取到预混容器2中进行预混， 预混液在通过蠕动装置3的过 程中可充分混匀， 混匀液经导管抽取到带有0.22 m的过滤网的过滤装置5上， 进行过滤， 发 。

23、生沉淀的蛋白被截留在过滤装置上， 弃滤液， 然后打开抽动泵F6， 将溶剂瓶C中的溶解缓冲 液抽取到过滤装置5上， 冲洗滤膜上的目的蛋白， 溶解含有目的蛋白的沉淀， 滤液(即蛋白溶 解液)收集到溶剂瓶D中， 经纯化即获得目的蛋白。 0040 实施例2.利用实施例1所述的装置进行纯化蛋白时最优参数的确定。 具体如下： 0041 1)沉淀蛋白： 首先配制3M硫酸铵盐溶液， 置于溶剂瓶B中， 磷酸缓冲液(20mM PB,pH 7.0)置于溶剂瓶C中， 将蛋白混合液置于溶剂瓶A中。 将连通溶剂瓶A的导管管道的流速通过 所在管道速度控制器1设定为1mL/min,连通溶剂瓶B的管道流速通过所在管道速度控制器。

24、1 设定为1mL/min， 蛋白混合液和硫酸铵盐溶液1： 1体积比例混合， 打开抽动泵E4， 并设定总流 速2mL/min， 将溶剂瓶A与溶剂瓶B中液体抽取到预混容器2中进行预混合， 然后在蠕动管3中 充分混匀； 随后经过具有0.22 m孔径大小的过滤装置5， 此时发生沉淀的蛋白被截留在过滤 装置5上， 上清液被过滤至溶剂瓶D中。 待溶剂瓶A中蛋白混合液抽完后， 停止蛋白混合液与 3M硫酸铵盐溶液的混合， 将抽动泵E4关闭。 将溶剂瓶A中液体换成溶剂瓶D中的上清液， 并称 量总体积记作a ml。 0042 2)溶解蛋白： 打开抽动泵F6， 使磷酸缓冲液冲洗滤膜上的沉淀蛋白， 并过滤至溶剂 瓶D。

25、中， 得到蛋白混合液和硫酸铵盐溶液按1： 1体积比混合的沉淀溶解液。 此过程所用磷酸 缓冲液体积为a mL。 0043 将抽动泵E4打开， 设定总流速1.5mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速同样 分别设定1mL/min和0.5mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时蛋白混 合液和硫酸铵盐溶液混合比例是1： 2(体积比)。 此时溶剂瓶D中为混合比例1： 2(体积比)的 上清， 并将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 0044 随后打开抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲液溶解滤膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合 液和硫酸铵盐溶液按比例1： 2(体积比)混合的沉淀溶解。

26、液。 0045 将抽动泵E4打开， 设定总流速1.0mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速分别 设定0.75mL/min和0.25mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时蛋白混 合液和硫酸铵盐溶液混合比例是1： 3(体积比)。 同时此时溶剂瓶D中为混合比例1： 3的上清， 并将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 0046 随后打开抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲液溶解滤膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合 液和硫酸铵盐溶液按比例1： 3(体积比)混合的沉淀溶解液。 0047 将抽动泵E4打开， 设定总流速1.25mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速同 样分。

27、别设定1mL/min和0.25mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时蛋白 说明书 4/8 页 6 CN 111471084 A 6 混合液和硫酸铵盐溶液混合比例是1： 4(体积比)。 同时此时溶剂瓶D中为混合比例1： 4(体积 比)的上清， 并将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 随后打开抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲液 溶解滤膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合液和硫酸铵盐溶液按比例1： 4(体积比)混合的沉淀 溶解液。 0048 将蛋白混合液与硫酸铵盐溶液分别按照1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4(体积比)混合后过滤获 得的上清和沉淀进行SDS-PAGE(。

28、图2)。 从图中看出在蛋白混合液和硫酸铵盐溶液的混合比 例在1： 1(体积比)时， 目的蛋白主要在上清中； 在混合比例为1： 2(体积比)时上清和沉淀中 都有目的蛋白； 在混合比例为1： 3(体积比)时主要在沉淀中， 上清中几乎没有； 在混合比例 为1： 4(体积比)时上清和沉淀都看不到目的蛋白。 综上， 在蛋白混合液和硫酸铵盐溶液1： 1 (体积比)时去除沉淀， 留上清， 再次向上清中加入硫酸铵盐溶液至混合比例为1： 3， 此时舍 去上清、 留沉淀。 0049 3)获得的沉淀溶解液可经纯化后获得高纯度的目的蛋白。 0050 实施例3.利用柠檬酸钠溶液沉淀纳米抗体VHH的方法， 按照如下步骤进。

29、行： 0051 1)沉淀蛋白： 首先配制3M柠檬酸钠盐溶液置于溶剂瓶B中， 磷酸缓冲液(20mM PB, pH 7.0)置于溶剂瓶C中， 将蛋白混合液置于溶剂瓶A中。 将连通溶剂瓶A的管道通过所在管 道速度控制器1将流速设定为1mL/min,连通溶剂瓶B的管道通过所在管道速度控制器1将流 速设定为1mL/min， 蛋白混合液和柠檬酸钠盐溶液1： 1体积比例混合， 打开抽动泵E4， 并设定 总流速2mL/min， 将溶剂瓶A与溶剂瓶B中液体抽取到预混容器2中进行预混合， 然后在蠕动 管3中充分混匀。 随后经过具有0.22 m孔径大小的过滤装置5， 此时发生沉淀的蛋白被截留 在过滤装置5上， 上清。

30、液被过滤至溶剂瓶D中。 待溶剂瓶A中蛋白混合液抽完后， 停止蛋白混 合液与3M柠檬酸钠盐溶液的混合， 将抽动泵E4关闭。 将溶剂瓶A中液体换成溶剂瓶D中的上 清液， 并称量总体积记作a mL。 0052 2)溶解蛋白： 打开抽动泵F6， 使磷酸缓冲液冲洗滤膜上的沉淀蛋白， 并过滤至溶剂 瓶D中， 得到蛋白混合液和柠檬酸钠盐溶液按1： 1体积比混合的沉淀溶解液。 此过程所用磷 酸缓冲液体积为a mL。 0053 将抽动泵E4打开， 设定总流速1.5mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速同样 分别设定1mL/min和0.5mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时。

31、蛋白混 合液和柠檬酸钠盐溶液混合比例是1： 2(体积比)。 此时溶剂瓶D中为混合比例1： 2(体积比) 的上清， 并将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 随后打开抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲液溶解 滤膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合液和柠檬酸钠盐溶液按比例1： 2(体积比)的沉淀溶解液。 0054 将抽动泵E4打开， 设定总流速1mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速同样分 别设定0.75mL/min和0.25mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时蛋白 混合液和柠檬酸钠盐溶液混合比例是1： 3(体积比)。 同时此时溶剂瓶D中为混合比例1： 3的 上清， 并。

32、将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 随后打开抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲液溶解滤 膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合液和柠檬酸钠盐溶液按比例1： 3(体积比)混合的沉淀溶解 液。 0055 将抽动泵E4打开， 设定总流速1.25mL/min,连通溶剂瓶A与溶剂瓶B的管道流速同 样分别设定1mL/min和0.25mL/min， 至溶剂瓶A中液体全部抽完， 将抽动泵E4关闭。 此时蛋白 混合液和柠檬酸钠盐溶液混合比例是1： 4(体积比)。 同时此时溶剂瓶D中为混合比例1： 4(体 说明书 5/8 页 7 CN 111471084 A 7 积比)的上清， 并将溶剂瓶D内液体倒入溶剂瓶A中。 随后打开。

33、抽动泵F6， 抽a mL的磷酸缓冲 液溶解滤膜上的沉淀蛋白， 得到蛋白混合液和柠檬酸钠盐溶液按比例1： 4(体积比)的沉淀 溶解液。 0056 将蛋白混合液与柠檬酸钠盐溶液分别按照1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4(体积比)混合后过滤 获得的上清和沉淀进行SDS-PAGE(图3)， 从图中看出在混合比例是1： 1(体积比)与1： 2(体积 比)时， 上清和沉淀中都有目的蛋白， 在混合比例为1： 3(体积比)时主要在沉淀中， 上清中几 乎没有； 在混合比例为1： 4(体积比)时上清和沉淀都看不到目的蛋白的条带， 说明此时已经 几乎没有目的蛋白。 综上蛋白混合液和柠檬酸钠最适混合比例为1。

34、： 3时， 舍弃上清， 留沉淀 溶解液。 0057 利用SEC-HPLC(尺寸排阻高性能液相色谱法)分析硫酸铵沉淀盐溶液和柠檬酸钠 沉淀盐溶液处理样品的成分(图4)， 经柠檬酸钠沉淀盐溶液处理后样品纯度达61.9， 回收 率达61.4， 宿主蛋白残留量为39427ppm， DNA残留量为12602ppb； 而经硫酸铵沉淀盐溶液 处理后样品的纯度达69.1， 回收率是96.7， 宿主蛋白含量38504ppm， DNA残留量为 35253ppb。 综上最终选择硫酸铵沉淀盐溶液对含纳米抗体的混合液做第一步沉淀处理。 0058 3)获得的沉淀溶解液可经纯化后获得高纯度的目的蛋白。 0059 实施例4.。

35、利用实施例1所述的装置从蛋白混合液中分离纯化目的蛋白的方法。 0060 本发明较优方法是蛋白混合液与3M硫酸铵盐溶液体积比1： 1时， 舍去沉淀， 留上 清， 再向上清中加硫酸铵盐溶液至体积比达到1： 3时， 舍去上清， 留沉淀。 在抽动泵的作用下 混合， 并在后面的蠕动管中充分接触混匀后， 经过具有过滤功能的过滤装置， 使得发生沉淀 的蛋白在过滤装置中被截留。 随后利用pH 7.0的磷酸缓冲液溶解过滤装置上的沉淀， 发生 溶解后的沉淀再次被过滤出去。 随后将溶有沉淀蛋白的样品经过复合离子交换色谱柱 Capto MMC纯化， 最终得到高纯度的目的蛋白。 0061 下述为结合硫酸铵沉淀和复合型离。

36、子色谱柱Capto MMC纯化纳米抗体VHH的方法， 该方法按照如下步骤进行： 0062 1)沉淀蛋白： 将含有纳米抗体VHH的蛋白混合液200mL置于溶剂瓶A中， 3M的硫酸铵 溶液置于溶剂瓶B中， 20mM磷酸缓冲液置于溶剂瓶C中， 将连通溶剂瓶A中管道通过所在管道 速度控制器1设定流速设定为1mL/min,连通溶剂瓶B中管道通过所在管道速度控制器1流速 设定为1mL/min， 蛋白混合液和硫酸铵盐溶液1： 1体积比例混合， 打开抽动泵E4， 并设定总流 速2mL/min， 使得溶剂瓶A与溶剂瓶B中液体抽取到预混容器2中混合， 在蠕动管3中充分混 匀。 随后经过具有0.22 m孔径大小的过。

37、滤装置5， 此时发生沉淀的蛋白被截留在过滤装置5 上， 上清液被过滤至溶剂瓶D中。 溶剂瓶A中蛋白混合液抽完关闭抽动泵E4； 随即将溶剂瓶D 中上清倒入溶剂瓶A中。 0063 2)溶解蛋白： 打开抽动泵F6， 使磷酸缓冲液溶解滤膜上沉淀蛋白， 并过滤至溶剂瓶 D中， 此过程中消耗400mL磷酸缓冲液， 同时舍去此过程中得到的蛋白溶解液。 0064 打开抽动泵E4， 流速调制2mL/min， 将连通溶剂瓶A的管道流速通过所在管道速度 控制器1设定1mL/min， 连通溶剂瓶B的管道流速通过所在管道速度控制器1设定为1mL/min， 待溶剂瓶A中上清液全部抽完， 将抽动泵E4关闭， 打开抽动泵F6。

38、， 流速设定1mL/min。 抽取 400mL磷酸缓冲液溶解过滤装置5上的沉淀， 即可得到蛋白混合液与3M硫酸铵溶液比例是1： 3(体积比)的沉淀溶解液。 将待纯化的沉淀溶解液用0.22 m的滤膜过滤。 说明书 6/8 页 8 CN 111471084 A 8 0065 3)然后纯化获得目的蛋白。 0066 仅通过一步沉淀法是很难得到纯度较高的目的蛋白， 本发明在发生盐沉淀的基础 上经过一步柱上纯化得到纯度较高的目的蛋白。 在此步的柱纯化经常选择离子交换色谱 柱， 所述离子交换色谱柱为阳离子交换色谱柱、 阴离子交换色谱柱、 弱阳离子交换色谱柱、 弱阴离子交换色谱柱或复合型离子交换色谱柱。 阳离。

39、子色谱柱是指本身带负电荷， 可以吸 附带有正电荷的蛋白于填料中， 再通过增加盐离子浓度的作用下将带正电荷的蛋白从填料 上洗脱下来。 阴离子色谱柱是指本身带正电荷， 可以吸附带负电荷的蛋白， 同样再增加盐离 子浓度即可将吸附于填料的蛋白洗脱下来。 对于具体选择阳离子色谱柱或阴离子色谱柱可 根据目的蛋白等电点与目的蛋白所处缓冲液的pH大小决定， 若缓冲液pH大于目的蛋白等电 点pI， 目的蛋白带负电荷， 选择阴离子交换色谱柱； 若缓冲液pH小于目的蛋白等电点pI， 目 的蛋白带正电荷， 选择阳离子交换色谱柱。 0067 本实施例中纯化采用复合型离子交换色谱柱Capto MMC。 0068 方法如下。

40、： 利用Capto MMC色谱柱对上步得到的沉淀溶解液进行进一步纯化。 0069 首先， 启动NGC Chromatography System， 将pump调至 “Manual Load Loop” 模式， 将A、 B泵进样管放入去离子水中,Mode设置为Isocratic， B设置为50。 切换至流速设置界 面， 调节流速为2mL/min， 点击 “Start” ， 冲洗5min。 0070 然后， 打开流速设置界面， 设置流速为1mL/min， 设置压力上限为40psi， 点击 “Apply” ， 将Capto MMC安装在NGC Chromatography System上， 用去离子。

41、水平衡10个柱体积 (10mL)。 0071 第三步， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ， 将A、 B泵进样管放入20mM PB， 2M NaCl (pH 7.0)溶液中， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Isocratic， B设置为50， 点击 “Start” ， 用20mM PB-2M NaCl(pH 7.0)溶液激活色谱柱利用20个柱体积(20mL)。 0072 第四步， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ， 将A、 B泵进样管放入20mM PB， 1M NaCl (pH 7.0)溶液中， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Isocratic， B设。

42、置为50， 点击 “Start” ， 用20mM PB， 1M NaCl(pH 7.0)溶液平衡色谱柱利用20个柱体积(20mL)。 0073 第五步， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ， 将A泵进样管放入20mM PB(pH 7.0)溶液 中， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Isocratic， B设置为0， 点击 “Start” ， 用20mM PB溶 液平衡色谱柱利用50个柱体积(50mL)。 0074 第六步， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ， 将A泵进样管放入待纯化的沉淀溶解液， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Isocratic， B设置。

43、为0， 点击 “Start” 。 从此步骤以后， 根据分离的峰形图， 分段收集样品。 0075 第七步， 在将纯化的沉淀溶解液全部进入色谱柱时， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ,将A泵进样管放入20mM PB(pH 7.0)溶液中， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为 Isocratic， B设置为0， 点击 “Start” ， 用20mM PB溶液平衡色谱柱利用50个柱体积(50mL)。 0076 第八步， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ,将A泵进样管放入20mM PB(pH 7.0)溶液 中， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Gradient， B。

44、设置为Start 0End 90,Duration 60min点击 “Start” 。 0077 第九步， 打开流速设置界面， 流速仍设置为1mL/min， Mode设置为Isocratic， B设 置为100， 点击 “Start” ， 用20mM PB， 1M NaCl(pH 7.0)溶液冲洗色谱柱10柱体积(10mL)。 说明书 7/8 页 9 CN 111471084 A 9 0078 第十步， 打开流速界面， 点击 “Stop” ， 将B进样管放入1M NaOH溶液内， Mode设置为 Isocratic， B设置为100，“Start” ， 用1M NaOH洗杂冲洗色谱柱10个柱体。

45、积(10mL)。 0079 第十一步， 打开流速界面， 点击 “Stop” ， 将B进样管放入20乙醇溶液中， Mode设置 为Isocratic， B设置为100， 点击 “Start” ， 用20乙醇保存色谱柱， 冲洗20个柱体积 (20mL)。 将Capto MMC卸下保存， 打开流速设置界面， 点击 “Stop” ， 关闭NGC Chromatography System。 纯化结果见图5与图6。 0080 蛋白混合液经过硫酸铵盐溶液沉淀和Capto MMC复合色谱柱方法纯化后， 可见到 单一的目的蛋白条带(图5， 图6中峰2所示)。 同时洗脱峰的样品进行了SEC-HPLC分析， 结果。

46、 见图7中峰2所示。 纯化效果良好， 可以分离出较纯的目的蛋白， 且宿主DNA残留量由 12602ppb降为10154ppb,宿主蛋白残留量由38427ppm降为373ppm。 0081 本发明所述用于蛋白沉淀的装置同样适用于其他蛋白的沉淀处理； 同时从蛋白混 合液中分离纯化目的蛋白的方法也适用于其他蛋白的分离纯化。 说明书 8/8 页 10 CN 111471084 A 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 111471084 A 11 图3 图4 说明书附图 2/4 页 12 CN 111471084 A 12 图5 图6 说明书附图 3/4 页 13 CN 111471084 A 13 图7 说明书附图 4/4 页 14 CN 111471084 A 14 。