一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910924530.8 (22)申请日 2019.09.27 (83)生物保藏信息 GDMCC No： 60744 2019.08.19 (71)申请人 江南大学 地址 214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大 道1800号 (72)发明人 陈卫张秋香秦苏佳张灏 赵建新 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 张勇 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A61K 35/747(2015.01) A61P 1/0。

2、2(2006.01) A23C 9/12(2006.01) A23G 4/12(2006.01) C12R 1/225(2006.01) (54)发明名称 一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆 菌及其应用 (57)摘要 本发明公开了一株能够预防和/或治疗龋齿 的鼠李糖乳杆菌及其应用， 属于微生物技术领 域。 本发明筛选得到了一株鼠 李糖乳杆菌 CCFM1070， 此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在体外能够 抑制变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜， 使 得变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜量减 少72.56， 并且， 此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在大 鼠体内可显著降低龋齿造模引起的血糖指标的 。

3、上升、 减少龋齿造模引起的口腔内变异链球菌和 白色念珠菌数量的上升、 改善龋齿造模引起的牙 齿脱矿的情况以及提高龋齿造模引起的龋齿评 分的降低， 因此， 此鼠李糖乳杆菌CCFM1070在制 备预防和/或治疗龋齿的产品中， 具有巨大的应 用前景。 权利要求书1页 说明书13页 序列表1页 附图5页 CN 111518713 A 2020.08.11 CN 111518713 A 1.一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)， 其特征在于， 所述鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)的分类学命名为Lactobacillus rhamnosus， 。

4、已于2019年08月 19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心， 保藏编号为GDMCC No.60744， 保藏地址为广州市 先烈中路100号大院59号楼5楼。 2.一种用于预防和/或治疗龋齿的产品， 其特征在于， 所述产品含有权利要求1所述鼠 李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。 3.如权利要求2所述的产品， 其特征在于， 所述产品为药品、 食品或日化产品。 4.如权利要求3所述的产品， 其特征在于， 所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)以及载体。 5.如权利要求4所述的产品， 其特征在于， 所述食品为含有权利。

5、要求1所述鼠李糖乳杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖。 6.如权利要求5所述的产品， 其特征在于， 所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的牙膏。 7.一种制备用于预防和/或治疗龋齿的产品的方法， 其特征在于， 所述方法为使用权利 要求1所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。 8.如权利要求7所述的方法， 其特征在于， 所述产品为药品、 食品或日化产品。 9.如权利要求8所述的方法， 其特征在于， 所述药品的成分包含权利要求1所述鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus。

6、 rhamnosus)以及载体； 所述食品为含有权利要求1所述鼠李糖乳杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)的酸奶或口香糖； 所述日化产品为含有权利要求1所述鼠李 糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的牙膏。 10.如权利要求9所述的方法， 其特征在于， 所述载体为药学上可接受的载体。 权利要求书 1/1 页 2 CN 111518713 A 2 一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌及其应用， 属于微生物 技术领域。 背景技术 0002 龋齿是一种儿童口腔常见病， 主要表。

7、现为牙齿组织的破坏， 它会引起牙齿缺损、 疼 痛， 使咀嚼功能受到影响， 严重者甚至造成继发性牙髓炎、 颌骨骨髓炎， 对儿童的健康产生 严重的影响。 因此， 龋齿的预防以及治疗对儿童的健康至关重要。 0003 龋病是发生于牙釉质及牙本质上的细菌感染性疾病， 而牙菌斑生物膜的形成是龋 病发生的先决条件。 牙菌斑生物膜是由细菌在牙齿表面黏附并不断生长繁殖而形成的具有 代谢活性的膜状微生态系统， 生物膜中的细菌被包埋在由细菌本身产生的细胞外聚合物基 质中。 牙菌斑生物膜作用一种典型的生物膜结构， 其形成包括浮游阶段、 附着阶段、 初始微 菌落阶段和生物膜成熟以及散播阶段等四个过程。 一旦由于宿主的饮。

8、食等因素发生变化而 导致该牙菌斑生物膜的生态失衡时， 牙菌斑生物膜中的致龋微生物会成为优势菌群， 它们 快速代谢分解碳水化合物， 尤其是蔗糖， 产生乳酸、 甲酸、 乙酸和丙酸， 使牙菌斑生物膜的pH 降低到5.5以下， 导致牙釉质羟基磷灰石的脱矿化和牙齿硬组织结构损坏， 如果这种脱矿化 未加以干预， 就会导致脱矿-再矿化的过程失衡， 从而形成龋洞。 0004 变异链球菌是公认的主要致龋菌。 虽然变异链球菌不是口腔中最丰富的细菌， 但 它能快速协调致龋性生物膜的形成， 并能结合其他致龋菌形成毒力更强的致龋生物膜。 与 口腔中浮游细菌不同的是， 生物膜中的细菌通常由于营养受限， 处于近似休眠状态，。

9、 这种近 似休眠状态下的细菌比浮游的代谢活性细菌更耐抗生素和抑菌剂， 这无疑大大增加了龋齿 的预防以及治疗难度。 0005 临床调查发现， 龋病患者的口腔中通常可同时检出白色念珠菌和变异链球菌， 提 示二者之间可能存在某种互动关系并介导龋病的发展。 白色念珠菌与变异链球菌的关联能 够增强变异链球菌的致病性并强化致龋生物膜的形成。 白色念珠菌粘附牙面的能力较弱， 但与变异链球菌结合后， 口腔定植能力大大增强。 变异链球菌产生的葡萄糖基转移酶(GTF) 可与白色念珠菌细胞壁上的甘露聚糖粘附， 将其募集到早期牙菌斑生物膜上(具体可见参 考文献： Ellepola K,Liu Y,Cao T,et a。

10、l.Bacterial GtfB augments Candida albicans accumulation in cross-kingdom biofilmsJ.Journal of dental research,2017,96 (10):1129-1135.)。 具有更大表面积的白色念珠菌可为更多的变异链球菌提供结合位点， 增多的变异链球菌数量反过来又增加了白色念珠菌的数量。 双种生物膜比单种生物膜具有 更高的生物量和细胞数量， 目前， 已有研究证实白色念珠菌和口腔链球菌的双菌生物膜对 抗生素的耐药性高于单一物种(具体可见参考文献： Shirtliff M E,Peters B M,J。

11、abra- Rizk M A.Cross-kingdom interactions:Candida albicans and bacteriaJ.FEMS microbiology letters,2009,299(1):1-8.)， 这无疑进一步增加了龋齿的预防以及治疗难 度。 说明书 1/13 页 3 CN 111518713 A 3 0006 传统的对龋齿的处理方法主要是通过外科手术的方式机械性地挖除并填补龋损 部位， 但是， 这种方法实际上仅能在龋齿发病后， 被动地治疗龋齿， 不能起到预防的作用， 并 且， 这种方法在一次治疗后， 还有极大的复发可能， 并不能从根源上达到预防以及治疗龋。

12、齿 的目的。 除外科手术外， 临床上也会使用杀菌剂去灭杀存在于口腔中的致龋微生物， 但是， 这些杀菌剂除了会杀死致龋微生物外， 还会杀死口腔中大部份的其他微生物， 使得残存的 口腔微生物并不能维持口腔菌群的平衡， 进而导致龋齿复发， 并且， 许多杀菌剂在它们作用 于致龋微生物之前就先与致龋生物膜中的胞外多糖结合， 从而失去了效用， 这也是抗菌剂 在临床上防治龋齿效果不佳的原因之一。 0007 因此， 仍需找到一种能够从根本上预防和/或治疗龋齿的药物或治疗方式。 发明内容 0008 技术问题 0009 本发明要解决的技术问题是提供一株能够预防和/或治疗龋齿的鼠李糖乳杆菌 (Lactobacill。

13、us rhamnosus)。 0010 技术方案 0011 为解决上述问题， 本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1070， 所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的分类学命名为 Lactobacillus rhamnosus， 已于2019年08月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心， 保藏 编号为GDMCC No.60744， 保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。 0012 所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070来源于江苏无锡地区的 23。

14、周岁健康成年人的口腔拭子， 该菌株经测序分析， 其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示， 将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对， 结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌， 命名为鼠 李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。 0013 所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在MRS培养基上的菌落 呈小的半透明白色圆形。 0014 本发明还提供了一种用于预防和/或治疗龋齿的产品， 所述产品含有上述鼠李糖 乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。 0015 在本发明的一种实施方。

15、式中， 所述产品中， 上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1070的活菌数为不低于1109CFU/mL或11012CFU/g。 0016 在本发明的一种实施方式中， 所述产品为药品、 食品或日化产品。 0017 在本发明的 一 种实施方式中 ， 所述药品的成分包含上述鼠 李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以及载体。 0018 在本发明的一种实施方式中， 所述载体为药学上可接受的载体。 0019 在本发明的一种实施方式中， 所述载体为药学上可接受的填充剂、 润湿剂、 崩解 剂、 粘合剂、 润滑剂或矫味剂中的一种或多种。 0。

16、020 在本发明的一种实施方式中， 所述食品为上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的酸奶或口香糖。 0021 在本发明的一种实施方式中， 所述牙膏中还含有蔓越莓提取物。 0022 在本发明的 一 种实施方式中 ， 所述日化产品为含有上述鼠 李糖乳杆菌 说明书 2/13 页 4 CN 111518713 A 4 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的牙膏。 0023 本发明还提供了一种制备用于预防和/或治疗龋齿的产品的方法， 所述方法为使 用上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM107。

17、0。 0024 在本发明的一种实施方式中， 所述产品中， 上述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus casei)CCFM1070的活菌数为不低于1109CFU/mL或11012CFU/g。 0025 在本发明的一种实施方式中， 所述产品为药品、 食品或日化产品。 0026 在本发明的 一 种实施方式中 ， 所述药品的成分包含上述鼠 李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以及载体； 所述食品为含有上述鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070的酸奶或口香糖； 所述日化产品为含有上述鼠李糖 乳杆菌(Lactobaci。

18、llus rhamnosus)CCFM1070的牙膏。 0027 在本发明的一种实施方式中， 所述牙膏中还含有蔓越莓提取物。 0028 在本发明的一种实施方式中， 所述载体为药学上可接受的载体。 0029 在本发明的一种实施方式中， 所述载体为药学上可接受的填充剂、 润湿剂、 崩解 剂、 粘合剂、 润滑剂或矫味剂中的一种或多种。 0030 有益效果 0031 1、 本发明筛选得到了一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070， 此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在体外能够抑制变异链球菌和白色 念珠菌的双菌生物膜。

19、， 使得变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜量减少72.56， 并且， 此鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在大鼠体内可显著降低龋齿造模引 起的血糖指标的上升、 减少龋齿造模引起的口腔内变异链球菌和白色念珠菌数量的上升、 改善龋齿造模引起的牙齿脱矿的情况以及提高龋齿造模引起的龋齿评分的降低， 因此， 此 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070在制备预防和/或治疗龋齿的产品(如 药品、 食品或日化产品等)中， 具有巨大的应用前景。 0032 2、 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)是益生。

20、菌的一种， 目前已被纳入卫 生部下发的 可 用于食品的菌种名单 ， 因此 ， 本发明筛选得到的鼠 李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070不会给人体带来任何潜在的安全隐患， 用于预防和/ 或治疗龋齿的产品(如药品、 食品或日化产品等)中时， 安全性较高。 0033 生物材料保藏 0034 一株鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070， 分类学命名为 Lactobacillus rhamnosus， 已于2019年08月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心， 保藏 编号为GDMCC No.60744， 保藏地址为广州市先。

21、烈中路100号大院59号楼5楼。 附图说明 0035 图1： 鼠李糖乳杆菌CCFM1070对溶菌酶的耐受性。 0036 图2： 实施例1中的实验流程图。 0037 图3： 各组大鼠牙釉质的三维重建视图、 剖面图以及釉质分离图。 0038 图4： 各组大鼠牙釉质的体积变化情况。 0039 图5： 大鼠下颌磨牙颊舌面计分单位的划分示意图. 0040 图6： 大鼠下颌磨牙窝沟计分单位的划分示意图。 说明书 3/13 页 5 CN 111518713 A 5 0041 图7-10： 体式显微镜下各组大鼠磨牙观察图； 其中， A、 B、 C、 D、 E、 F、 G、 H分别为空白 对照组、 龋齿模型组、。

22、 洗必泰干预组、 洗必泰预防组、 CCFM1070干预组、 CCFM1070预防组、 CCFM634干预组、 CCFM634预防组大鼠磨牙光滑面染色图； a、 b、 c、 d、 e、 f、 g、 h分别为空白对照 组、 龋齿模型组、 洗必泰干预组、 洗必泰预防组、 CCFM1070干预组、 CCFM1070预防组、 CCFM634 干预组、 CCFM634预防组大鼠磨牙窝沟面(纵切面)染色图。 具体实施方式 0042 下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。 0043 下述实施例中涉及的SPF级Wistar大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司 (生产许可证号SCXK(京)2012。

23、-0001)； 下述实施例中涉及的变异链球菌购自中国普通微生 物菌种保藏中心， 产品编号为： ATCC 25175； 下述实施例中涉及的白色念珠菌购自北纳生 物， 产品名称为： SC5314； 下述实施例中涉及的植物乳杆菌CCFM634记载于公开号为 CN105132308A的专利申请文本中， 保藏编号为： CGMCC No.9740； 下述实施例中涉及的洗必 泰购自阿里健康大药房； 下述实施例中涉及的致龋饲料Diet 2000购自南通特洛菲饲料科 技有限公司； 下述实施例中涉及的溶菌酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。 0044 下述实施例中涉及的培养基如下： 0045 MRS培养基： 。

24、酵母粉5.0g/L、 牛肉膏10.0g/L、 蛋白胨10.0g/L、 葡萄糖20.0g/L、 无水 乙酸钠2.0g/L、 柠檬酸氢二胺2.0g/L、 磷酸氢二钾2.6g/L、 一水合硫酸锰0.25g/L、 七水合硫 酸镁0.5g/L和吐温-801mL/L， pH 6.26.4。 0046 TSBY培养基： 酵母粉6.0g/L、 大豆蛋白3.0g/L、 胰蛋白胨17.0g/L、 葡萄糖2.5g/L、 氯化钠5g/L和磷酸氢二钾2.5g/L， pH 7.07.4。 0047 YPD培养基： 酵母粉1.0g/L、 葡萄糖2.0g/L和蛋白胨2.0g/L。 0048 BIGGY培养基： 酵母提取物1.。

25、0g/L、 甘氨酸10.0g/L、 葡萄糖10.0g/L、 柠檬酸铋铵 5.0g/L、 亚硫酸钠3.0g/L、 琼脂16.0g/L， pH 6.67.0。 0049 MS(mitis salivarius agar)培养基： 酪蛋白胨15.0g/L、 动物组织胃酶水解物 5.0g/L、 D-葡萄糖1.0g/L、 蔗糖50.0g/L、 磷酸氢二钾4.0g/L、 锥虫蓝0.075g/L、 结晶紫 0.0008g/L和琼脂15.0g/L， pH 6.87.2。 0050 下述实施例中涉及的菌悬液的制备方法如下： 0051 鼠李糖乳杆菌菌悬液： 将鼠李糖乳杆菌菌体以占MRS培养基总体积2的的接种量 接。

26、种至MRS培养基中， 于37培养24h后调节菌液浓度为1109CFU/mL。 0052 植物乳杆菌菌悬液： 将植物乳杆菌菌体以占MRS培养基总体积2的的接种量接种 至MRS培养基中， 于37培养24h后调节菌液浓度为1109CFU/mL。 0053 变异链球菌菌悬液： 将变异链球菌菌体以占TSBY培养基总体积2的的接种量接 种至TSBY培养基中， 于37培养12h后调节菌液浓度为1109CFU/mL。 0054 白色念珠菌菌悬液： 将白色念珠菌菌体以占YPD培养基总体积2的的接种量接种 至YPD培养基， 于37培养12h后调节菌液浓度为1106CFU/mL。 0055 下述实施例中涉及的龋齿建。

27、模方法如下： 0056 选择雄性、 3周龄、 体重4050g的SPF级Wistar大鼠， 对大鼠用变异链球菌和白色 念珠菌进行侵染， 每天一次， 连续5天， 5天后， 每天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样， 将棉签置于 说明书 4/13 页 6 CN 111518713 A 6 1mL的生理盐水中， 使得棉签上的菌转移到生理盐水中， 将转移后的1mL生理盐水进行稀释 涂布并对变异链球菌和白色念珠菌的数量进行计数， 计数结果102CFU/mL即为建模成功， 期间， 若不成功， 需继续建模； 其中， 侵染的具体操作手法为： 用无菌棉棒饱和吸收变异链球 菌和白色念珠菌菌悬液各200 L， 涂于大鼠上下颚臼齿。

28、咬合面并作用15s， 在涂牙之后禁食 禁水半小时。 0057 下述实施例中涉及的介导方法如下： 0058 用无菌棉棒饱和吸收鼠李糖乳杆菌菌悬液200 L、 植物乳杆菌菌悬液200 L或 0.02的洗必泰(CHX)200 L， 涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s， 在涂牙之后禁食禁水 半小时。 0059 下述实施例中涉及的预防方法如下： 0060 选择雄性、 3周龄、 体重4050g的SPF级Wistar大鼠， 对大鼠用鼠李糖乳杆菌和植 物乳杆菌进行预防， 每天一次， 连续5天， 5天后， 每天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样， 将棉签置 于1mL的生理盐水中， 使得棉签上的菌转移到生理盐水中， 将转。

29、移后的1mL生理盐水进行稀 释涂布并对鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌的数量进行计数， 计数结果102CFU/mL即为预防成 功， 期间， 若不成功， 需继续预防； 其中， 预防的具体操作手法为： 用无菌棉棒饱和吸收鼠李 糖乳杆菌和植物乳杆菌菌悬液各200 L， 涂于大鼠上下颚臼齿咬合面并作用15s， 在涂牙之 后禁食禁水半小时。 0061 实施例1： 鼠李糖乳杆菌的筛选及菌种鉴定 0062 1、 筛选 0063 以来源于江苏无锡地区的23周岁健康成年人的口腔拭子为样本， 将样本经预处理 后， 在20甘油中保存于-80冰箱， 取出解冻后， 混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL， 以含 有0.05g。

30、/L半胱氨酸的0.9生理盐水进行梯度稀释， 选择合适的梯度稀释液涂布在含有 0.05g/L半胱氨酸以及20g/L琼脂的MRS培养基上， 于37培养48h， 挑取鼠李糖乳杆菌的典 型菌落至含有20g/L琼脂的MRS培养基上划线纯化， 挑取单菌落转接至含有0.05g/L半胱氨 酸的MRS培养基增菌， 30甘油保藏， 得到菌株CCFM1070； 其中， 鼠李糖乳杆菌的典型菌落呈 小的白色半透明圆形。 0064 2、 鉴定 0065 提取CCFM1070的基因组， 将CCFM1070的16S rDNA进行扩增和测序(由英维捷基公 司进行， CCFM1070扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ。

31、 ID NO.1所示)， 将该序列在 NCBI中进行核酸序列比对， 结果显示菌株为鼠李糖乳杆菌， 命名为鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070。 0066 实施例2： 鼠李糖乳杆菌的培养 0067 将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070接入含有0.05g/L半胱氨 酸以及20g/L琼脂的MRS培养基上， 于37培养48h后， 观察其菌落， 发现其菌落呈小的白色 半透明圆形。 0068 将鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070接入含有0.05g/L半胱氨 酸的MRS培养基中。

32、， 于37厌氧培养24h后， 转入新鲜的含有0.05g/L半胱氨酸的MRS培养基 中中， 同样条件培养24h， 6000g离心菌体15min， 0.9生理盐水洗涤菌体后6000g再次离心 10min， 得到菌体， 用30蔗糖溶液重悬， 冻存在-80待用。 说明书 5/13 页 7 CN 111518713 A 7 0069 实施例3： 鼠李糖乳杆菌对溶菌酶的耐受性 0070 在96孔培养板中加入200 L MRS培养基； 实验组继续于96孔培养板中分别添加不 同浓度的溶菌酶溶液使得MRS培养基中溶菌酶的终浓度分别为0.4、 0.8、 1.2、 1.6、 2.0、 3.0mg/mL， 对照组继续。

33、于96孔培养板中添加与溶菌酶溶液等体积的无菌水； 将实施例2获得 的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070以5(v/v)的接种量接种到96孔培 养板中， 37培养24h； 24h后， 测定96孔培养板中培养液在OD600下的吸光度， 根据吸光度值 判断鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶的耐受性， 检测结果见 图1。 0071 如图1所示， 以实验组OD值/对照组OD值10060为依据作为鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶具有高耐受性的标准， 鼠李糖乳。

34、杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)CCFM1070对溶菌酶的最高耐受浓度为1.6mg/mL， 远高于人口 腔唾液中溶菌酶的浓度(057 g/mL)， 说明， 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus) CCFM1070具备在口腔环境中存活的能力。 0072 实施例4： 鼠李糖乳杆菌对双菌生物膜的影响 0073 实验分为三组， 分别为鼠李糖乳杆菌介导组、 植物乳杆菌介导组以及空白对照组； 0074 其中， 鼠李糖乳杆菌介导组为： 将鼠李糖乳杆菌CCFM1070菌体以占MRS培养基总体 积2的的接种量接种至MRS培养基中， 于37培养24h， 获得培养液，。

35、 将培养液于8000r/ min、 4下离心5min， 获得上清液， 将上清液以0.22 m无菌滤膜过滤， 获得鼠李糖乳杆菌 CCFM1070上清； 在96孔板中加入变异链球菌和白色念珠菌菌悬液各50 L， 于37培养24h， 得到双菌生物膜， 将双菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍后， 在96孔板中加入鼠李糖乳杆菌 CCFM1070上清100 L， 于37继续培养24h， 得到共培养后的双菌生物膜， 将共培养后的双菌 生物膜用PBS缓冲液清洗2遍并在25下静置晾干后， 在96孔板中加入100 L的浓度为0.1 的结晶紫溶液， 对共培养后的双菌生物膜染色30min， 得到染色后的双菌生物膜， 将染。

36、色后 的双菌生物膜用PBS缓冲液清洗2遍后， 在96孔板中加入浓度为95的乙醇溶解染色后的双 菌生物膜， 于酶标仪中读取OD600下的吸光度值， 得到介导后的双菌生物膜量， 通过介导后的 双菌生物膜量计算鼠李糖乳杆菌CCFM1070介导后双菌生物膜的减少量； 0075 植物乳杆菌介导组为： 将植物乳杆菌CCFM634菌体以占MRS培养基总体积2的的 接种量接种至MRS培养基中， 于37培养24h， 获得培养液， 将培养液于8000r/min、 4下离 心5min， 获得上清液， 将上清液以0.22 m无菌滤膜过滤， 获得植物乳杆菌CCFM634上清； 在鼠 李糖乳杆菌介导组的基础上， 将鼠李糖。

37、乳杆菌CCFM1070上清替换为植物乳杆菌CCFM634上 清， 得到介导后的双菌生物膜量， 通过介导后的双菌生物膜量计算植物乳杆菌CCFM634介导 后双菌生物膜的减少量； 0076 空白对照组为： 在鼠李糖乳杆菌介导组的基础上， 将鼠李糖乳杆菌CCFM1070上清 替换为MRS培养基， 得到双菌生物膜量； 0077 介导后双菌生物膜的减少量()(空白对照组的双菌生物膜量-介导后的双菌 生物膜量)/空白对照组的双菌生物膜量。 0078 计算结果如下： 鼠李糖乳杆菌CCFM1070介导后， 双菌生物膜减少72.56， 植物乳 杆菌CCFM634介导后， 双菌生物膜减少65.57。 可见， 鼠李。

38、糖乳杆菌CCFM1070和植物乳杆菌 CCFM634均能抑制变异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜， 但鼠李糖乳杆菌CCFM1070对变 说明书 6/13 页 8 CN 111518713 A 8 异链球菌和白色念珠菌的双菌生物膜的抑制能力强于植物乳杆菌CCFM634。 0079 实施例5： 鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠血清生化、 口腔菌群计数、 牙齿脱矿情况以及 龋齿评分的影响 0080 实验流程如图2所示， 实验方案和分组如表1所示。 0081 取64只雄性、 3周龄、 体重4050g的SPF级Wistar大鼠， 随机分成8组， 每组8只， 8组 分别为空白对照组、 模型组、 洗必泰干预组、 洗必泰。

39、预防组、 CCFM1070干预组、 CCFM1070预防 组、 CCFM634干预组、 CCFM634预防组； 其中， 空白对照大鼠整个实验过程中正常饮食， 其他组 大鼠均喂以致龋饲料Diet 2000并在饮食中辅以添加有5(v/v)蔗糖的蒸馏水， 模型组和 干预组都需经历连续5天(第15天)的龋齿建模， 所有小鼠均在第67天建模成功， 建模成 功后， 干预组再分别用鼠李糖乳杆菌CCFM1070、 植物乳杆菌CCFM634或0.02的洗必泰 (CHX)分别连续介导5天(第812天)， 之后每周进行三次介导、 介导6周， 预防组都需经历连 续5天(第15天)的预防， 所有小鼠均在第67天预防成功。

40、， 预防成功后， 在第812天连续 5天对小鼠进行建模， 第1314天从大鼠牙齿用棉签擦拭取样， 将棉签置于1mL的生理盐水 中， 使得棉签上的菌转移到生理盐水中， 将转移后的1mL生理盐水进行稀释涂布并对变异链 球菌和白色念珠菌的数量进行计数， 计数后继续饲养6周。 0082 1、 鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠血清生化的影响 0083 实验结束后， 对各组大鼠禁食14h， 14h后， 对大鼠进行麻醉， 麻醉后， 将大鼠断颈处 死并进行心脏取血， 采血管静置半小时， 在4下3000 xg离心15min取得血清， -20保存， 通 过全自动生化分析仪测定血清指标， 检测项目包括血糖Glu(血液中葡萄糖。

41、含量)、 总胆固醇 (TC)、 甘油三酯(TG)、 高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)指标， 检 测结果见表2。 0084 由表2可知， 模型组大鼠的各项指标均较空白组大鼠有了明显的提高， CCFM1070预 防组大鼠的各项指标均较模型组大鼠有了明显的下降， 且下降效果比洗必泰干预组和 CCFM1070预防组更好。 可见， 鼠李糖乳杆菌CCFM1070的率先定植口腔可以减轻蔗糖饮食带 来的影响， 可能是其发挥龋齿防治的途径之一。 0085 2、 鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠口腔菌群计数的影响 0086 实验期间， 用无菌棉棒来回旋转刮取各组大鼠口腔牙面样本， 进行稀释。

42、涂布计数， 整个实验为期8周， 期间进行四次采样， 第一次取样在第6天作为致龋菌或鼠李糖乳杆菌 CCFM1070的定植检验， 第二次取样定植检验是在另外连续5天的菌悬液处理过后， 即实验第 13天， 第三次取样为实验第28天， 第四次取样为实验第56天即大鼠处死前做最后一次取样； 其中， 菌落计数共用到3种固体平板， 分别为MS(mitis salivarius agar)加200U/L的杆菌 肽对变异链球菌进行计数； 添加20 g/ml万古霉素的MRS固体培养基对大鼠口腔中的乳杆菌 进行计数； BIGGY固体培养基(BBL,No.211027,BD Diagnostic Systems)对白。

43、色念珠菌计 数， 计数结果见表3-5。 0087 由表3-4可知， 四次采样中， 模型组的变异链球菌计数结果都没有显著性差异， 而 白色念珠菌计数结果在第三次和第四次采样中均有上升趋势； 从干预组来看， 变异链球菌 和白色念珠菌的计数结果第一次采样中没有显著性差别， 但在第二、 三、 四次采样中， 洗必 泰和鼠李糖乳杆菌CCFM1070的干预使得变异链球菌的数量从4105CFU/mL降到了12 104CFU/mL(P0.05)， 使得白色念珠菌的数量同样降了一个数量级(P0.05)， 并且， 第四次 说明书 7/13 页 9 CN 111518713 A 9 采样结果显示， 鼠李糖乳杆菌CCF。

44、M1070抑制白色念珠菌的效果强于洗必泰， 可能是因为定 期的干预更有利于乳杆菌定植并且能够长久发挥作用； 从预防组效果来看， 变异链球菌的 数量水平在率先定植鼠李糖乳杆菌CCFM1070后保持在46104CFU/mL， 显著小于模型组 (P0.05)， 而洗必泰在预防后的两周天内有效果， 实验结束时基本没有抑制变异链球菌的 作用了， 白色念珠菌的定植在第一次采样和第二次采样期间均没有因为鼠李糖乳杆菌 CCFM1070的定植受到影响， 但在第三次和第四次采样中都显著降低(P0.05)， 而洗必泰在 整个过程中对白色念珠菌的定植没有任何抑制作用。 0088 由表5可知， 各组中鼠李糖乳杆菌CCF。

45、M1070的数量在经历了连续五天的定植之后， 达到了4105CFU/mL， 但是随着变异链球菌和白色念珠菌的加入， 预防组鼠李糖乳杆菌 CCFM1070的数量就降为2104CFU/mL(P0.05)， 这可能是变异链球菌和白色念珠菌与鼠李 糖乳杆菌在口腔中竞争的结果， 后期， 预防组鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量稳定在了2 104CFU/mL左右； 干预组鼠李糖乳杆菌CCFM1070的数量也经历了一个波动， 但间断性的干预 一直保持在4104CFU/mL。 0089 综上， 鼠李糖乳杆菌CCFM1070可以在口腔中定植较好， 保持定期摄入可以更好的 维持鼠李糖乳杆菌CCFM1070在口腔中。

46、的水平， 并且， 鼠李糖乳杆菌CCFM1070对变异链球菌 和白色念珠菌的预防和干预效果都强于洗必泰。 0090 3、 鼠李糖乳杆菌对龋齿大鼠牙齿脱矿情况的影响 0091 实验结束后， 所有大鼠的下颌骨均用微计算机断层扫描(Micro CT)系统(Quantum Gx2； Perkinelmer， Hopkinton， MA， USA)成像； 参数： 90kv， 88 A； 视野范围： 18 m； 采集时间： 4min； 相机模式： 高分辨率。 将每个样本旋转360 并将所有图像导入Analyze 12.0软件 (AnalyzeDirect， Overland Park， KS， USA)， 。

47、分别重建下颌骨的三维图像进行分析。 以固定 阈值将牙釉质与整个下颌骨分离并计算牙釉质的体积。 各组三维重建视图和剖面图以及釉 质分离图见图3， 各组釉质体积变化见图4。 0092 如图3， 从完整的3D重建的牙体硬组织中可以明显看到模型组的龋损部位以及剥 离的釉质的缺失情况， 相比之下， 空白对照组无龋损， 且釉质完整， 两组对照符合预期； 比较 干预组和预防组， 发现洗必泰预防组能从图上看到明显的龋损部位， 而洗必泰干预组、 CCFM1070干预和CCFM1070预防组则相对看不出特别明显的龋损部位， 从剖面图看龋损深度 也较浅。 0093 如图4， 根据剥离的釉质计算釉质体积来直观呈现釉质。

48、的龋损情况， 模型组的釉质 体积显著小于空白组体积(P0.05)， 但都显著大于模型组(P鼠李糖乳杆菌CCMFM1070预防洗必泰干预洗必泰预防。 0102 综上， 植物乳杆菌CCFM634在体内没有发挥出预防以及治疗龋齿的效果， 而鼠李糖 乳杆菌CCMFM1070在体内预防以及治疗龋齿的效果极佳。 说明书 9/13 页 11 CN 111518713 A 11 0103 表1大鼠实验分组情况 0104 0105 注： 致龋饲料Diet2000的主要成分如下： 全麦粉6， 蔗糖56， 精炼奶粉28， 苜 蓿叶粉3， 脱水全干粉1， 酵母4， 盐2。 0106 表2各组大鼠血清生化指标(s) 0。

49、107 0108 0109 注： a,b,c,d表示每个指标各组之间的显著性差异P0.05)。 0110 表3各组大鼠口腔变异链球菌的计数结果 0111 说明书 10/13 页 12 CN 111518713 A 12 0112 注： *表示实验组与对照组差异显著(P0.05) 0113 表4各组大鼠口腔白色念珠菌的计数结果 0114 0115 注： *表示实验组与对照组差异显著(P0.05) 0116 表5各组大鼠口腔乳杆菌(鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌)的计数结果 0117 0118 注： a,b,c表示各组之间显著性(P0.05) 0119 表6大鼠磨牙牙面单位总数分布 0120 0121 。

50、注： 1st 2nd 3rd分别表示大鼠第一、 二、 三磨牙； 大鼠第二磨牙包含一个近中邻面和 一个远中邻面。 0122 表7各组大鼠龋齿得分情况 说明书 11/13 页 13 CN 111518713 A 13 0123 0124 注： *表示与模型组差异显著(P0.05) 0125 实施例6： 鼠李糖乳杆菌的应用 0126 将实施例2获得的鼠李糖乳杆菌CCFM1070以占MRS培养基总质量10的接种量添 加至MRS培养基中， 于37培养12h， 控制发酵过程的pH为5.45.8， 获得发酵液； 终止发酵 后， 使得发酵液降温至20以下， 采用离心设备收集菌体， 获得菌泥； 将菌泥与冻干保护。